劉雪飛

(白城醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，吉林 白城 137000)

乳腺癌是發(fā)生在乳腺上皮組織的惡性腫瘤，是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年提高。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)生異常時(shí)，將導(dǎo)致細(xì)胞快速增殖、無限生長(zhǎng)，最終形成腫瘤。胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGFs)在乳腺腺體發(fā)育和乳腺癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用。IGF-1可通過自分泌和旁分泌的方式參與正常乳腺上皮細(xì)胞、良性和惡性乳腺腫瘤細(xì)胞的促分裂、抗凋亡效應(yīng)，在乳腺病的形成過程中起重要作用〔1～4〕。木犀草素是從多種蔬菜、水果中分離出的一種天然黃酮類化合物。目前，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了木犀草素的抗腫瘤活性，其抗癌譜較廣，毒性很低，是較為理想的抗腫瘤藥物。本文旨在探討木犀草素應(yīng)用于乳腺癌臨床治療的可行性。

1 材料與方法

1.1材料和試劑 木犀草素購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，純度≥98%。MCF-7 細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)研究所細(xì)胞中心。小牛血清和RPMI1640培養(yǎng)基均購(gòu)自GIBCO 公司，胰蛋白酶購(gòu)自PAA公司。Trizol購(gòu)自Invintrigen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green試劑和DNA Marker均購(gòu)自Taraka公司。IGF-1引物及內(nèi)參照β-actin由北京華大基因有限公司合成。IGF-1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購(gòu)自Sigma公司。

1.2引物設(shè)計(jì) IGF-1正義序列為：5′-ATGAGTTCTGACACGGCGG-3′，反義序列為：5′-GTCGACCTAGGCACGGACGG-3′，擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度為210 bp。內(nèi)參照物：β-actin正義：5′-GGCGGCACCACCATGTACCCT-3′，反義：5′-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3′，擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度為202 bp。

1.3方法

1.3.1總RNA的提取 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)期MCF-7細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞傳代，先棄培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，然后加入適量的0.25%胰蛋白酶消化，消化后棄去胰酶，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基，制備單細(xì)胞懸液。調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104個(gè)/ml，以每孔4 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，加入終濃度分別為0、20、40、60、80、100 μmol/L的木犀草素溶液與細(xì)胞共同孵育24、48、72 h。棄去培養(yǎng)液，PBS洗2次，Trizol法提取細(xì)胞RNA，提取的RNA在-80℃冰箱內(nèi)凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2熒光定量PCR法檢測(cè)IGF-1的表達(dá) 根據(jù) TaqMan?PrimeScriptTMRT-PCR Kit Ⅱ說明書，以提取的 RNA 為模板，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。全過程在冰上進(jìn)行操作。反應(yīng)條件：37℃ 15 min；85℃ 5 s使反轉(zhuǎn)錄酶失活，5 s 后降溫至4℃。以不同反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，進(jìn)行熒光定量檢測(cè)。熒光定量 PCR 反應(yīng)體系為20 μl，SYBR?Premix Ex TaqTM10 μl，Rox 0.4 μl，引物2.0 μl，模板1.0 μl，水6.6 μl。反應(yīng)條件為95℃，30 s 95℃，5 s 55℃，33 s 40個(gè)循環(huán)；95℃ 15 s，55℃ 60 s，95℃ 15s。熒光定量PCR結(jié)果采用△△CT 法進(jìn)行分析，相對(duì)定量結(jié)果按 2-△△CT進(jìn)行計(jì)算。

1.3.3ELISA法檢測(cè)IGF-1的分泌 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞，以2×104個(gè)/孔接種于24孔板，培養(yǎng)24 h。無血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h后，加入含0、10、20、40 μmol/L木犀草素的無血清培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)6、12、24 h后，收集上清液，按照 IGF-1ELISA試劑盒操作要求，依次進(jìn)行加樣、孵育、洗滌，用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定上清液的光吸收值。用Curve Exert 1.3軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算IGF-1含量。IGF-1的檢測(cè)靈敏度為1.0 ng/ml。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 SPSS16.0軟件進(jìn)行分析。多樣本均數(shù)比較用單因素方差分析，兩樣本均數(shù)比較用t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1木犀草素對(duì)MCF-7細(xì)胞中IGF-1 mRNA水平變化的影響 MCF-7 細(xì)胞表達(dá)IGF-1。木犀草素能夠影響 MCF-7 細(xì)胞IGF-1的表達(dá)水平，且呈時(shí)間和劑量依賴關(guān)系。即隨著木犀草素濃度的增加，作用時(shí)間的延長(zhǎng)，IGF-1的相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.01)。見圖1。

圖1 IGF-1 mRNA 在木犀草素作用不同時(shí)間后MCF-7細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量

2.2木犀草素對(duì)MCF-7細(xì)胞中IGF-1含量的影響 MCF-7 細(xì)胞可向細(xì)胞培養(yǎng)基中分泌IGF-1。木犀草素能夠影響 MCF-7 細(xì)胞分泌 IGF-1，且呈時(shí)間和劑量依賴關(guān)系。40 μmol/L木犀草素作用于細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組相比，IGF-1含量顯著降低35.6%(P<0.05)。見表1。

表1 木犀草素對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)間MCF-7細(xì)胞中IGF-1含量的影響±s,ng/ml)

