王悅，李京，范慧紅

（中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050）

交聯(lián)玻璃酸鈉注射液中殘留交聯(lián)劑乙烯砜的測(cè)定

王悅，李京，范慧紅Δ

（中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050）

目的建立交聯(lián)玻璃酸鈉注射液中交聯(lián)劑乙烯砜和其水化產(chǎn)物1，4-噻惡烷-1，1-二氧殘留量的測(cè)定方法。方法用乙醇萃取樣品，乙烯砜和其水化產(chǎn)物溶于乙醇，玻璃酸鈉不溶于乙醇生成白色沉淀，取上清液直接進(jìn)樣，用氣相色譜儀分析。色譜柱為Agilent DB-wax（30m×0.53mm，1.0μm）；分別使用氫火焰離子化檢測(cè)器（flame ionization detector，F(xiàn)ID）和火焰光度檢測(cè)器（flame photometric detector，F(xiàn)PD）進(jìn)行測(cè)定并對(duì)比結(jié)果。結(jié)果FID測(cè)定乙烯砜和其水化產(chǎn)物的線性范圍分別為0.5～20μg／mL和2～100μg／mL；定量限分別為2.6μg／mL和7.6μg／mL；檢測(cè)限分別為0.8μg／mL和2.3μg／mL；加樣回收率分別為104.3%和92.4%。FPD測(cè)定結(jié)果與FID測(cè)定結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論使用FID已可以滿足檢驗(yàn)需要，該方法靈敏、快速、專屬性強(qiáng)，可用來(lái)同時(shí)控制產(chǎn)品中痕量的乙烯砜和其主要水化產(chǎn)物1，4-噻惡烷-1，1-二氧。

交聯(lián)玻璃酸鈉；乙烯砜；乙烯砜水化物；1，4-噻惡烷-1，1-二氧；氣相色譜法

本文研究用樣品為兩步交聯(lián)后的混合物，組分A為甲醛交聯(lián)生成的可溶性凝膠，組分B為A組分經(jīng)乙烯砜二次交聯(lián)的不溶性凝膠，2者經(jīng)一定比例混合，產(chǎn)品分子量約6 000 kDa。交聯(lián)玻璃酸鈉分子量大小、理化性質(zhì)等與選擇的交聯(lián)劑類型、交聯(lián)劑濃度和交聯(lián)時(shí)間均有關(guān)系［11］，但如乙烯砜等交聯(lián)劑多具有較強(qiáng)的毒性［12-13］，交聯(lián)步驟時(shí)交聯(lián)劑的濃度與反應(yīng)時(shí)間均應(yīng)嚴(yán)格控制，其在產(chǎn)品中的殘留量也應(yīng)被嚴(yán)格控制。在交聯(lián)反應(yīng)中，乙烯砜除可以與玻璃酸鈉的糖鏈發(fā)生反應(yīng)外，還可與水發(fā)生副反應(yīng)，主要副產(chǎn)物為 1，4-噻惡烷-1，1-二氧（1，4-Thioxane-1，1-dioxide，TD）和 2-2′磺酰基二乙醇（Sulfonyl Diethanol，SD），因此在控制乙烯砜殘留量的同時(shí)還應(yīng)控制其水化產(chǎn)物的含量。2-2′磺?；掖驾^不穩(wěn)定，在高溫下會(huì)轉(zhuǎn)化為1，4-噻惡烷-1，1-二氧。本文旨在建立一種可以同時(shí)測(cè)定乙烯砜和1，4-噻惡烷-1，1-二氧2種化合物的氣相色譜方法?？紤]到供試品質(zhì)地黏稠且有不溶顆粒，本文分別考察了超濾離心和乙醇萃取的樣品處理方式。另外，本文還分別考察了對(duì)含硫化合物高靈敏的FPD檢測(cè)器和較為普及的FID檢測(cè)器對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 Agilent 7890A氣相色譜儀（Agilent7693自動(dòng)進(jìn)樣器，F(xiàn)PD檢測(cè)器，安捷倫科技有限公司）；氫空一體機(jī)（中惠普分析技術(shù)研究所）；HP 6890 plus氣相色譜儀（HP 7683自動(dòng)進(jìn)樣器，F(xiàn)ID檢測(cè)器，惠普公司）。

