張浩 熊心猜 冉玉平 劉婷 陳玉娟

(1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚科，南充 637000;2.四川大學(xué)華西醫(yī)院皮膚科，成都 610041)

嗜脂性酵母馬拉色菌屬 (Malasseziaspp.)是人類及動物皮膚表面常駐菌群，幾乎在所有成人皮膚上都可以培養(yǎng)出來。作為一種條件致病菌，根據(jù)其rRNA基因序列，馬拉色菌屬的分類現(xiàn)已擴增至13個菌種，包括10個親人性嗜脂菌種:糠秕馬拉色 菌 (M.furfur)，合 軸 馬 拉 色 菌 (M.sympodialis)，球形馬拉色菌 (M.globosa)，斯洛菲馬拉色菌(M.slooffiae)，鈍形馬拉色菌(M.obtusa)，限制馬拉色菌 (M.restricta)，日本馬拉色菌 (M.japonica)，皮 膚 馬 拉 色 菌 (M.dermatis)，大和馬拉色菌 (M.yamatoensis)和娜拉馬拉色菌(M.nana)，以及3個親動物性菌種:厚皮馬拉色菌 (M.pachydermatis)，羊馬拉色菌(M.caprae)和馬馬拉色菌 (M.equina)［1-10］。我們對來源于東南亞部分國家青年人群的馬拉色菌菌種進行菌種鑒定，分析其構(gòu)成情況。

1 材料與方法

1.1 標本來源

標本采集于2011年和2012年秋季來我校留學(xué)的尼泊爾、巴基斯坦、印度青年留學(xué)生以及當年入學(xué)的中國大學(xué)新生，共285例。其中男168例，女117例，年齡18～26歲，平均20歲。在志愿者到校報到的1～2 d內(nèi)予以標本采集。

1.2 標本采集和培養(yǎng)

簽署知情同意書后，使用TregadermaTM無菌透明敷貼 (3 cm×7 cm)，采集正常志愿者皮脂溢出豐富區(qū)(額頭、左右面頰)或相關(guān)疾病 (花斑糠疹、脂溢性皮炎、痤瘡，均臨床診斷明確)患者皮損區(qū)鱗屑標本［11］。將敷貼置于Leeming＆Notman培養(yǎng)基(葡萄糖5 g，蛋白胨10 g，酵母浸膏0.1 g，牛膽鹽4 g，甘油 1 mL，單硬脂酸甘油酯 0.5 g，0.5 mL 吐溫60，1%10 mL 全脂牛奶，2% 橄欖油，瓊脂 14 g，0.05%氯霉素，0.05%放線菌酮，加蒸餾水至1 000 mL)中，32℃培養(yǎng)7～10 d，待菌落生長后挑取菌落進行劃線接種和分離培養(yǎng)。

1.3 標準菌株

選用目前人所攜帶的10種馬拉色菌標準株，分別為糠秕馬拉色菌 (M.furfurCBS1878)、合軸馬拉色菌 (M.sympodialisCBS7222)、厚皮馬拉色菌 (M.pachydermatisCBS1879)、限制馬拉色菌(M.restrictaCBS7877)、球 形 馬 拉 色 菌 (M.globosaCBS7966)、鈍形 馬拉 色 菌 (M.obtusaCBS7876)、斯 洛 菲 馬 拉 色 菌 (M.slooffiaeCBS7956)，大 和 馬 拉 色 菌 (M.yamatoensisM9985)、日本馬拉色菌 (M.japonicaM9966)、皮膚馬拉色菌 (M.dermatisM9927)。日本Sugita教授和韓國Ahn教授惠贈。

1.4 主要試劑

過氧化氫、吐溫20、吐溫40、吐溫60、吐溫80、氯霉素、放線菌酮 (Sigma Co.Ltd.，USA)，其余生化試劑購于常州新華活性材料研究所。

1.5 生化和形態(tài)學(xué)鑒定

我們根據(jù)既往的國外文獻報道［3，5-8，10，12-14］，總結(jié)了目前所有馬拉色菌屬各菌種的表型特征 (見表1)，并據(jù)之進行脂質(zhì)依賴試驗、溫度生長試驗、吐溫生長試驗、蓖麻油試驗、過氧化氫產(chǎn)氣試驗、β-葡萄糖苷酶試驗等鑒定菌種。

表1 馬拉色菌屬13個種的表型特征Tab.1 Phenotypic characteristics of all Malassezia species

1.6 質(zhì)量控制

以標準株作為對照。所有標本在劃線分離后均分為3份，1份于-70℃下備份，另兩份由兩人獨立操作，分別進行菌種鑒定并將結(jié)果相互印證，對結(jié)果出現(xiàn)差異的菌株，再次互相鑒定確認，直至結(jié)果相互吻合。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料

