李躍輝 胡薏冰 王 銀 彭 宇 秦裕輝 黃慧勇 張水寒

1.湖南省中醫(yī)藥研究院 楊永華名老中醫(yī)藥專家傳承工作室，湖南長(zhǎng)沙 410006；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙 410208

黃柏為蕓香科植物黃皮樹Phellodendron chinense Schneid.的干燥樹皮，具有清熱燥濕、瀉火除蒸、解毒療瘡的功效，是臨床常用的清熱燥濕藥，主治濕熱瀉痢、黃疸、熱淋、濕疹癥。黃柏習(xí)稱“川黃柏”，分布于湖北、湖南西北部、云南、四川東部等地[1]，小檗堿、黃柏堿等是其主要藥效成分，具有抗菌、消炎等藥理作用[2-3]。目前，中藥材市場(chǎng)存在問(wèn)題較多，黃柏同種藥材或飲片質(zhì)量參次不齊，區(qū)域差異、種植的規(guī)范化及不按規(guī)律采收與加工炮制等[4]均在一定程度上影響藥材的有效成分含量。試驗(yàn)收集了四川、云南、貴州、湖南等地不同時(shí)間采收的22批次黃柏藥材，采用高效液相色譜（HPLC）法對(duì)其小檗堿、黃柏堿含量進(jìn)行了檢測(cè)[5]，以期為黃柏藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)與資源合理利用提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)與參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津公司）；Lichrospher C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，江蘇漢邦科技有限公司）；KQ3200型超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）；T-214分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）。

1.2 試藥

藥材分別采集于四川、云南、貴州等地產(chǎn)區(qū)，具體采收與來(lái)源見表1。黃皮樹，經(jīng)鑒定均為蕓香科植物黃皮樹Phellodendron chinense Schneid.的干燥樹皮；小檗堿對(duì)照品（批號(hào)：110713-200911，供含量測(cè)定用）、鹽酸黃柏堿對(duì)照品（批號(hào)：111895-201202，供含量測(cè)定用）均為中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；水為重蒸餾水，乙腈、磷酸等試劑均為色譜純，其他試劑為分析純。

表1 黃柏來(lái)源與采收時(shí)間表

2 方法與結(jié)果

2.1 小檗堿含量測(cè)定[6-8]

2.1.1 色譜條件 采用Lichrospher C18柱色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液（50∶50）（含0.1%十二烷基磺酸鈉），檢測(cè)波長(zhǎng)為265 nm，流速為1 mL/min，柱溫為35℃。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 取鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，精密稱定，置容量瓶中，加流動(dòng)相配制成每毫升含100 μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 各批樣品粉碎過(guò)三號(hào)篩，取約0.1 g，精密稱定，置100 mL量瓶中，加流動(dòng)相90 mL，超聲提?。üβ?250 W，頻率 40 kHz）40 min，放冷，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別取上述溶液各10 μL，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，理論塔板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計(jì)算不低于4000，小檗堿色譜峰與相鄰峰之間分離度大于1.5。見圖1。

2.1.5 線性關(guān)系 精密吸取上述對(duì)照品溶液2.5、5、10、7.5、15、20 μL 依次進(jìn)樣，按上述色譜條件測(cè)定，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程：Y＝41 604X-11 549，r＝0.9995。 線性范圍為 0.25～2.00 μg。

2.1.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積積分值。結(jié)果RSD為1.28%，精密度＜2%。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，精密吸取10 μL，分別于 0、3、6、9、12、15 h 進(jìn)行測(cè)定， 記錄峰面積，結(jié)果供試品溶液在15 h峰面積積分值基本穩(wěn)定。

2.1.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同批次樣品6份，按上述條件測(cè)定，結(jié)果藥材中小檗堿平均含量為7.15%，RSD值為1.89%，表明本方法重復(fù)性好。

2.1.9 回收率試驗(yàn) 采用加樣回收法。取已知小檗堿含量（7.15%）的黃柏藥材6份，每份0.05 g，分別精密加入鹽酸小檗堿對(duì)照品3.5 mg，按上述含量測(cè)定項(xiàng)下的方法測(cè)定，結(jié)果平均回收率為97.46%，RSD值為2.03%。

