劉紅梅+胡尚連+盧學(xué)琴+曹穎+任鵬

摘要:以一年生青楊(Populus cathayana Rehd.)嫩莖為試材,利用RT-PCR技術(shù)克隆青楊CCoAOMT 基因,并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析?結(jié)果表明,該基因cDNA序列全長為747 bp,是一個(gè)編碼248個(gè)氨基酸的多肽,蛋白分子量為27.67 kD,等電點(diǎn)為5.19,將該基因命名為PcCCoAOMT,其編碼的蛋白質(zhì)為是親水性蛋白質(zhì);氨基酸序列和結(jié)構(gòu)分析表明,CCoAOMT有一個(gè)保守區(qū)域;系統(tǒng)進(jìn)化分析表明,PcCCoAOMT與毛果楊的PtCCoAOMT基因具有很高的同源性(87%),該基因功能可能與青楊木質(zhì)素的生物合成有關(guān)?

關(guān)鍵詞:青楊(Populus cathayana Rehd.);CCoAOMT 基因;克隆;生物信息學(xué)

中圖分類號(hào):S792.113;Q7文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):0439-8114(2014)11-2670-05

Cloning and Bioinformatics Analysis of CCoAOMT Gene in Populus cathayana Rehd.

LIU Hong-mei,HU Shang-lian,LU Xue-qin,CAO Ying,REN Peng

(College of Life Science and Engineering, Southwest University of Science and Technology, Mianyang 621010, Sichuan, China)

Abstract: Raw Populus cathayana Rehd. spear of one year was used to clone, the CCoAOMT gene with RT-PCR and its bioinformatics analysis was carried out. The cDNA sequence was 747 bp in length, encoding 248 amino acids. The molecular weight of protein encoded by the CCoAOMT gene was 27.94 kD. Its theoretical PI was 5.19. The CCoAOMT gene was named as PcCCoAOMT. The protein encoded by the CCoAOMT gene was hydrophilic protein. The results of amino acid sequence analysis showed that the protein encoding by PcCCoAOMT contained one conserved domain. Phylogenetic analysis showed that PcCCoAOMT gene had 87% similarity with the corresponding genes PtCCoAOMT in Populus trichocarpa. It may be involued in biosynthesis of poplar lignin.

Key words: Populus cathayana Rehd.;CCoAOMT gene;cloning;bioinformatics

基金項(xiàng)目:四川省“十二五”重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目(2011YZGG-10)

木質(zhì)素是植物體中重要的大分子有機(jī)物質(zhì),僅次于纖維素,在植物抗擊外來侵襲?抵御病害襲擊?維持正常生長等方面發(fā)揮著重要作用[1]?在制漿造紙過程中,需使用大量化學(xué)藥品脫除木質(zhì)素,主要是因?yàn)槔w維素的結(jié)晶度?聚合度以及環(huán)繞著纖維素與半纖維素締合的木質(zhì)素鞘所致,這不僅提高了造紙成本,更污染了環(huán)境[2]?隨著木質(zhì)素生物合成途徑研究的不斷深入以及相關(guān)基因的成功克隆,運(yùn)用基因工程等手段調(diào)控木質(zhì)素的生物合成,并將其用于改進(jìn)紙漿生產(chǎn)?生物燃料?飼料改性已成為可能[3]?

青楊(Populus cathayana Rehd.)主要產(chǎn)于我國東北?華北?西北和西南等地,耐干旱?耐鹽堿?生長速度快?在造紙業(yè)中,由于青楊的木材輕柔?質(zhì)地凈白?不容易腐爛且材質(zhì)密度適宜而成為重要的原料[4]?楊樹類植物雖然是造紙的好原料,但其木質(zhì)素含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于纖維素含量,通過克隆其木質(zhì)素和纖維素的相關(guān)基因,運(yùn)用基因工程的手段提高纖維素含量?降低木質(zhì)素含量將為造紙業(yè)帶來新的變革?

