王向濤，孫桂超，徐昶儒，韓 磊，劉日嘉，張 鑫，袁洪亮，肖 爽，蘇怡君

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心，哈爾濱 150076)

研究表明多糖類成分具有較好的免疫促進(jìn)作用，其在抗腫瘤、抗病毒、抗感染等方面表現(xiàn)出了較好的療效[1].多糖不僅具有抗腫瘤藥理作用，而且還可以降低化療藥物的不良反應(yīng)，在臨床上成為良好的化療輔助用藥，對化療療效的提高及降低不良反應(yīng)具有較大的幫助[2-5].

龍葵(Solanum nigrum L.)為茄科一年至多年生草本植物, 全草均可入藥[6]，具有抗腫瘤、抑菌、抗病毒作用，同時對神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)等方面具有較好的作用，得到了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[7-10].據(jù)文獻(xiàn)報道龍葵中的生物堿類成分可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡等作用，而關(guān)于龍葵多糖是否對腫瘤具有一定的治療作用，尚未見報道，因此本文主要初步觀察了龍葵多糖對腫瘤的治療作用.

本文主要觀察了龍葵多糖(LP)的體內(nèi)外抗腫瘤作用，并觀察了其對免疫系統(tǒng)的初步影響.通過本研究為龍葵多糖的抗腫瘤作用的開發(fā)提供實(shí)驗基礎(chǔ).

1 實(shí)驗材料

1.1 藥物

龍葵粗多糖：哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥物研究所提供；黃芪多糖(APS)：黑龍江省生物制藥一廠提供(批號：201301)；5-Fu：上海旭東海普藥業(yè)有限公司(批號：201211)；阿霉素：浙江海正藥業(yè)股份有限公司(批號：201304).

1.2 實(shí)驗動物及瘤株

昆明種小鼠，體重(20±2.0)g，雌雄各半，購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物中心提供；瘤株：S180(肉瘤)、H22(肝癌)購自哈醫(yī)大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所；HepG-2和SGC-7901細(xì)胞由哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥物研究所凍存復(fù)蘇.

1.3 實(shí)驗試劑

RPMI-1640購自Hyclone公司，胎牛血清購自杭州四季青生物有限公司；疊氮鈉(NaN3)、MTT(噻唑藍(lán))、DMSO(二甲基亞砜)、胰蛋白酶購自Sigma公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉等試劑均為分析純.

1.4 實(shí)驗儀器

低速離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠(LD4-2A型)；

超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備廠；

電熱恒溫水浴鍋 北京長安科學(xué)儀器廠；

二氧化碳培養(yǎng)箱 美國NBS公司(CO-150型)；

倒置顯微鏡 日本OLYMPUS公司；

酶標(biāo)儀 美國伯樂公司(680型)；

2 實(shí)驗方法

2.1 實(shí)驗分組

小鼠隨機(jī)分成6組：1)陰性對照組，2)陽性對照組(黃芪多糖組)，3)陽性對照組(5-Fu組)，4)龍葵多糖高劑量組，5)龍葵多糖中劑量組，6)龍葵多糖低劑量組.

2.2 MTT比色法測定龍葵多糖體外對HepG-2和SGC-7901兩種腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用

取對數(shù)生長期的細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104個/mL，接種于96孔培養(yǎng)板(100μL/孔)，二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，24 h后，分別加入5個濃度的龍葵多糖及5個濃度的陽性藥5-Fu，于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h.72 h后，吸棄細(xì)胞培養(yǎng)基，每孔加入質(zhì)量濃度為1 mg/mL的MTT 150 μL，于二氧化碳培養(yǎng)箱中作用4 h.4 h后，棄去MTT，各孔分別加入150 μL DMSO，搖勻，于570 nm波長下測定光密度(OD).根據(jù)測定的吸光度值計算抑制率并計算IC50.

抑制率(%)=(對照組吸光度值-實(shí)驗組吸光度值/對照組吸光度值)×100%

2.3 龍葵多糖對S180實(shí)體瘤的抑制作用

生長良好的S180荷瘤小鼠頸椎脫臼處死，腹部皮膚消毒后，用注射器無菌條件下小鼠腹腔抽取S180腹水，放入無菌容器內(nèi)，腹水應(yīng)為乳白色，如有紅色的溶血不可用.另取一滴腹水細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，制片，瑞氏染色，并進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，其中癌細(xì)胞數(shù)為97%以上方可使用.按生理鹽水：腹水為4∶1的溶液稀釋，選用昆明種小鼠，體重(20±2 g)，雌雄各半，于小鼠右肢腋下接種，0.2 mL/只.

