董健健，程 楠，韓詠竹

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生部，安徽 合肥 230038；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)神經(jīng)病學(xué)研究所附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230061)

·實驗研究·

柚皮素-銅絡(luò)合物對Hep-G2細胞增殖與凋亡的影響

董健健1，程 楠2，韓詠竹2

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生部，安徽 合肥 230038；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)神經(jīng)病學(xué)研究所附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230061)

目的觀察柚皮素-銅絡(luò)合物在體外對人肝癌Hep-G2細胞增殖與凋亡的影響，探究其作用機制。方法將不同濃度柚皮素-銅絡(luò)合物作用于體外培養(yǎng)的Hep-G2細胞，采用甲基噻唑基四唑法檢測細胞生長抑制率；熒光顯微鏡下觀察柚皮素-銅絡(luò)合物對DAPI染色的Hep-G2細胞凋亡的影響；應(yīng)用流式細胞儀檢測凋亡率； Western blot法檢測細胞中Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達的變化。結(jié)果柚皮素-銅絡(luò)合物可顯著地抑制Hep-G2細胞增殖，且在一定的范圍內(nèi)呈濃度依賴性。熒光顯微鏡下觀察顯示，柚皮素-銅絡(luò)合物作用的Hep-G2細胞出現(xiàn)顯著的凋亡特征，呈劑量依賴性地增加細胞凋亡率。柚皮素-銅絡(luò)合物可上調(diào)Hep-G2細胞中Bax、Caspase-3蛋白的表達，抑制Bcl-2蛋白的表達，且呈一定的劑量依賴性。結(jié)論柚皮素-銅絡(luò)合物可抑制Hep-G2細胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，其作用機制可能與上調(diào)Bax、Caspase-3蛋白的表達，抑制Bcl-2蛋白的表達有關(guān)。

柚皮素-銅絡(luò)合物；Hep-G2細胞；細胞凋亡；Caspase-3；Bcl-2；Bax

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是臨床上最常見且病死率最高的腫瘤之一，全球發(fā)病率逐步增加。2012年，全世界新增78萬HCC患者，死亡病例多達74萬[1]。中國是全球肝癌發(fā)病率最高和病死數(shù)最多的國家，肝癌患者占全球的55%[2]。目前，臨床上使用的化學(xué)治療藥物療效均不理想，因此，尋找高效低毒的抗肝癌藥物已迫在眉睫。Wang BD等[3]合成了柚皮素希夫堿鑭(Ⅲ)配合物，并發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤活性。Deng S等[4]發(fā)現(xiàn)柚皮素對人乳腺癌細胞MCF-7的活性具有抑制作用。但關(guān)于柚皮素-銅絡(luò)合物的抗腫瘤活性僅有少量報道[5]。本實驗采用人HCC細胞株Hep-G2細胞為研究對象，探討柚皮素-銅絡(luò)合物對Hep-G2細胞的抑制作用及其機制，旨在為HCC的臨床治療提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 細胞 人HCC Hep-G2細胞：購自中國科學(xué)院上海細胞庫。

1.2 藥品及主要試劑 柚皮素-銅絡(luò)合物：由安徽中醫(yī)藥大學(xué)神經(jīng)病學(xué)研究所附屬醫(yī)院基礎(chǔ)實驗室合成；RPMI-1640培養(yǎng)基干粉：Gibco公司，批號 1464326；胎牛血清(fatal bovine serum, FBS)：杭州四季青生物工程公司，批號 140409；胰蛋白酶：Hyclone公司，批號 30042.01；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)：Sigma公司，批號 D9542；膜聯(lián)蛋白Ⅴ(Annexin Ⅴ，AV)-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)/碘化丙啶(propidium iodide，PI)細胞凋亡檢測試劑盒：貝博生物，批號 BB-4101-50T；甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)：Amresco公司，批號 0793；二甲基亞砜(dimethyl suiloxide，DMSO)：Amresco公司，批號 20120210；Bcl-2、Bax和Caspase-3抗體：博奧森公司，批號分別為BA0412、BA0315、bs-0081R；β-actin抗體：Cell Signaling公司，批號 P60709；山羊抗兔免疫球蛋白G(immunoglobulin G, IgG)：中杉金橋，批號 ZB-2301；其他試劑均為分析純。

1.3 主要儀器和設(shè)備 Olympus CKX41倒置顯微鏡：日本Olympus公司；96孔和6孔平底培養(yǎng)板：美國Corning costar公司；SPECTRA max M2e酶標(biāo)儀：美國Molecular Devices公司；MCO-175 CO2培養(yǎng)箱：日本三洋公司；JW2502電子分析天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；LD4-8型低速離心機：北京醫(yī)用離心機廠；FACS Calibur流式細胞儀：美國Becton Dickinson公司。