已有研究報(bào)道,在植物中已經(jīng)成功分離克隆了多個(gè)木質(zhì)素生物合成代謝的關(guān)鍵酶基因?其中的咖啡酰輔酶A甲基轉(zhuǎn)移酶基因(Caffeoyl-CoA3-O-methyl-transferase,CCoAOMT)是被成功克隆的一類基因[5]?CCoAOMT基因與加固細(xì)胞壁物質(zhì)的合成有關(guān),研究證實(shí)在含有CCoAOMT基因RNAi的植物中,Klason木質(zhì)素合成量有不同程度的下降,且G/S比例降低[6]?因此,CCoAOMT基因的研究對木質(zhì)素含量的降低有重要意義?目前,從綠竹[6]?擬南芥[7]?水稻[8]?煙草[9]?玉米[10]等植物中已經(jīng)獲取了CCoAOMT 基因?本研究以青楊嫩莖為試驗(yàn)材料,采用同源技術(shù)克隆獲得CCoAOMT全長基因,并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析,以期能調(diào)控此基因從而降低木質(zhì)素含量?

1材料與方法

1.1材料

2013年2月29日以西南科技大學(xué)后山苗圃園采集的青楊嫩莖為試驗(yàn)材料,將其迅速用液氮處理,置于-80 ℃保存?zhèn)溆?以從美國引進(jìn)的毛果楊(Populus trichocarpa)?我國推廣的產(chǎn)業(yè)化最好的銀腺雜交楊(Populus alba×Populus glandulosa)和廣泛分布的山楊(Populus davidiana)作為信息學(xué)比較材料?

1.2主要試劑與菌種

天根植物總RNA提取試劑盒購自成都博瑞克生物技術(shù)有限公司;LA-Taq聚合酶?DL2000 DNA Marker?X-Gal?IPTG?PMD19-T Vctor?PrimerScript RT reagent Kit perferct real Time反轉(zhuǎn)錄試劑盒?EcoRⅠ?HindⅢ限制性內(nèi)切酶,均購自大連TaKaRa公司;大腸桿菌DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存?

1.3方法

1.3.1總RNA的提取與cDNA鏈的合成青楊嫩莖總RNA參照總RNA提取試劑盒的說明書提取,電泳后,在凝膠成像儀上進(jìn)行觀察并拍照?選取質(zhì)量較高的RNA,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒,以O(shè)ligo(dT)18為引物,用PrimeScript RT reagent Kit perferct real Time試劑盒進(jìn)行cDNA的合成?

1.3.2青楊 CCoAOMT 編碼區(qū)序列的獲得使用軟件Primer Premier 5.0根據(jù)GenBank上搜索獲得的其他品種楊樹 CCoAOMT 的核苷酸序列,設(shè)計(jì)青楊 CCoAOMT 基因的全長克隆引物,上游引物(P1) 5′-ATGGCCACCAATGGAGAGGAACAGC-3′,下游引物(P2) 5′-TCAGATCCGACGGCAGAGAGTG-3′?以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板,采用LA-Taq DNA聚合酶進(jìn)行CCoAOMT全長序列擴(kuò)增?PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性30 s;56.5 ℃復(fù)性30 s;72 ℃延伸2 min;30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min;最后4 ℃結(jié)束?PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD19-T Vector進(jìn)行連接,轉(zhuǎn)化后進(jìn)行藍(lán)白斑篩選,提質(zhì)粒,酶切驗(yàn)證并送至上海英俊生物技術(shù)有限公司測序?

1.4青楊CCoAOMT 基因全長序列的生物信息學(xué)分析

1.4.14種楊樹CCoAOMT 基因編碼的氨基酸多序列比對分析青楊CCoAOMT 基因的全長序列,使用了DNAMAN和Clustal W軟件,并將其編碼的氨基酸序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得的毛果楊?山楊?銀腺雜交楊的全長CCoAOMT基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行比對分析?

1.4.2CCoAOMT 基因系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建利用Mega 4.1軟件對青楊 CCoAOMT 基因和NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得的其他物種的CCoAOMT 基因的全長序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建?對青楊?毛果楊(Populus trichocarpa,登錄號(hào)XP00231325.1,下同)?銀腺雜交楊(Populus alba×Populus glandulosa,AAK1671401)?陸地棉(Gossypium hirsutum,ACF48821.1)?紅麻(Hibiscus cannabinus,AFN85667)?枇杷(Eriobotrya japonica,AFZ76980)?白樺(Betula platyphylla,AAW

55668.1)?金雞納樹(Cinchona officinalis,AAT37172.