將接種后的小鼠60只，隨機(jī)分為6組，分別為LP高、中、低劑量組，陽性對照組(黃芪多糖對照組、5-Fu對照組)及陰性對照組.接種24 h后LP組分別以125、62.5、31.25 mg/kg三個劑量給藥，黃芪多糖對照組給藥劑量為100 mg/kg，5-Fu對照組給藥劑量為25 mg/kg，陰性對照組給相同體積的生理鹽水.腹腔給藥，每日1次，連續(xù)7 d.停藥次日處死，稱體重，取出瘤塊稱重，按如下公式計算抑制率，并觀察藥效與劑量間的關(guān)系.本實(shí)驗重復(fù)進(jìn)行3次.

瘤重抑制率=

2.4 龍葵多糖對小鼠移植腫瘤H22的生命延長作用

實(shí)驗步驟基本同2.3，區(qū)別在于造模時采用腹腔注射，而不是腋下注射.生命延長率計算公式如下：

生命延長率=

2.5 龍葵多糖對S180實(shí)體瘤小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響

荷瘤小鼠造模方法同2.3，將造模后的小鼠隨機(jī)分為6組，分別為LP高、中、低劑量組，陽性對照組(黃芪多糖對照組、5-Fu對照組)及陰性對照組.接種24 h后LP以125 mg/kg、62.5 mg/kg、31.25 mg/kg三個劑量給藥，黃芪對照組劑量100 mg/kg，5-Fu對照組劑量25 mg/kg，陰性對照組給相同體積的生理鹽水.腹腔給藥，每日給藥1次，連續(xù)給藥7d.停藥次日處死，稱體重，取脾、胸腺，用電子天平稱質(zhì)量，按下列公式計算脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù).本實(shí)驗重復(fù)進(jìn)行三次.

臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)

2.6 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果以x±S表示，組間采用t-test進(jìn)行方差分析和差異顯著性分析.

3 實(shí)驗結(jié)果

3.1 MTT比色法測定龍葵多糖的體外對HepG-2和SGC-7901兩種腫瘤細(xì)胞的直接抑制作用

結(jié)果如表1所示，龍葵多糖對HepG-2和SGC-7901均有一定的抑制作用，但抑制作用較弱.

表1龍葵多糖對HepG-2和SGC-7901腫瘤細(xì)胞半數(shù)抑制濃度

化合物IC50/(μg·mL-1)HepG-2SGC-7901LP189.60186.56CAM1.0319.19

3.2 龍葵多糖對S180小鼠瘤重的影響

如表2所示，龍葵多糖各劑量組S180小鼠平均瘤重均明顯低于生理鹽水組(P<0.01)，中劑量組抑制率可達(dá)40.13%，但高劑量抑瘤率不及中劑量組.

表2龍葵多糖對S180小鼠瘤重的影響

組別劑量/ (mg·kg-1)n質(zhì)量/g開始結(jié)束開始結(jié)束瘤重/g抑制率/%Control—121019.54±1.0723.16±1.962.10±0.40 —5-Fu25121120.30±0.9320.47±2.080.90±0.25??57.07APS100121019.13±0.8523.46±1.681.43±0.28??32.21LP125121219.87±0.7126.32±2.401.45±0.31??31.3462.5121219.85±0.5425.43±1.911.26±0.26??40.1331.25121019.31±0.3524.58±2.201.51±0.21??28.20

*P<0.05，**P<0.01 vs control

3.3 龍葵多糖對H22小鼠生存時間的影響

如表3所示，龍葵多糖各劑量組均能明顯延長H22小鼠生存時間(P<0.05，P<0.01)，其中劑量組生命延長率可達(dá)88.87%，明顯優(yōu)于APS對照組(P<0.05)，但高劑量組作用不及中劑量組.

3.4 龍葵多糖對S180小鼠脾指數(shù)及胸腺指數(shù)的影響

如表4所示，龍葵多糖各劑量組均可顯著提高荷瘤小鼠的胸腺指數(shù)和脾指數(shù)(P<0.05或P<0.01).

