楊志敏，葛 劍，王運(yùn)濤，楊翠軍，劉建成 ，王文濤

(1.張家口市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河北 張家口 075000； 2.河北北方學(xué)院，河北 張家口 075000；3.張家口學(xué)院，河北 張家口 075000)

隨著生物醫(yī)藥等學(xué)科的飛速發(fā)展，天然多糖以其抗氧化、促免疫、抗腫瘤、消炎、抗病毒及高效低毒等特性越來(lái)越引起人們的關(guān)注[1，2]。馬齒莧(Portulacaoleracea)為馬齒莧科植物馬齒莧的全草，含有氨基酸、維生素等多種營(yíng)養(yǎng)成分及L-去甲腎上腺素、多巴明、黃酮類(lèi)和多糖等生物活性物質(zhì)。馬齒莧多糖(Portulacaoleraceapolysaccharide，POP)是馬齒莧的主要有效成分之一，臨床研究認(rèn)為，POP具有抗腫瘤、抗氧化、降血脂以及免疫增強(qiáng)作用[3-11]。目前,有關(guān)POP在養(yǎng)殖業(yè)上的應(yīng)用研究較少，試驗(yàn)采用POP口腔灌注雛雞，觀(guān)察其對(duì)雛雞法氏囊免疫功能的影響，以期揭示POP免疫調(diào)節(jié)的機(jī)理，為馬齒莧多糖在畜禽養(yǎng)殖上的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

試驗(yàn)采用流式細(xì)胞儀(BD FACSAria，美國(guó))；試劑為淋巴細(xì)胞分離液，PE(苯腎上腺素)熒光標(biāo)記小鼠抗雞CD4、CD8抗體、碘化丙啶、ConA均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)用1日齡雛雞均由河北北方學(xué)院牧業(yè)研究所提供，3層籠養(yǎng)育雛，采用正大蛋雛雞料飼喂，自由采食和飲水。

1.3 馬齒莧多糖的提取

采新鮮馬齒莧全草，經(jīng)50 ℃烘干，粉碎，依次利用石油醚、80%乙醇脫去脂肪和小分子糖類(lèi)，利用水提取法提取POP，再利用95%乙醇沉淀，離心，依次用無(wú)水乙醇、丙酮洗滌，經(jīng)真空干燥制得馬齒莧粗多糖，利用苯酚硫酸法測(cè)定多糖含量。

1.4 動(dòng)物試驗(yàn)方法

選取1日齡健康蛋雛雞80只，隨機(jī)分為4組，分別為1個(gè)空白對(duì)照組(Ⅰ)和3個(gè)馬齒莧多糖試驗(yàn)組，即試驗(yàn)Ⅱ，Ⅲ和Ⅳ(POP劑量25，50和100 mg/kg)組，每組20只雞，馬齒莧多糖經(jīng)雛雞口腔灌服，每天1次，連續(xù)20 d，對(duì)照組灌服等量生理鹽水。試驗(yàn)雞飼喂相同基礎(chǔ)日糧，自由采食和飲水。

1.5 免疫功能檢測(cè)

試驗(yàn)結(jié)束后每組試驗(yàn)雞無(wú)菌采血，EDTA抗凝，分離淋巴細(xì)胞，加入熒光標(biāo)記的CD4、CD8抗體，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，Cell Quest軟件分析T淋巴細(xì)胞亞群百分率；取血后全部剖殺，并無(wú)菌摘取法氏囊，準(zhǔn)確稱(chēng)量濕重，計(jì)算法氏囊指數(shù)；隨后取適量法氏囊組織塊，利用機(jī)械法制備細(xì)胞樣品，即取組織塊在200目的銅網(wǎng)上搓，并用PBS向下沖洗細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，經(jīng)400目網(wǎng)過(guò)濾，PBS洗滌制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)，碘化丙啶綜合染液染色30 min，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，采用Medifit軟件分析處于靜止期(G0/G1期)、DNA合成期(S期)、分裂期(G2/M期)的細(xì)胞數(shù)量百分比，計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù)(PI)。

PI=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0進(jìn)行分析處理，不同劑量采用多重比較，差異P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 POP對(duì)雛雞外周血T淋巴細(xì)胞亞群及法氏囊指數(shù)的影響

不同濃度的POP作用于雛雞，均能不同程度地提高雛雞外周血中T淋巴細(xì)胞亞群細(xì)胞數(shù)量，并顯著提高雛雞法氏囊指數(shù)(P<0.05)(表1)。其中，CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量以50 mg/kg POP試驗(yàn)組最高為38.47%，顯著高于空白對(duì)照組及25 mg/kg組(P<0.05)，與100 mg/kg組差異不明顯(P>0.05)；CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量隨POP濃度的升高也有增加的趨勢(shì)，但不同濃度的POP組之間差異不顯著(P>0.05)；CD4+/CD8+以試驗(yàn)Ⅲ組最高，為1.98，顯著高于其他組(P<0.05)。法氏囊指數(shù)隨POP濃度升高呈先高后低趨勢(shì)，在50 mg/kg濃度上達(dá)到最高值。