1)?構(gòu)樹(Broussonetia papyrifera,AAS91565.1)?圓果桉(Eucalyptus pilularis,BAM05558.1)?中?？Х?Coffea canephora,ABO77959.1)?輪葉黨參(Codonopsis lancedata,BAE48788.1)?茶樹(Camellia sinensis,AFY97680.1)相關(guān)數(shù)據(jù)采取Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹?用Bootstrap對生成的系統(tǒng)進(jìn)化樹校正,生成完整的系統(tǒng)進(jìn)化樹?

1.4.3CCoAOMT 編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析對CCoAOMT 基因進(jìn)行理化性質(zhì)分析?一般采用ORF-finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)在線程序分析其開放閱讀框,再采用ExPaSy工具(http://au.expasy.org/tools/)中提供的Prot-Param軟件在線分析該基因編碼的氨基酸的物理化學(xué)參數(shù)?組成?理論等電點(diǎn)和親水性?

1.4.4CCoAOMT 編碼蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析分析基因編碼的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu),主要包括α-螺旋(α-helix,H)?β-轉(zhuǎn)角(β-turn,T)?延伸鏈(Extended strand,E)及無規(guī)則卷曲(Random coil,C)等相關(guān)數(shù)量,利用ExPaSy工具(www.expasy.ch/tools/)中的SOPMA軟件在線預(yù)測分析4種楊樹基因編碼的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)?

1.4.5CCoAOMT 編碼蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)分析基因編碼的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測主要有3種方式,分別為同源模建?折疊識(shí)別和從頭預(yù)測法[11,12]?利用ExPaSy工具中的CPHmodels程序在線對4種楊樹進(jìn)行同源模建,再利用RasMol預(yù)測軟件對預(yù)測的 CCoAOMT 基因編碼的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析?

2結(jié)果與分析

2.1青楊 CCoAOMT 基因全長克隆及其編碼的氨基酸序列分析

利用RT-PCR技術(shù)克隆得到青楊的 CCoAOMT 基因(圖1a),全長為747 bp(圖1b),通過ORF-finder軟件分析青楊 CCoAOMT 基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列,得到一個(gè)編碼248個(gè)氨基酸的多肽,命名為PcCCoAOMT?利用NCBI的Blastp軟件進(jìn)行保守區(qū)查找,分析可獲得序列的保守區(qū)結(jié)構(gòu)域?結(jié)果(圖1c)表明,PcCCoAOMT有一個(gè)AdoMet_ MTases super family保守區(qū)域,證明了青楊CCoAOMT保守區(qū)基因編碼的蛋白質(zhì)屬于編碼S-腺苷甲硫氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因家族 ?

2.24種楊樹 CCoAOMT 基因編碼的氨基酸多序列比對

序列比對結(jié)果(圖2)表明,PcCCoAOMT基因與毛果楊?山楊和銀腺雜交楊CCoAOMT基因編碼的氨基酸有高度的同源性,與青楊氨基酸同源性最高的為毛果楊?青楊CCoAOMT編碼的氨基酸比后三者編碼的氨基酸多2個(gè)連著的苯丙氨酸(F)和天冬酰胺(N),但在最后的位點(diǎn)上發(fā)生了一個(gè)谷氨酰胺(Q)的缺失?銀腺雜交楊CCoAOMT編碼的氨基酸與青楊?毛果楊和山楊CCoAOMT編碼的氨基酸比較有8個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了變異:賴氨酸(K)→谷氨酸(E)?谷氨酰胺(Q)→谷氨酸(E)?丙氨酸(A)→未知氨基酸(X)?天冬氨酸(D)→谷氨酸(E)?半胱氨酸(C)→酪氨酸(Y)?苯丙氨酸(F)→酪氨酸(Y)?天冬氨酸(D)→賴氨酸(K)?脯氨酸(P)→絲氨酸(S)?