表3龍葵多糖對H22荷瘤小鼠生存時間的影響

組別劑量/(mg·kg-1)n開始結(jié)束平均生存天數(shù)/d生命延長率/%空白—121011.18±2.04—5-Fu25121224.10±3.57??107.53APS100121016.00±2.20??43.09LP125121221.10±3.78??78.7662.5121221.45±3.47??88.8731.25121115.20±2.70??42.89

*P<0.05，**P<0.01 vs control

表4龍葵多糖對S180荷瘤小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)作用

組別劑量/ (mg·kg-1)n開始結(jié)束 結(jié)束時體重/g胸腺指數(shù)/(mg·g-1)脾指數(shù)/(mg·g-1)Control—121023.16±1.962.15±0.823.98±0.655-Fu25121120.47±2.081.82±0.623.25±1.13APS100121023.46±1.683.00±0.72?5.86±0.87??LP125121226.32±2.404.28±0.90?6.72±1.37??62.5121225.43±1.913.83±0.74??6.05±0.81??31.25121024.58±2.202.98±0.70?5.84±1.04?

*P<0.05，**P<0.01 vs control

4 討 論

本實(shí)驗對龍葵多糖成分體內(nèi)外抗腫瘤藥效進(jìn)行了研究.體外實(shí)驗采用MTT法觀察了龍葵多糖對HepG-2和SGC-7901兩種人體腫瘤細(xì)胞的生長抑制作用.結(jié)果顯示龍葵多糖對兩種腫瘤細(xì)胞的IC50分別為189.60 μg/mL和186.56 μg/mL，明顯高于中藥提取物細(xì)胞毒作用的評價標(biāo)準(zhǔn)(10 μg/mL)，說明龍葵多糖對HepG-2和SGC-7901細(xì)胞的細(xì)胞毒性較弱.

抑瘤率和生命延長率是評估藥物在藥效學(xué)研究方面的基礎(chǔ)性指標(biāo)，減緩腫瘤的生長速度,甚至使瘤體縮小，是抗腫瘤藥物是否有效的重要指標(biāo)，生命延長率是驗證藥物是否有效的藥效學(xué)整體評估指標(biāo).體內(nèi)實(shí)驗主要觀察了龍葵多糖對S180實(shí)體瘤的抑制作用(以抑瘤率為指標(biāo))以及對H22腹水癌小鼠生存時間的延長作用(以生命延長率為指標(biāo)).結(jié)果表明龍葵多糖表現(xiàn)出良好的抑瘤效果和生命延長效果.其中龍葵多糖中劑量對S180小鼠的抑瘤率最大，達(dá)到了40.13%.并且在H22小鼠生存時間的實(shí)驗中，我們發(fā)現(xiàn)高劑量組的荷瘤小鼠生存時間反而下降，就抑瘤率以及生存時間而言高劑量組小鼠的藥物效果低于其他劑量組，可能是因為多糖類成分比較粘稠，高濃度龍葵多糖體內(nèi)吸收不如其他劑量組造成的.

脾臟和胸腺是人體重要的免疫器官，其中脾臟是免疫細(xì)胞定居的場所，也是免疫應(yīng)答的場所；胸腺是T細(xì)胞發(fā)育的主要場所.機(jī)體發(fā)生超敏反應(yīng)的同時，其質(zhì)量會增加，因此脾指數(shù)和胸腺指數(shù)可作為評估藥物對免疫器官的抑制作用的基礎(chǔ)指標(biāo)[11].研究發(fā)現(xiàn)，LP對荷瘤小鼠免疫器官具有保護(hù)作用，與陰性對照組比較胸腺指數(shù)和脾指數(shù)兩項指標(biāo)均有不同程度的增加，中高劑量組作用顯著(P<0.05或P<0.01).

腫瘤的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體免疫系統(tǒng)有著密切的關(guān)系，機(jī)體免疫機(jī)能的降低有利于腫瘤的形成和發(fā)展，而癌癥患者常有免疫機(jī)能低下及免疫器官萎縮[12].特別是化療藥物的應(yīng)用，常引起機(jī)體免疫機(jī)能嚴(yán)重下降.而相關(guān)報道顯示，多糖類成分的抗腫瘤藥物均具有提高免疫能力和保護(hù)脾臟的作用[13-18].本研究結(jié)果提示，龍葵多糖抗腫瘤作用并非直接殺傷腫瘤細(xì)胞，而可能是通過其強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)作用實(shí)現(xiàn)的.龍葵多糖類成分對腫瘤病人生命延長和提高免疫力方面有很好的應(yīng)用前景.

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