2 方法

2.1 柚皮素-銅絡(luò)合物合成 稱取0.054 4 g柚皮素，溶于10 mL無水乙醇，電磁攪拌，待大部分配體溶解后，滴加NH3·H2O(NH3·H2O∶CH3CH2OH=1∶1)調(diào)節(jié)配體溶液的pH值至7～8，邊攪拌邊將溶有0.020 4 g CuCl2·2H2O的5 mL無水乙醇溶液滴加到配體溶液中，溶液中很快產(chǎn)生綠色沉淀。室溫攪拌7 h，停止反應(yīng)。離心分離，用無水乙醇和蒸餾水反復(fù)洗滌沉淀，真空干燥后，得墨綠色固體[4]。所有配合物易溶于二甲基甲酰胺(dimethyiformamide, DMF)和DMSO，微溶于甲醇，不溶于水、丙酮、乙醚、氯仿、二氯化碳和乙酸乙酯等，在空氣中性質(zhì)穩(wěn)定。

2.2 細胞培養(yǎng) 將Hep-G2細胞接種于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基為RPMI 1640(含10% FBS、青霉素100 U/mL和鏈霉素100 U/mL、2.0 g的NaHCO3)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱，相對飽和濕度的條件下培養(yǎng)，細胞呈單純貼壁生長，隔日換液，待細胞長至80%～90%的密度，用胰酶/乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)消化傳代，每2～3 d傳代一次。

2.3 MTT法測柚皮素-銅絡(luò)合物對Hep-G2細胞增殖的抑制作用 Hep-G2細胞以每孔3×103個接種于96孔板，用含10% FBS的RPMI 1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，當(dāng)細胞長至30%的融合度時，換成RPMI 1640無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h后，實驗組分別加不同濃度的柚皮素-銅絡(luò)合物，柚皮素-銅絡(luò)合物終濃度分別為25、50、100、200、400 μmol/L，每組均設(shè)6個復(fù)孔，對照組加入完全培養(yǎng)基，每組均設(shè)6個復(fù)孔，在37 ℃、5% CO2中分別培養(yǎng)24 h后，每孔加5 mg/mL的MTT 20 μL，繼續(xù)孵育4 h，棄去培養(yǎng)液，加150 μL DMSO，振蕩至結(jié)晶充分溶解，用酶標(biāo)儀檢測490 nm處光密度值(optical density, OD)，以空白對照組調(diào)零，細胞存活率=實驗組OD490/空白對照組OD490×100%。實驗重復(fù)3次，計算平均半數(shù)抑制濃度(concentration of inhibition 50，IC50)。

2.4 DAPI染色檢測柚皮素-銅絡(luò)合物對Hep-G2細胞凋亡的影響 取對數(shù)生長期的Hep-G2細胞以每孔105個接種于6孔板中，培養(yǎng)過夜，棄上清液，分別加入含不同劑量柚皮素-銅絡(luò)合物藥液的完全培養(yǎng)基2 mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸出培養(yǎng)液，每孔加入1 mL DAPI染液，室溫下避光孵育10 min，棄染色液，用PBS洗3遍后于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.5 AV-FITC/PI雙染色法檢測細胞凋亡 培養(yǎng)24 h后收集細胞，按AV-FITC/PI凋亡試劑盒說明書操作，于1 h內(nèi)上流式細胞儀用Cell Quest軟件檢測并分析細胞凋亡的情況。

2.6 Western blot法檢測細胞中Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達的變化 取對數(shù)生長期的Hep-G2細胞接種于35 mm培養(yǎng)瓶中，待細胞長滿瓶底80%，棄培養(yǎng)液，分別加入含不同劑量柚皮素-銅絡(luò)合物藥液的完全培養(yǎng)基2 mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸出培養(yǎng)液，分別加入含不同劑量柚皮素-銅絡(luò)合物藥液的完全培養(yǎng)基(50、100、200 μmol/L)5 mL，對照組加入等體積培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后提取細胞總蛋白，Bradford法測定蛋白含量。取蛋白20 μg作電泳，將蛋白樣本轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜(nitrocellulose filter membrane， NC)上。濾膜用5%脫脂奶粉封閉4 h，磷酸鹽吐溫緩沖液(phosphate buffer saline with tween, PBST)洗3次，每次10 min。分別加入抗Bcl-2多克隆抗體(1∶300)，抗Bax多克隆抗體(1∶300)，抗Caspase-3多克隆抗體(1∶300)，4 ℃過夜。分別加入辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶1 000)，脫色搖床搖1.5 h，PBST洗3次，每次10 min。以β-actin作為內(nèi)參。凝膠成像系統(tǒng)拍照，并掃描分析各條帶的OD值，以β-actin的表達量為對照計算各組Bcl-2、Bax、Caspase-3的相對表達量。