2.2 黃柏堿含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱為L(zhǎng)ichrospher C18柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm）， 流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液 （含0.2%十二烷基磺酸鈉）（36∶64），檢測(cè)波長(zhǎng)為 284 nm，流速為1 mL/min，柱溫為35℃。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取鹽酸黃柏堿對(duì)照品適量，精密稱定，加流動(dòng)相制成每毫升含0.1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取各批次樣品粉末（過(guò)四號(hào)篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞三角瓶中，精密加入流動(dòng)相25 mL，稱定重量，超聲提取（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再精密稱重，用流動(dòng)相補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，理論塔板數(shù)按鹽酸黃柏堿峰計(jì)算不低于6000，鹽酸黃柏堿色譜峰與相鄰峰之間分離度大于1.5。見圖2。

2.2.5 線性關(guān)系 精密吸取上述對(duì)照品溶液2.5、5、10、7.5、15、20 μL 依次進(jìn)樣，按上述色譜條件測(cè)定，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程：Y＝119 128X+31 320，r＝0.9999， 黃柏堿在0.2625～2.1000 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積積分值。結(jié)果其峰面積積分值RSD為1.28%，符合要求。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，精密吸取10 μL，分別于 0、3、6、9、12、15 h 進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積。 結(jié)果表明，黃柏堿在15 h內(nèi)測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同批次樣品，精密稱取6份，按上述條件測(cè)定，結(jié)果藥材中黃柏堿平均含量為0.64%，RSD值為1.76%，表明本方法重復(fù)性好。

2.2.9 回收率試驗(yàn) 采用加樣回收法。取已知黃柏堿含量（0.64%）的黃柏藥材6份，每份0.25 g，分別精密加入鹽酸黃柏堿對(duì)照品1.6 mg，按上述含量測(cè)定項(xiàng)下的方法測(cè)定，結(jié)果平均回收率為96.89%，RSD值為2.25%。

2.3 樣品測(cè)定

取各產(chǎn)地及各采收期樣品，按照上述方法依次測(cè)定其小檗堿、黃柏堿的含量，結(jié)果見表2、3。

表2 不同產(chǎn)地黃柏藥材中小檗堿、黃柏堿含量測(cè)定結(jié)果

表3 不同采收期黃柏藥材中小檗堿、黃柏堿含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 樣品采集

黃皮樹有雌株與雄株之分，兩者含量有一定的區(qū)別；另有報(bào)道黃柏藥材于5～13年生黃皮樹采收，以8～10年為最高，并以5月采收為最佳[9-10]。同時(shí)，黃柏采收有根皮、干皮、枝皮的區(qū)別，常規(guī)采用干皮入藥[11]。為減小客觀條件對(duì)小檗堿與黃柏堿含量的影響，本次樣品采集均選擇8年生黃皮樹雌株干皮進(jìn)行試驗(yàn)。

3.2 產(chǎn)地對(duì)含量的影響

試驗(yàn)研究結(jié)果表明，采收的10個(gè)產(chǎn)區(qū)黃柏藥材其小檗堿與黃柏堿含量均達(dá)到了《中國(guó)藥典》2010年版含量限度要求，不同產(chǎn)區(qū)含量有一定的差異，試驗(yàn)所收集的樣品中，以湖南保靖縣與花壇縣為最高，四川滎經(jīng)縣與武隆縣也較高，說(shuō)明其含量高低與地域、栽培條件有一定的關(guān)系。文獻(xiàn)報(bào)道，黃柏中小檗堿與黃柏堿含量多以四川地區(qū)產(chǎn)含量較高，也有報(bào)道貴州產(chǎn)含量較高[12]，此次試驗(yàn)研究中，以湖南產(chǎn)樣品含量最高，產(chǎn)區(qū)保靖縣夯沙鄉(xiāng)與花壇縣道二鄉(xiāng)為新的黃柏種植基地，可能與當(dāng)?shù)丨h(huán)境氣候及現(xiàn)代種植技術(shù)提高有關(guān)。

3.3 采收期對(duì)含量的影響

從不同采收期試驗(yàn)結(jié)果可看出，以小檗堿為考察指標(biāo)，武隆縣與保靖縣黃柏藥材含量均以5～6月上旬為最高，6月下旬含量開始下降，7、8月含量最低，9月份含量回升；以黃柏堿含量為考察指標(biāo)，5～6月上旬為最高，7、8月含量稍低，相對(duì)基本穩(wěn)定。說(shuō)明黃柏宜在5～6月上旬采收為宜，此時(shí)小檗堿與黃柏堿含量均最高。本次試驗(yàn)收集批次樣品有限，所測(cè)數(shù)據(jù)為各產(chǎn)區(qū)黃柏藥材含量提供了參考，同時(shí)也為黃柏藥材資源的合理利用提供了一定依據(jù)。

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