3 討 論

目前，分子靶向藥物是用于乳腺癌治療的研究熱點(diǎn)之一。由于化學(xué)藥物治療法和放射治療法對(duì)于患者存在很大的危險(xiǎn)性，各國(guó)學(xué)者正在尋找抗腫瘤效果好、安全性高、副作用小的天然的抗乳腺癌藥物。黃酮類藥物以其種類多、安全性強(qiáng)、抗腫瘤譜廣泛、抗腫瘤細(xì)胞增殖作用效果明顯、毒副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)，成為國(guó)內(nèi)外篩選抗腫瘤藥物的重要資源之一。木犀草素是從天然藥物、蔬菜果實(shí)中分離得到的一種有較強(qiáng)抗腫瘤活性的天然黃酮類化合物，具有廣譜抗腫瘤活性。

木犀草素分布廣泛于自然界中，可從金銀花、菊花等多種天然藥物和芹菜、甜椒等蔬菜果實(shí)中分離得到?；瘜W(xué)名為3′，4′，5，7-四羥基黃酮，化學(xué)式為C15H10O6。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素能抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖作用。Chang等〔5〕發(fā)現(xiàn)低劑量的木犀草素可抑制5種肝癌細(xì)胞系PLC/PRF/5、Hep 3B和HA22T/VGH細(xì)胞的增殖，但需較高的濃度木犀草素才能抑制HepG2 和SK-Hep 1的增殖作用。Wu等〔6〕研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素還可以劑量時(shí)間依賴的方式抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，并可將細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，上調(diào)caspase-3，6，9，Bax，p53蛋白的表達(dá)，下調(diào)bcl-2的表達(dá)，來抑制胃癌細(xì)胞的增殖作用。木犀草素還能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。Brusselmans等〔7〕指出，木犀草素可以抑制乳腺癌和前列腺癌細(xì)胞的脂肪酸合成酶活性，從而發(fā)揮其抗腫瘤細(xì)胞增長(zhǎng)和誘導(dǎo)其凋亡的作用。還有研究顯示，用木犀草素處理人肺癌A549細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分析可顯示出Sub-G1期峰值， PCR分析檢測(cè)出caspase-3基因表達(dá)降低，WB檢測(cè)出caspase-3蛋白表達(dá)降低，說明木犀草素可誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生凋亡〔8〕。同時(shí)，木犀草素還可作為腫瘤細(xì)胞凋亡增敏劑，Du等〔9〕研究表明，木犀草素可抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，并可增敏阿霉素對(duì)乳腺癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。另外，木犀草素還能影響腫瘤細(xì)胞周期分布。Kim等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素可以顯著抑制血小板源性生長(zhǎng)因子-BB(PDGF-BB)誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞的增殖作用，并可將細(xì)胞周期阻滯于G1期。此外，木犀草素可封閉血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的黏附，以限制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移；還可抑制腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，以減少腫瘤組織血管生成，從而限制腫瘤生長(zhǎng)〔11〕。

IGF-1 是一種重要的多功能細(xì)胞因子，與胰島素高度同源，具有快速代謝效應(yīng)和促分裂效應(yīng)〔12〕。在機(jī)體內(nèi)當(dāng) IGF-1與 IGF-IR 形成配體受體復(fù)合物時(shí)，引起受體聚集、自磷酸化和酪氨酸激酶的活化等一系列變化，激活PI3K/Akt和 Ras-MAPK兩條信號(hào)通路〔13～15〕，產(chǎn)生促進(jìn)細(xì)胞增殖﹑存活及抗細(xì)胞凋亡的作用。有文獻(xiàn)報(bào)道，乳腺癌患者患病組織IGF-1呈高表達(dá)狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1 能誘導(dǎo)乳腺上皮細(xì)胞中血管生成因子的大量表達(dá)，促進(jìn)腫瘤組織的血管生成，從而誘導(dǎo)乳腺癌的發(fā)生與轉(zhuǎn)化〔16〕。同時(shí)參與腫瘤細(xì)胞周期調(diào)節(jié)等效應(yīng)，在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。本研究結(jié)果顯示，在乳腺癌 MCF-7細(xì)胞中添加木犀草素，能顯著抑制IGF-1基因的表達(dá)，并隨著木犀草素濃度的增加，IGF-1相對(duì)表達(dá)量逐漸降低。木犀草素可以抑制IGF-1基因的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)對(duì)IGF-1介導(dǎo)的信號(hào)通路進(jìn)行干擾，進(jìn)而發(fā)揮其抗腫瘤的作用。在對(duì)培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞上清液中進(jìn)行IGF-1含量檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌 MCF-7細(xì)胞中添加木犀草素，能顯著抑制上清液中IGF-1的分泌，并隨著木犀草素濃度的增加，IGF-1分泌量逐漸降低。這與木犀草素對(duì)IGF-1基因表達(dá)的影響相一致。這表明，木犀草素對(duì)MCF-7細(xì)胞IGF-1的影響在基因水平和蛋白水平都能實(shí)現(xiàn)。木犀草素通過抑制IGF-1基因表達(dá)及其分泌，實(shí)現(xiàn)對(duì)IGF-1介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行干擾，進(jìn)而發(fā)揮其抗腫瘤的作用。

綜上，乳腺癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜過程，抗腫瘤藥物的作用靶點(diǎn)也多種多樣，明確木犀草素對(duì)乳腺癌發(fā)生發(fā)展中關(guān)鍵細(xì)胞因子的影響，對(duì)分析木犀草素的詳細(xì)抗腫瘤通路奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，也將為今后的抗腫瘤安全特效藥的開發(fā)提供理論依據(jù)。

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