2.3CCoAOMT 基因系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

利用Mega 4.1軟件構(gòu)建青楊 CCoAOMT 基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)?青楊(P.cathayana)?毛果楊(Populus trichocarpa,XP00231325.1)?銀腺雜交楊(Populus alba×Populus glandulosa,AAK1671401)?陸地棉Gossypium hirsutum,ACF48821.1)?紅麻(Hibiscus cannabinus,AFN85667)?枇杷(Eriobotrya japonica,AFZ76980)和白樺(Betula platyphylla,AAW55668.1)聚為一個(gè)類群?表明這些物種CCoAOMT基因之間的親緣性較近,其中青楊?毛果楊的CCoAOMT基因親緣性最近,其他次之?青楊與茶樹(Camellia sinensis,AFY97680.1)?輪葉黨參(Codonopsis lancedata,BAE48788.1)?中?？Х?Coffea canephora,ABO77959.1)的親緣性等較遠(yuǎn)?推測青楊 PcCCoAOMT與毛果楊 CCoAOMT 的功能相近?

2.4青楊 CCoAOMT 基因編碼蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

青楊?毛果楊?山楊以及銀腺雜交楊均屬于楊屬楊柳科?從表1可知,青楊CCoAOMT的編碼區(qū)比其他3種楊樹的編碼區(qū)多3個(gè)密碼子,其編碼的氨基酸比其他3種楊樹多1個(gè)?4種楊樹分子量差別不大,銀腺雜交楊酸性殘基數(shù)比青楊?毛果楊和山楊多1個(gè);相對堿性殘基,青楊比其他3種楊樹少1個(gè)?對于理論等電點(diǎn),毛果楊和山楊相同,但比其他2種楊樹略高?青楊的總親水性平均系數(shù)為-0.232?青楊PcCCoAOMT的理化性質(zhì)與毛果楊PtCCoAOMT和山楊PdCCoAOMT基因的更接近?4種楊樹的CCoAOMT基因編碼的蛋白分子量在27.81~27.94 kD,酸性殘基明顯多于堿性殘基,這表明4種楊樹的蛋白質(zhì)均表現(xiàn)為酸性蛋白質(zhì)?

2.4青楊 CCoAOMT 基因編碼蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

利用SOPMA軟件預(yù)測4種楊樹CCoAOMT編碼蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu),結(jié)果見表2?由表2可知,青楊?毛果楊?山楊以及銀腺雜交楊的CCoAOMT編碼蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)中含有豐富的α-螺旋和無規(guī)卷曲,較多的延伸鏈以及少量的β-轉(zhuǎn)角,預(yù)測青楊CCoAOMT編碼蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的α-螺旋比毛果楊?山楊和銀腺雜交楊分別少6?8?3個(gè);β-轉(zhuǎn)角比毛果楊?山楊和銀腺雜交楊分別少3?1?4個(gè);青楊和毛果楊延伸鏈一樣多,兩者均比山楊少3個(gè),比銀腺雜交楊少1個(gè);無規(guī)則卷曲青楊多于其他3種楊樹,山楊的最少?4種楊樹的CCoAOMT編碼蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)整體表現(xiàn)差別不明顯,推測4種楊樹的CCoAOMT蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)有很高的相似性?

2.5青楊CCoAOMT基因編碼蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

利用CPHmodels程序?qū)?種楊樹進(jìn)行CCoAOMT結(jié)構(gòu)的三維建模,預(yù)測CCoAOMT基因編碼蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu),預(yù)測結(jié)果見圖4?由圖4可知,青楊?毛果楊和山楊的CCoAOMT基因編碼蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)相似,均含有豐富的α-螺旋和無規(guī)卷曲,還有少量的延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角;青楊?毛果楊?山楊與銀腺雜交楊的構(gòu)象明顯不同,因?yàn)殂y腺雜交楊為雜交楊結(jié)構(gòu),明顯比前三者復(fù)雜?

3結(jié)論與討論

目前研究表明,木質(zhì)素的生物合成受一系列酶的調(diào)控催化,木質(zhì)素由S-?G-和H-木質(zhì)素3類單體聚合而成酚類多聚體[13]?CCoAOMT基因?qū)ζ渲械腉型木質(zhì)素合成有特異調(diào)節(jié)作用,編碼的蛋白質(zhì)是合成木質(zhì)素有關(guān)的酶中比較原始的酶[14],催化木質(zhì)素生物合成過程中的對-香豆酰莽草酸/奎寧酸(p-coumaroyl shikimate/quinate)C3位置的羥基化反應(yīng),且CCoAOMT是木質(zhì)素基因工程改良應(yīng)用方面研究的主效基因之一[15]?