VS為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?；TD購(gòu)于美國(guó)Alfa Aesar公司，純度≧99%；乙醇購(gòu)自DikmaPure，色譜純。交聯(lián)玻璃酸鈉注射液共6批（批號(hào)：P12062、N12015、W11132、X11262、P1217、Q12161），由Genzyme Biosurgery公司提供。

1.2 溶液制備

1.2.1 內(nèi)標(biāo)溶液：準(zhǔn)確稱取二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）適量，稀釋制成20μg／mL的溶液。

1.2.2 對(duì)照品溶液：準(zhǔn)確稱取 VS、TD適量，稀釋制成1 000μg／mL的貯備液。分別取2種貯備液適量，稀釋成含VS、TD分別為2μg／mL、10μg／mL的混合溶液，精密量取0.9mL，加入0.1mL內(nèi)標(biāo)溶液和2mL乙醇，混勻。

1.2.3 供試品溶液：稱取供試品0.9 g，加入0.1mL內(nèi)標(biāo)溶液和2mL乙醇，密塞，混勻，室溫放置至沉淀完全后，取上清液，0.45μm濾膜過(guò)濾。

1.3 色譜條件 色譜柱：Agilent DB-WAX（30m×0.53mm，1.0μm）；載氣為高純氮?dú)猓簧郎靥荻龋海ㄆ鹗紲囟?40℃，維持2min；以25℃／min的速率升至170℃；再以35℃／min的速率升至240℃，維持1.7min）；流速為15mL／min；FID檢測(cè)器及 FPD檢測(cè)器；進(jìn)樣口溫度為210℃；檢測(cè)器溫度為300℃。

2 結(jié)果

2.1 專屬性試驗(yàn) 按照1.2.2和1.2.3方法，配制不含VS、TD的陰性溶液，分別進(jìn)樣1μL，記錄色譜圖，結(jié)果均無(wú)空白干擾。內(nèi)標(biāo)物、VS、TD 3個(gè)色譜峰之間分離度均能夠符合要求。

2.2 線性關(guān)系、定量限及檢測(cè)限考察 精密吸取VS貯備液、TD貯備液適量，稀釋成含 VS分別為 0.5、1、2、5、10、20μg／mL，含 TD分別為2、5、10、20、100μg／mL的混合溶液，各取1mL，加入2mL乙醇，搖勻，作為系列線性溶液。吸取上述線性溶液1μL進(jìn)樣，分別用FID、FPD檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積。以對(duì)照品的質(zhì)量濃度X（μg／mL）為橫坐標(biāo)，峰面積或峰高Y為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，分別得出VS、TD在兩種檢測(cè)器下的回歸方程。將混合對(duì)照品逐級(jí)稀釋，以信噪比為3和10時(shí)，得VS、TD的檢測(cè)限和定量限（見(jiàn)表1）。

表1 回歸方程、定量限及檢測(cè)限結(jié)果Tab.1 Regression equations，LOD and LOQ of VS and TD

2.3 精密度試驗(yàn) 取含2μg／mLVS、10μg／mLTD的混合對(duì)照溶液1μL，注入氣相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。使用FPD檢測(cè)器得到的VS和TD的RSD分別為3.3%和3.2%；使用FID檢測(cè)器得到的VS和TD的RSD分別為1.1%和2.0%。

2.4 加樣回收率 稱取9份已測(cè)定含量的樣品0.9 g，精密稱定。由于已測(cè)樣品中未檢出VS和TD殘留，因此2種化合物的加入量均按照其擬定限度值的80%、100%、120%設(shè)置，配制成低、中、高3個(gè)濃度的混合對(duì)照品溶液。分別向樣品中加入混合對(duì)照品溶液0.1mL，充分混勻，每個(gè)濃度平行3份，分別加入2mL乙醇，混勻，取上清液進(jìn)樣1μL，用FID檢測(cè)器記錄峰面積，計(jì)算加樣回收率，由表2結(jié)果可見(jiàn)，VS、TD的平均回收率均在80%～120%范圍內(nèi)，該方法的準(zhǔn)確度可靠。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Sample recovery test results

