高艷，岳靜，黃顯會(huì)，曾振靈

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，國(guó)家獸藥殘留基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510642)

林可霉素-大觀(guān)霉素注射液在豬體內(nèi)的殘留消除研究

高艷，岳靜，黃顯會(huì)，曾振靈

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，國(guó)家獸藥殘留基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510642)

【目的】對(duì)一種鹽酸林可霉素-硫酸大觀(guān)霉素注射液在豬組織中的殘留消除進(jìn)行研究，并制訂該制劑在豬體內(nèi)的休藥期.【方法】常規(guī)飼養(yǎng)條件下，將30頭健康豬隨機(jī)分為6組，按豬體質(zhì)量以15 mg/kg(即林可霉素5 mg/kg和大觀(guān)霉素10 mg/kg)劑量頸部肌內(nèi)注射鹽酸林可霉素-硫酸大觀(guān)霉素注射液，每天1次，連用5 d，于最后一次給藥后8、24、72、144、240、336 h各宰殺1組豬，分別采集每頭豬的肌肉、肝臟、腎臟、脂肪和注射位點(diǎn)5種組織，采用LC-MS/MS法和HPLC-UV法分別對(duì)林可霉素和大觀(guān)霉素進(jìn)行殘留量測(cè)定.【結(jié)果和結(jié)論】林可霉素在豬組織中消除較快，大觀(guān)霉素消除較慢，給藥后第6天所有檢測(cè)組織中的林可霉素和大觀(guān)霉素已全部低于最高殘留限量，林可霉素和大觀(guān)霉素在豬體內(nèi)各組織器官的殘留濃度大小順序均為：腎臟＞肝臟＞注射部位＞肌肉＞脂肪，表明腎臟是二者的靶組織.結(jié)合農(nóng)業(yè)部規(guī)定的林可霉素、大觀(guān)霉素在豬體內(nèi)的最高殘留限量和WT1.4休藥期軟件計(jì)算結(jié)果，建議該制劑在豬體內(nèi)的休藥期為8 d.

殘留;豬;林可霉素;大觀(guān)霉素

林可霉素為林可胺類(lèi)抗生素，主要抗革蘭陽(yáng)性菌，大觀(guān)霉素為氨基糖苷類(lèi)抗生素，主要抗革蘭陰性菌，兩者聯(lián)用可從不同環(huán)節(jié)阻礙細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，具有較好的協(xié)同作用.林可霉素與大觀(guān)霉素配伍常用于防治豬沙門(mén)菌病、支原體肺炎和敏感菌引起的母豬乳腺炎-子宮炎-無(wú)乳綜合癥等疾病，臨床上還可用于治療豬密螺旋體性痢疾［1］.隨著該復(fù)方制劑在畜牧業(yè)中的廣泛使用，不可避免地引起動(dòng)物組織或其產(chǎn)品中藥物的滯留或蓄積，不僅影響了動(dòng)物性產(chǎn)品的生產(chǎn)加工，而且還會(huì)以殘留的方式進(jìn)入人體和生態(tài)系統(tǒng)，嚴(yán)重影響消費(fèi)者的身體健康［2］.本文對(duì)一種鹽酸林可霉素-硫酸大觀(guān)霉素注射液在豬組織中的殘留消除進(jìn)行研究，旨在為臨床上合理使用該制劑提供理論依據(jù)和指導(dǎo)，并為制訂該制劑在豬體內(nèi)的休藥期和正確執(zhí)行休藥期的規(guī)定提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 主要藥品與試劑

15 %鹽酸林可霉素-硫酸大觀(guān)霉素注射液(其中含林可霉素50 mg/mL，大觀(guān)霉素100 mg/mL)，批號(hào)120614，由上海公誼獸藥廠(chǎng)提供.Bond Elut C18固相萃取小柱(6 mL，500 mg)，美國(guó)安捷倫公司.甲醇(色譜純)，乙腈(色譜純)，正己烷(分析純)，二氯甲烷(分析純)等.水為符合GB/T 6682規(guī)定的二級(jí)水.

1.2 主要溶液配制

提取液：稱(chēng)取磷酸二氫鉀1.36 g，加水溶解并稀釋至1 000 mL，磷酸調(diào)節(jié)pH至4.0，加入三氯乙酸20 g溶解即得.

十二烷基磺酸鈉溶液：稱(chēng)取十二烷基磺酸鈉2.78 g，加水溶解并稀釋至50 mL，靜置24 h后備用.

十二烷基磺酸鈉緩沖液：稱(chēng)取十二烷基磺酸鈉2.78 g，用水溶解，加入乙酸1 mL，并用水稀釋至500 mL.