本次共收集了4個不同國家青少年人群 (中國185例;巴基斯坦32例;印度38例;尼泊爾30例)中馬拉色菌標本，共分離出501株馬拉色菌菌株。志愿者的基本資料見表2。

2.2 菌種鑒定

分離出的501株馬拉色菌屬中，鑒定出8個菌種，以球形馬拉色菌為主，共計203株，占40.5%(203/501)。其次依次為合軸馬拉色菌19.0%(95/501)、糠秕馬拉色菌 16.0%(80/501)、限制馬拉色菌11.0%(55/501)、斯洛菲馬拉色菌6.2%(31/501)等。各菌種分布情況見表3。

表2 臨床志愿者基本情況Tab.2 Information of clinical volunteers

表3 來源于四個東南亞國家人群的馬拉色菌屬菌種鑒定情況(株)Tab.3 Identification results of Malassezia species from 285 volunteers from four countries in Southeast Asia(strain)

3 討 論

對于馬拉色菌在人正常皮膚及各相關(guān)性疾病中的菌種分布，國內(nèi)外有很多培養(yǎng)鑒定報道，結(jié)果有的相似，也有的存在較大差異，如有報道正常皮膚菌群以糠秕、合軸馬拉色菌為主的，也有報道以球形馬拉色菌為主，在相關(guān)性疾病如花斑糠疹中，有報道以合軸馬拉色菌為主，也有報道以球形馬拉色菌為主。這些差異原因多被認為與地理環(huán)境有關(guān)［15-17］。但目前尚缺少一個全球性的馬拉色菌流行病學(xué)調(diào)查資料來證實這個觀點，而且目前的分子學(xué)技術(shù)應(yīng)用表明這些差異的原因很可能和常規(guī)的培養(yǎng)鑒定方法本身也有關(guān)系。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的分子學(xué)方法用于馬拉色菌菌種的鑒定。其中，不依賴培養(yǎng)的DNA直接提取鑒定法在馬拉色菌菌種鑒定及流行病學(xué)調(diào)查中展現(xiàn)其快速、準確的優(yōu)點。常用的鑒定方法是將培養(yǎng)基上培養(yǎng)出的菌落再行分離鑒定，其本身存在一定缺陷如結(jié)果判斷的主觀誤差、費時、容易污染等。馬拉色菌做為嗜脂性酵母，對培養(yǎng)的營養(yǎng)要求高，加之不同菌種的生長活性差異很大，容易造成培養(yǎng)中的假陰性，也不適用于全球流行病學(xué)調(diào)查及不同實驗室之間的數(shù)據(jù)共享及交流。我們首次在國內(nèi)應(yīng)用非培養(yǎng)法對脂溢性皮炎患者馬拉色菌菌種構(gòu)成進行了鑒定［11］，其結(jié)果與循證統(tǒng)計［18］和國外脂溢性皮炎人群的馬拉色菌菌種構(gòu)成報道［19-21］相似，都以球形和限制馬拉色菌為主。但非培養(yǎng)法鑒定不能分離出活體菌種，不能保存實體菌種以及用于后續(xù)的表型研究等，所以常規(guī)培養(yǎng)鑒定仍是非常重要、不可或缺的方法。

本研究在國內(nèi)首次對目前所有馬拉色菌菌種的生理生化鑒定特性進行了總結(jié)，并首次對東南亞部分國家青少年健康人群及馬拉色菌相關(guān)疾病患者的馬拉色菌菌種進行培養(yǎng)鑒定分析。為了盡量降低上述的常規(guī)培養(yǎng)鑒定法誤差，我們以標準株作為對照，并以兩人獨立操作進行質(zhì)量控制。其結(jié)果表明，來自四個東南亞國家青少年人群的馬拉色菌屬均以球形馬拉色菌為主，且無論是健康志愿者還是相關(guān)疾病患者，球形馬拉色菌均為主要菌種，且與患者的性別也沒有關(guān)系，這與我們以及國外進行的非培養(yǎng)馬拉色菌菌種鑒定結(jié)果一致［11，19-21］。在本實驗納入的四個東南亞國家中，優(yōu)勢菌種都為球形馬拉色菌、合軸馬拉色菌和糠秕馬拉色菌，并未見明顯的地理學(xué)差異，提示既往不同的培養(yǎng)鑒定研究報道的結(jié)果差異可能與培養(yǎng)方法本身有一定關(guān)系，故要求采取培養(yǎng)后表型鑒定法時一定要嚴格按方法進行操作，并最好兩人以上獨立操作后對照比較，以降低主觀誤差和假陰性率。當然，由于條件所限，本實驗納入的東南亞國家數(shù)以及相關(guān)人數(shù)均較少，結(jié)果具有一定提示意義，需要后續(xù)更大樣本量的研究來進一步證實。

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