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定 將6批供試品分別按照1.2.3方法配制。取對(duì)照品溶液和供試品溶液各1μL進(jìn)樣，用FID（圖1）和FPD檢測(cè)器（圖2）分別測(cè)定，記錄峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算供試品溶液中VS、TD殘留量，結(jié)果均未檢出。

圖1 FID檢測(cè)器測(cè)定對(duì)照品（a）和供試品（b）溶液色譜圖Fig.2 The chromatography of standard solution（a）and sample solution（b）detected by FID

圖2 FPD檢測(cè)器測(cè)定對(duì)照品（a）和供試品（b）溶液色譜圖Fig.3 The chromatography of standard solution（a）and sample solution（b）detected by FID

3 討論

3.1 樣品處理方式 使用乙烯砜交聯(lián)后的玻璃酸鈉樣品，多呈不溶性凝膠狀，無(wú)法采用直接進(jìn)樣的方式。乙烯砜和其水化物的沸點(diǎn)較高，不能采用頂空進(jìn)樣的方式。因此本研究采用乙醇萃取樣品的方式，使玻璃酸鈉形成白色沉淀，同時(shí)乙烯砜及水化物易溶于乙醇，可直接進(jìn)樣進(jìn)行測(cè)定。本研究所用樣品是可溶性A組分與不溶性B組分的混合物，本文曾摸索過(guò)采用截留Mw≧10k的超濾管離心超濾，棄去不溶部分，將濾出液直接進(jìn)樣測(cè)定的方法，但研究發(fā)現(xiàn)濾出液體積與超濾管品牌、批次，離心轉(zhuǎn)數(shù)與離心時(shí)間均有關(guān)系，濾出液體積與樣品加入量之間不能準(zhǔn)確換算。另外，濾液直接進(jìn)樣后，小分子量的玻璃酸鈉會(huì)對(duì)TD的檢測(cè)造成干擾，必須采用FPD檢測(cè)器才能消除。

3.2 萃取液體積 樣品中VS、TD的殘留量較低，加入2mL乙醇作為萃取液可以萃取完全。本文曾將樣品溶液棄去上清后，取沉淀物進(jìn)行二次萃取試驗(yàn)，二次萃取液中未檢出殘留VS、TD，說(shuō)明2mL萃取液體積已可以滿足實(shí)驗(yàn)需要。

3.3 檢測(cè)器選擇 FPD是對(duì)含硫、磷的化合物具有高靈敏性、高專屬性的檢測(cè)器，從圖1－2可以看出基線較為平整，不受樣品和載氣雜質(zhì)的干擾，但也正是由于高專屬性，其普及性較差。本文的研究表明，由于樣品基質(zhì)已采用乙醇沉淀，可以采用FID檢測(cè)器，且檢出限和定量限已可以滿足測(cè)定要求，與FPD相比無(wú)顯著性差異。

3.4 標(biāo)準(zhǔn)限度 乙烯砜有很強(qiáng)的毒性，其殘留量應(yīng)被嚴(yán)格控制。乙烯砜在交聯(lián)工藝步驟中與水反應(yīng)生成的水化產(chǎn)物，毒性較乙烯砜降低。在綜合考慮企業(yè)質(zhì)控限度、待測(cè)樣品的殘留量、殘留交聯(lián)劑的毒性及檢測(cè)所用方法的靈敏度后，本研究將乙烯砜殘留的上限定為2 ppm，將其水化產(chǎn)物的限度定為10 ppm。