1.3 儀器

美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司API4000型串聯(lián)質(zhì)譜儀(配ESI離子源).戴安UltiMate 3000高效液相色譜儀(配四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱等).德國(guó)Eppendorf公司高速離心機(jī).色譜柱：Hypersil BDS C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)，大連伊利特分析儀器有限公司.超聲機(jī)：HS10260D型，BENCHTOP公司.

1.4 動(dòng)物試驗(yàn)流程

32 頭健康豬，其中，2頭為空白對(duì)照，其余的隨機(jī)分為6組.按豬體質(zhì)量以15 mg/kg(林可霉素5 mg/kg和大觀(guān)霉素10 mg/kg)劑量頸部肌內(nèi)注射鹽酸林可霉素-硫酸大觀(guān)霉素注射液，每天給藥1次，連續(xù)給藥5 d，分別在給藥后第8、24、72、144、240、336小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)各宰殺1組豬，采集肌肉、肝臟、腎臟、脂肪及注射位點(diǎn)等5種組織，做好標(biāo)記、包裝，保存于-20℃冰箱，待測(cè).

1.5 組織樣品前處理

1.5.1 含林可霉素的樣品前處理準(zhǔn)確稱(chēng)取勻質(zhì)試樣(肌肉和脂肪各1 g，肝臟和腎臟各0.5 g)，置于15 mL離心管中，加入2 mL乙腈渦旋混勻，超聲10 min，振蕩10 min，于4℃條件下8 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液，殘?jiān)? mL乙腈重復(fù)提取1次，合并上清液，蒸餾水稀釋至10 mL.用4 mL正己烷除脂3次，8 000 r/min離心10 min，棄正己烷層，水層過(guò)0.22 μm濾膜，進(jìn)行LC-MS/MS測(cè)定.

1.5.2 含大觀(guān)霉素的樣品前處理含大觀(guān)霉素的樣品前處理過(guò)程包括提取、凈化和衍生化.其中，提取和凈化過(guò)程參照我國(guó)農(nóng)業(yè)部已頒布的動(dòng)物性食品中林可霉素和大觀(guān)霉素殘留檢測(cè)氣相色譜法(農(nóng)業(yè)部1163號(hào)公告-2-2009);衍生化過(guò)程如下：洗脫液用氮?dú)獯蹈?，?00 μL水復(fù)溶，加入400 μL體積分?jǐn)?shù)為6%的三氟乙酸-乙腈溶液和400 μL 5 mg/mL 2，4-二硝基苯肼-乙腈溶液，渦旋混勻，70℃衍生化1 h，取出，冰浴2 min，加入100 μL丙酮，混勻后于70℃加熱10 min終止反應(yīng)，冷卻至室溫，過(guò)0.22 μm濾膜，進(jìn)行HPLC測(cè)定.

1.6 檢測(cè)林可霉素和大觀(guān)霉素的色譜條件

1.6.1 檢測(cè)林可霉素的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件液相色譜條件：色譜柱：Hypersil GOLD C18(5 μm，150 mm×2.1 mm);流速：0.25 mL/min;柱溫：35℃;進(jìn)樣量：5.00 μL;流動(dòng)相：A為體積分?jǐn)?shù)0.1%的甲酸水溶液，B為乙腈;洗脫梯度：流動(dòng)相B的比例在1.5 min內(nèi)由4%線(xiàn)性提高到85%，然后保持4 min，再在0.5 min內(nèi)降至4%，柱平衡時(shí)間6 min.

質(zhì)譜條件：ESI+離子化模式;霧化氣壓力(GS1)：344 kPa;輔助氣壓力(GS2)：241 kPa;氣簾氣壓力(CUR)：68 kPa;噴霧電壓(IS)：5 500 V;離子源溫度：650℃.

1.6.2 檢測(cè)大觀(guān)霉素的高效液相色譜條件檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)500 nm;色譜柱：Hypersil BDS C18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm);流動(dòng)相：乙腈-四氫呋喃-水(體積比30∶35∶35);流速為1 mL/min;柱溫30℃;進(jìn)樣量：50 μL.