表1 PDP對(duì)雛雞外周血T淋巴細(xì)胞亞群和法氏囊指數(shù)的影響

注：同行字母不同表示差異顯著(P<0.05)，字母相同表示差異不顯著(P>0.05)，下表同

2.2 POP對(duì)雛雞法氏囊淋巴細(xì)胞周期及增殖指數(shù)的影響

法氏囊淋巴細(xì)胞周期的變化隨POP用藥劑量的增加，G0/G1期細(xì)胞數(shù)量逐漸降低，均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，但不同濃度的POP試驗(yàn)組間差異不顯著(P>0.05)；S期細(xì)胞數(shù)隨POP濃度的升高逐漸增加，其中，100 mg/kg組達(dá)到最高，為8.20%，顯著高于其他組別；G2/M期細(xì)胞數(shù)量在50 mg/kg組達(dá)到最高值，為6.32%，顯著高于空白對(duì)照組及試驗(yàn)Ⅱ組(P<0.05)，與試驗(yàn)Ⅳ組差異不顯著(P>0.05)。其中，法氏囊內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量以G0/G1期為主，占85.97%～91.70%。法氏囊增殖指數(shù)(PI)以100 mg/kg組最高，顯著高于對(duì)照及試驗(yàn)Ⅱ組(P<0.05)，與50 mg/kg 組無(wú)明顯差異(P>0.05)。

表2 POP對(duì)雛雞法氏囊淋巴細(xì)胞周期及增殖指數(shù)的影響

3 討論與結(jié)論

有關(guān)馬齒莧多糖免疫活性的調(diào)節(jié)大多集中在小鼠上，對(duì)畜禽免疫能力的影響報(bào)道較少。研究結(jié)果表明，隨著馬齒莧多糖濃度增加，雛雞外周血中CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著增加，CD8+T淋巴細(xì)胞水平在不同濃度的POP組之間變化不明顯，CD4+/CD8+比值顯著增加。而T淋巴細(xì)胞直接參與機(jī)體的免疫應(yīng)答，當(dāng)機(jī)體受外界刺激，可使體內(nèi)T淋巴細(xì)胞的數(shù)量和免疫活性發(fā)生改變，尤其是CD4+T和CD8+T淋巴細(xì)胞水平，CD4+T淋巴細(xì)胞具有誘導(dǎo)和增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答的作用，CD8+T淋巴細(xì)胞主要介導(dǎo)細(xì)胞毒殺傷作用，在正常范圍內(nèi)，CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值升高提示提示正相免疫調(diào)節(jié)占優(yōu)勢(shì)。試驗(yàn)結(jié)果與李淑芳等[12]報(bào)道米糠多糖能夠提高健康雛雞外周血CD4+T淋巴細(xì)胞比率，對(duì)CD8+T淋巴細(xì)胞作用不明顯的結(jié)論相似。馬齒莧多糖可直接作用于T淋巴細(xì)胞，通過(guò)增加CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量，提高CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值，增強(qiáng)免疫力。

法氏囊是家禽的中樞免疫器官，測(cè)定法氏囊指數(shù)能反映機(jī)體的防御免疫功能。試驗(yàn)在不同濃度梯度的馬齒莧多糖均能提高雛雞法氏囊指數(shù)，與魏炳棟等[13]和王關(guān)林等[14]的研究結(jié)果相近，說(shuō)明適宜的多糖濃度能有效刺激法氏囊的發(fā)育，提高機(jī)體主動(dòng)免疫能力。

試驗(yàn)中，不同濃度梯度的POP均能增加法氏囊DNA合成期(S期)的淋巴細(xì)胞數(shù)量，不同程度地降低靜止期(G0/G1期)淋巴細(xì)胞數(shù)量，提高分裂期(G2/M期)的淋巴細(xì)胞數(shù)量，從而有效提升法氏囊淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)。這與劉華等[15]報(bào)道的防風(fēng)多糖能促進(jìn)小鼠淋巴細(xì)胞的增殖效果相似。試驗(yàn)POP可能通過(guò)提高細(xì)胞分裂和DNA合成，促進(jìn)淋巴器官發(fā)育，提高機(jī)體免疫功能。

馬齒莧多糖可提高雛雞外周血T淋巴細(xì)胞亞群CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量和CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值，顯著提高雛雞法氏囊指數(shù)，并通過(guò)提高法氏囊細(xì)胞分裂和DNA合成，促進(jìn)淋巴器官發(fā)育，提高機(jī)體免疫功能，為提高幼齡動(dòng)物免疫力，開(kāi)發(fā)綠色無(wú)公害飼料添加劑提供了參考依據(jù)。

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