以往的研究都只關(guān)注于乙烯砜交聯(lián)劑本身［14-15］，對(duì)于其水化產(chǎn)物并未控制。本研究建立的方法可以同時(shí)測(cè)定乙烯砜及其主要水化產(chǎn)物1，4-噻惡烷-1，1-二氧的量。本研究還比較了FID檢測(cè)器和專屬性測(cè)定含硫化合物的FPD檢測(cè)器對(duì)于2者的測(cè)定結(jié)果，結(jié)果表明FID檢測(cè)器已可以滿足日常測(cè)定需求。本研究建立的方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高，為乙烯砜交聯(lián)劑殘留量的質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

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（編校：吳茜）

Determ ination of residual cross-linker vinyl sulfone in sodium hyaluronate injection

WANG Yue，LIJing，F(xiàn)AN Hui-hongΔ

（National Institute for Food and Drug Control，Beijing 100050，China）

ObjectiveTo establish a method to quantify the residual cross-linker vinyl sulfone and its hydration product 1，4-Thioxane-1，1-Dioxide.MethodsThe polysaccharidewas precipitated by ethanol，however vinyl sulfone and its hydration productwere soluble，and can be analyzed by direct injection.The analysiswas carried on Agilent DB-wax capillary column（30m×0.53 mm，1.0μm）.The flame ionization detector（FID）and flame photometric detector（FPD）were used to detect samples and the efficiency were compared.ResultsThe linear range of vinyl sulfone and its hydration productwere separately 0.5～20μg／mLand 2～100μg／mL detected by FID.The Limit of Quantity（LOQ）were 0.8μg／mL and 2.3μg／mL，respctively.The Limit of Detection（LOD）were 2.6μg／mLand 7.6μg／mL，respectively，and the average recoveries（n＝9）of them were 104.3%and 92.4%，respectively.ConclusionFID could meet the needs of the test，and this method is simple and accurate with high sensitivity and good repeatability，which can be used for quality control of trace vinyl sulfone and its hydration products 1，4-Thioxane-1，1-Dioxide in cross-linked sodium hyaluronate injection.

cross-linked sodium hyaluronate injection；vinyl sulfone；hydration product of vinyl sulfone；1，4-Thioxane-1，1-Dioxide；Gas Chromatography

TQ460.72

A

1005－1678（2014）04－0171－04

玻璃酸鈉（sodium hyaluronate）在自然界中多存在于眼球晶狀體，關(guān)節(jié)腔黏液，皮膚、動(dòng)脈管壁、臍帶等結(jié)締組織、雞冠以及某些細(xì)菌的夾膜中。它是一種天然直鏈黏多糖類物質(zhì)，其二糖單元是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基-D-葡萄糖以-1，3糖苷鍵構(gòu)成，重復(fù)的二糖單元以β-1，4糖苷鍵連接形成糖鏈［1］。

天然玻璃酸鈉分子量較小，在體內(nèi)易被降解，半衰期較短，在體內(nèi)僅能維持幾天［2］。為解決這一問(wèn)題，可采用不同交聯(lián)劑將天然玻璃酸鈉交聯(lián)在一起，增強(qiáng)其結(jié)構(gòu)強(qiáng)度［3］及抗降解能力，從而延長(zhǎng)其在體內(nèi)維持時(shí)間［4-5］。目前常用交聯(lián)劑有甲醛、戊二醛［6］、碳二亞胺（carbodiimide）［4］、乙烯砜（vinyl sulfone，VS）［1］和1，4-丁二醇二縮水甘油醚（1，4-Butanediol Dimethanol Diglycidyl Ether，BDDE）［7］。其中乙烯砜交聯(lián)產(chǎn)品目前廣泛應(yīng)用于預(yù)防術(shù)后組織粘連［8］、組織工程［9］、組織填充［10］以及關(guān)節(jié)腔潤(rùn)滑。然而目前各國(guó)藥典均未收載該品種，我國(guó)也尚無(wú)該品種的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，各企業(yè)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)乙烯砜殘留的控制方法、限度均有所不同，亟待建立合理規(guī)范的方法和標(biāo)準(zhǔn)。

王悅，女，碩士，助理研究員，研究方向：多糖類藥物質(zhì)量控制；范慧紅，通信作者，女，研究員，研究方向：生化藥物的質(zhì)量控制，E-mail：shenghuayaoshi＠126.com。