本研究利用同源克隆技術(shù),獲得青楊CCoAOMT基因全長序列(命名為 PcCCoAOMT)?該序列長747 bp ,編碼248個(gè)氨基酸?CCoAOMT的氨基酸序列中有一個(gè)保守區(qū)結(jié)構(gòu)域?在系統(tǒng)發(fā)育樹中,青楊CCoAOMT全長基因序列與毛果楊?銀腺雜交楊?紅麻?陸地棉等聚為一個(gè)類群,可以看出CCoAOMT屬于編碼S-腺苷甲硫氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因家族?PcCCoAOMT編碼的蛋白質(zhì)酸性殘基多于堿性殘基,故此蛋白質(zhì)為酸性蛋白質(zhì),其二級(jí)結(jié)構(gòu)含有豐富的α-螺旋和無規(guī)卷曲?較多的延伸鏈以及較少的β-轉(zhuǎn)角?該基因的分離和克隆為青楊通過基因工程進(jìn)行遺傳改良奠定了基礎(chǔ)?

參考文獻(xiàn):

[1] 魏建華,宋艷茹.木質(zhì)素生物合成途徑及調(diào)控的研究進(jìn)展[J].植物學(xué)報(bào),2001,43(8):771-779.

[2] 吳 坤,張世敏,朱顯峰.木質(zhì)素生物降解研究進(jìn)展[J]. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2000,12,34(4):349-354.

[3] VANHOLME R,MORREEL K,RALPH J,et al.Lignin engineering[J].Current Opinion in Plant Biology,2008,11(3):278-285.

[4] 蘇曉華,黃秦軍,張香華,等.中國大青楊基因資源研究[J].林業(yè)科學(xué)研究,2001,14(5):472-478.

[5] 陳建榮,郭清泉,張學(xué)文. 苧麻 CCoAOMT 基因全長 cDNA 克隆與序列分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,39(5):1058-1063.

[6] 李雪平,高志民,彭鎮(zhèn)華.綠竹咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆與分析[J].分子植物育種, 2008,6(3):587-592.

[7] DO C T,POLLET B,THEVENIN J, et al. Both caffeoyl coenzyme A3-O-methyltransferase 1 and caffeic acid O-methyltransferase 1 are involved in redundant functions for lignin, flavonoids and sinapoyl malate biosynthesis in Arabidopsis[J].Planta, 2007,226(5):1117-1129.

[8] ZHAO H Y, SHENG Q X, LU S Y, et al. Characterization of three rice CCoAOMT genes[J].Chinese Science Bulletin,2004,49(15):1602-1606.

[9] MAURY S, GEOFFROY P,LEGRAND M. Tobacco O-methyltransferases involved in phenylpropanoid metabolism. The different caffeoyl-coenzyme A/ 5-hydroxyferuloyl-coenzyme A 3/ 5-O-methyltransferase and caffeic acid/ 5-hydroxyferulic acid 3/5-O-methyltransferase classes have distinct substrate specificities and expression patterns[J]. Plant Physiol,1999,121(1): 215-224.

[10] CIVARDI L, RIGAU J, PUIGDOMENECH P. Nucleotide sequence of two cDNAs coding for Caffeoyl-coenzyme A O-methyltransferase( CCoAOMT ) and study of their expression in Zea mays[J]. Plant Physiol, 1999, 120(4):1206-1211.

[11] BHALLA U S,LYENGAR R. Emergent properties of networks of biological signaling pathways[J]. Science,1999,283(5400):381-387.

[12] 周建紅,艾觀華,方慧生,等. 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)從頭預(yù)測方法研究進(jìn)展[J].生物信息學(xué),2011,9(1):1-5.

[13] 常瑞娜,汪杏芬,陳鴻鵬. 五節(jié)芒CCoAOMT 和4CL的克隆和表達(dá)分析[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),2012,27(4):29-35.

[14] 章霄云,郭安平,賀立卡.木質(zhì)素生物合成及其基因調(diào)控的研究進(jìn)展[J].分子植物育種,2006,4(3):431-437.

[15] 蔣向輝,余朝文,許棟,等.杉木CCoAOMT基因部分cDNA克隆與序列分析[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào),2009,29(6):24-28.