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

在本試驗(yàn)色譜條件下，林可霉素和大觀(guān)霉素與組織中其他組分分離良好，色譜峰峰形較佳，林可霉素在豬肌肉、肝臟、腎臟、脂肪中的檢測(cè)限為3 μg/kg，定量限為10 μg/kg，保留時(shí)間6.5 min左右，大觀(guān)霉素在各組織中的檢測(cè)限均為50 μg/kg，定量限為100 μg/kg，保留時(shí)間8.2 min左右.林可霉素在豬不同組織中的線(xiàn)性范圍為1～200 ng/mL，大觀(guān)霉素在豬不同組織中的線(xiàn)性范圍為0.1～10 μg/g，相關(guān)系數(shù)均在0.99以上，線(xiàn)性關(guān)系良好.林可霉素在豬不同組織中的回收率為70.00%～106.20%，批內(nèi)變異系數(shù)為3.57%～11.18%，批間變異系數(shù)為4.13%～10.42%.大觀(guān)霉素在豬不同組織中的回收率為85.64%～99.38%，批內(nèi)變異系數(shù)為3.12%～6.17%，批間變異系數(shù)為4.09%～7.19%.

2.2 組織中藥物殘留

將冷凍保存組織樣品自然解凍，依據(jù)上述建立的方法，對(duì)試驗(yàn)組豬在不同屠宰時(shí)間點(diǎn)采集的肌肉、肝臟、腎臟、脂肪及注射位點(diǎn)5種組織進(jìn)行測(cè)定，以測(cè)得的組織樣品藥物峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出藥物殘留量.結(jié)果見(jiàn)表1.

表1 豬肌注鹽酸林可霉素-硫酸大觀(guān)霉素注射液后組織中平均殘留量1)Tab.1 Mean residues in tissues after intramuscular administration of lincomycin hydrochloride-spectinomycin sulfate injection in pigs

2.3 數(shù)據(jù)處理

我國(guó)農(nóng)業(yè)部規(guī)定的林可霉素在豬組織中的最高殘留限量為肌肉、脂肪100 μg/kg，肝臟500 μg/kg，腎臟1 500 μg/kg;大觀(guān)霉素在豬組織中的最高殘留限量為肌肉500 μg/kg，脂肪、肝臟2 000 μg/kg，腎臟5 000 μg/kg.經(jīng)WT1.4休藥期軟件處理藥物濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)，計(jì)算得到林可霉素在各組織的休藥期分別為：肌肉24 h、肝臟24 h、腎臟61.69 h、注射位點(diǎn)為42.26 h、脂肪24 h;大觀(guān)霉素在豬各組織的休藥期分別為：肌肉34.61 h、肝臟54.44 h、腎臟176.62 h、注射位點(diǎn)為67.58 h、脂肪8 h.根據(jù)農(nóng)業(yè)部規(guī)定的最高殘留限量標(biāo)準(zhǔn)及上述分析結(jié)果，可知該制劑以15 mg/kg肌注(每天1次，連用5 d)時(shí)在豬體內(nèi)的休藥期為8 d.

3 討論與結(jié)論

3.1 檢測(cè)方法

先前報(bào)道的關(guān)于大觀(guān)霉素的檢測(cè)方法有高效液相色譜-電化學(xué)檢測(cè)法［3-5］，高效液相色譜-安培檢測(cè)法［6］，高效液相色譜-柱前/柱后衍生化法，薄層色譜分析法/密度測(cè)定法［7］，以及氣相色譜分析法［8-10］.本研究中，大觀(guān)霉素的檢測(cè)采用的是高效液相色譜柱前衍生化法，選取2，4-二硝基苯肼作為衍生化試劑，該試劑可與大觀(guān)霉素的羰基反應(yīng)生成苯腙化合物二硝基苯肼-大觀(guān)霉素［11］，衍生過(guò)程及衍生產(chǎn)物均比較穩(wěn)定.反應(yīng)需在酸性條件下進(jìn)行，故用三氟乙酸控制反應(yīng)過(guò)程中的酸性條件.已報(bào)道三氟乙酸-乙腈溶液的體積分?jǐn)?shù)有3%［12］和6%［11］，通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)體積分?jǐn)?shù)為6%的三氟乙酸-乙腈溶液作為酸性條件控制反應(yīng)過(guò)程時(shí)效果較好，因此本研究中大觀(guān)霉素的衍生化反應(yīng)采用體積分?jǐn)?shù)為6%的三氟乙酸-乙腈溶液.此外，也有報(bào)道采用反相高效液相色譜法測(cè)定林可霉素在腎臟、肝臟、肌肉和牛奶中的殘留［13］，離子對(duì)反相高效液相色譜法測(cè)定林可霉素在鮭魚(yú)肌肉和皮膚中的殘留［14］，但是這些方法都涉及到繁瑣的樣品提取及凈化程序.Sin等［13］報(bào)道了使用液相色譜電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定林可霉素在動(dòng)物組織和牛奶中的殘留，該方法準(zhǔn)確、精確、靈敏，且樣品制備過(guò)程簡(jiǎn)單.基于此，本研究依據(jù)實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際狀況對(duì)該方法進(jìn)行了優(yōu)化，用于測(cè)定林可霉素在豬組織的含量.