3 結(jié)果

3.1 MTT檢測柚皮素-銅絡(luò)合物對Hep-G2細胞生長的抑制作用 柚皮素-銅絡(luò)合物在25～400 μmol/L劑量下作用于Hep-G2細胞24 h，結(jié)果顯示，柚皮素-銅絡(luò)合物具有明顯的細胞增殖抑制作用，且呈一定的量效依賴關(guān)系。柚皮素-銅絡(luò)合物作用Hep-G2細胞24 h的IC50為170.23 μmol/L。見圖1。

注：與0 μmol/L柚皮素-銅絡(luò)合物組比較，**P<0.01。

圖1 MTT法檢測不同劑量柚皮素-銅絡(luò)合物處理的Hep-G2細胞抑制率(n=3)

3.2 熒光顯微鏡觀察柚皮素-銅絡(luò)合物對Hep-G2細胞凋亡的影響 不同劑量柚皮素-銅絡(luò)合物作用Hep-G2細胞24 h后，倒置熒光顯微鏡下可見正常細胞核熒光表達均勻，而凋亡細胞呈現(xiàn)核濃縮，染色加深，或核染色質(zhì)呈新月形聚集于核膜一邊，或核碎裂成大小不等的圓形小體，隨著藥物濃度的增大，這種現(xiàn)象更加明顯。見圖2。

注：A.空白對照組；B. 50 μmol/L柚皮素-銅絡(luò)合物組；C. 100 μmol/L柚皮素-銅絡(luò)合物組；D. 200 μmol/L柚皮素-銅絡(luò)合物組；白色箭頭示凋亡細胞。

圖2不同劑量柚皮素-銅絡(luò)合物對Hep-G2細胞凋亡的影響(DAPI染色，10×20倍)

3.3 柚皮素-銅絡(luò)合物對Hep-G2細胞凋亡的影響 AV-FITC/PI雙染色法檢測結(jié)果顯示，經(jīng)柚皮素-銅絡(luò)合物處理24 h后，細胞凋亡率明顯增加，且呈明顯量效關(guān)系。見圖3。

注：A. 空白對照組；B. 50 μmol/L柚皮素-銅絡(luò)合物組；C. 100 μmol/L柚皮素-銅絡(luò)合物組；D. 200 μmol/L柚皮素-銅絡(luò)合物組。

圖3不同劑量柚皮素-銅絡(luò)合物對Hep-G2細胞凋亡率的影響

3.4 柚皮素-銅絡(luò)合物對Hep-G2細胞中Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達的影響 柚皮素-銅絡(luò)合物處理組與對照組比較，Bax、Caspase-3蛋白表達增加，而Bcl-2蛋白表達減少。采用Image J軟件對各目的條帶與內(nèi)參條帶進行灰度比較，并作柱狀圖，各組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，Bax、Caspase-3蛋白表達水平隨柚皮素-銅絡(luò)合物濃度增加而升高，而Bcl-2蛋白表達水平隨藥物增加而降低。見圖4。

4 討論

有關(guān)金屬絡(luò)合物抗腫瘤活性的報道可以追溯到16世紀(jì)，但直到1960年代無機金屬絡(luò)合物順鉑的抗腫瘤活性被發(fā)現(xiàn)后，有關(guān)金屬絡(luò)合物抗腫瘤作用的研究逐步展開。近年來，大量研究[6-8]證實了銅絡(luò)合物的抗腫瘤活性。本試驗所用的柚皮素-銅絡(luò)合物為新合成的物質(zhì)，有研究[5]已初步證實其具有抗腫瘤活性。

細胞凋亡在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[9]。本實驗首先通過MTT法研究發(fā)現(xiàn)，25～400 μmol/L柚皮素-銅絡(luò)合物對Hep-G2細胞具有明顯的增殖抑制作用，并呈顯著的量效關(guān)系。進一步采用DAPI染色發(fā)現(xiàn)，在一定的劑量范圍內(nèi)，隨著柚皮素-銅絡(luò)合物濃度增加，Hep-G2細胞呈現(xiàn)出明顯的凋亡特征。隨著藥物濃度的增加，細胞凋亡的比率逐漸上升且呈明顯的量效關(guān)系，提示誘導(dǎo)凋亡可能是柚皮素-銅絡(luò)合物抗腫瘤作用的機制之一。

細胞凋亡的發(fā)生途徑分為3種，即死亡受體依賴途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號途徑和線粒體依賴途徑。Bcl-2家族是細胞凋亡過程中起重要作用的一類蛋白。在線粒體上，Bcl-2家族蛋白通過與其他凋亡蛋白的協(xié)同作用，調(diào)控線粒體結(jié)構(gòu)與功能的穩(wěn)定性，發(fā)揮著調(diào)控細胞凋亡的作用[10-11]。Bcl-2家族包括兩類蛋白：一類是抑凋亡蛋白如Bcl-2，一類是促凋亡蛋白如Bax。Bcl-2和Bax均通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+參與的核內(nèi)外物質(zhì)轉(zhuǎn)運及膜通透性來控制細胞色素C的釋放，進而阻滯或誘導(dǎo)凋亡，Bcl-2/Bax比值可以決定細胞是否發(fā)生凋亡[12]。Caspase家族是一類半胱氨酸蛋白酶，在細胞凋亡過程中起著重要的作用。在細胞凋亡信號的刺激下，Bcl-2/Bax比值縮小，使線粒體外膜通透性增高，引起細胞色素C釋放到胞質(zhì)中，進而活化Caspase-3啟動凋亡[13]。本實驗結(jié)果表明，柚皮素-銅絡(luò)合物誘導(dǎo)細胞凋亡的作用可能與降低Bcl-2/Bax比值，啟動Caspase級聯(lián)反應(yīng)相關(guān)。

本實驗證實，柚皮素-銅絡(luò)合物在一定劑量范圍內(nèi)有抑制Hep-G2細胞增殖的作用，其誘導(dǎo)細胞凋亡的機制可能與通過上調(diào)Bax、Caspase-3蛋白表達，下調(diào)Bcl-2蛋白表達有關(guān)，但確切機制尚需進一步研究。

注：A. 空白對照組；B. 50 μmol/L柚皮素-銅絡(luò)合物組；C. 100 μmol/L柚皮素-銅絡(luò)合物組；D. 200 μmol/L柚皮素-銅絡(luò)合物組；與0 μmol/L柚皮素-銅絡(luò)合物比較，*P<0.05，**P<0.01。

圖4不同劑量柚皮素-銅絡(luò)合物對Hep-G2細胞Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達的影響(n=3)

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EffectsofNaringenin-CuComplexonProliferationandApoptosisofHep-G2Cells

DONGJian-jian1,CHENGNan2,HANYong-zhu2

(1.GraduateDivisionofAnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230038,China; 2.AffiliatedHospitalofNeurologyInstitute,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230061,China)

ObjectiveTo observe the effects of naringenin-Cu complex on the proliferation and apoptosis of human hepatocellular carcinoma HepG2 cellsinvitroand to investigate its action mechanism.MethodsHepG2 cells culturedinvitrowere treated with different concentrations of naringenin-Cu complex. MTT assay was used to determine the growth inhibition rate of HepG2 cells; the effect of naringenin-Cu complex on the apoptosis of HepG2 cells stained with 4′,6-diamidino-2-phenylindole was evaluated under a fluorescence microscope; the apoptosis rate of HepG2 cells was determined by flow cytometry; the expression of Bcl-2, Bax, and Caspase-3 in HepG2 cells was measured by Western blot.ResultsNaringenin-Cu complex significantly inhibited the proliferation of HepG2 cells in a dose-dependent manner (within a certain range of concentrations). The fluorescence microscopy showed that HepG2 cells treated with naringenin-Cu complex had marked apoptotic features, with the apoptosis rate increasing in a dose-dependent manner. Naringenin-Cu complex upregulated the expression of Bax and Caspase-3 in HepG2 cells but suppressed the expression of Bcl-2, with a certain dose dependence.ConclusionNaringenin-Cu complex can inhibit the proliferation of HepG2 cells and induce their apoptosis, possibly by upregulating the expression of Bax and Caspase-3 and suppressing the expression of Bcl-2.

naringenin-Cu complex; HepG2 cell; apoptosis; Caspase-3; Bcl-2; Bax

國家自然科學(xué)基金項目(81072738，81173212)

董健健(1989-)，女，碩士研究生

韓詠竹，hanyongzhutcm@aliyun.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.2095-7246.2014.06.016

2014-07-10)