3.2 殘留消除及休藥期

林可霉素和大觀(guān)霉素在豬組織中均以腎臟的殘留量最高，其次是肝臟、注射位點(diǎn)、肌肉、脂肪，因此，腎臟是該2種藥物在豬體內(nèi)的靶組織.諸多對(duì)林可霉素在豬和雞體內(nèi)殘留和消除規(guī)律研究表明，林可霉素在肝臟和腎臟中的殘留量最高，其次為肌肉和脂肪;對(duì)大觀(guān)霉素在畜禽體組織殘留和消除規(guī)律研究表明，大觀(guān)霉素在腎臟的殘留量最高，其次為肝臟，肌肉和脂肪的殘留量較低.Hornish等［16］利用原子示蹤技術(shù)研究了給豬連續(xù)3 d飼喂含不同水平林可霉素的飼料，結(jié)果表明，林可霉素在肝臟及腎臟中的殘留量遠(yuǎn)高于肌肉和脂肪中，但其消除速度很快.Hornish等［16］對(duì)豬和肉雞的研究均證明，豬、雞組織中林可霉素的殘留量與飼料中林可霉素的濃度呈強(qiáng)線(xiàn)性相關(guān).因此，在實(shí)際應(yīng)用中，超量添加可導(dǎo)致林可霉素在動(dòng)物性食品中殘留超標(biāo).Bergwerff等［17］的研究也證實(shí)了腎臟中大觀(guān)霉素的殘留量最高.

獸藥使用指南規(guī)定鹽酸林可霉素硫酸大觀(guān)霉素可溶性粉和預(yù)混劑在豬體內(nèi)的休藥期為5 d［18］，但并未對(duì)復(fù)方注射液作出具體規(guī)定.根據(jù)農(nóng)業(yè)部規(guī)定的林可霉素和大觀(guān)霉素的最高殘留限量和WT1.4休藥期軟件的計(jì)算結(jié)果，建議該制劑按豬體質(zhì)量以15 mg/kg肌注(每天1次，連用5 d)時(shí)的休藥期為8 d.

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【責(zé)任編輯柴焰】

Residue depletion of lincomycin hydrochloride-spectinomycin sulfate injection in pigs

GAO Yan，YUE Jing，HUANG Xianhui，ZENG Zhenling
(National Reference Laboratory Veterinary Drug Residues，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China)

【Objective】The residue depletion of lincomycin hydrochloride-spectinomycin sulfate injection in pigs was investigated in this study，and its withdrawal time was estimated.【Method】In routine breeding conditions，thirty healthy pigs were randomly allocated to six treatment groups.All of them were treated with lincomycin hydrochloride-spectinomycin sulfate injection at a dosage of 15 mg/kg(5 mg lincomycin and 10 mg spectinomycin)once daily for 5 consecutive days.Five medicated pigs were slaughtered at 8，24，72，144，240 and 336 h after intramuscular administration，and muscle，liver，kidney，fat and injection site tissues were sampled.The tissue concentration of lincomycin and spectinomycin was analyzed respectively by liquid chromatography-mass spsectrometry(LC-MS/MS)and high-performance liquid chromatography(HPLC).【Result and conclusion】At 6 days postmedication，all observations of spectinomycin and lincomycin were below the corresponding MRLs.In all of the detected tissues，kidney had the highest drug concentration followed by liver，injection site，muscle and fat with the lowest drug concentration，indicating that kidney was target tissue for spectinomycin and lincomycin.Based on the MRLs，which were established by the Chinese Agriculture Ministry，the withdrawal time in pigs was analyzed by WT1.4 software.The results indicated that the withdrawal time of lincomycin hydrochloridespectinomycin sulfate injection should be 8 days after intramuscular administration of 15 mg/kg in pigs.

residue;pig;lincomycin;spectinomycin

S859.79

A

1001-411X(2014)01-0106-04

高艷，岳靜，黃顯會(huì)，等.林可霉素-大觀(guān)霉素注射液在豬體內(nèi)的殘留消除研究［J］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，35(1)：106-109.

2013-02-21優(yōu)先出版時(shí)間：2013-11-07

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http:∥www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.S.20131107.1500.006.html

高艷(1987—)，女，碩士研究生，E-mail:501876793@qq.com;通信作者:曾振靈(1963—)，男，教授，博士，E-mail:zlzeng@scau.edu.cn

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專(zhuān)項(xiàng)經(jīng)費(fèi)(201303038-5);廣東省農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目(2012NL018)