蔡家利，尹忠寶，朱廣倍，任燕斌，吳勝昔，黃國光

(重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400054)

豬病毒病一直是阻礙養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的一大因素［1］，我國每年因豬的病毒性疾病造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)數(shù)十億元。對于豬的病毒性傳染病(如豬瘟、口蹄疫、豬繁殖與呼吸綜合征等)，目前主要靠疫苗進(jìn)行預(yù)防。隨著對抗病毒藥物的管理愈加嚴(yán)格，動物的病毒性傳染病的治療只有依靠高免血清或病毒干擾制劑，因此，動物病毒病愈加需要更經(jīng)濟(jì)、安全、有效的藥物。干擾素是由機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)生的一類高活性多功能糖蛋白，具有廣譜抗病毒、抗腫瘤活性及免疫調(diào)節(jié)等多種功能，其中又以α－干擾素的廣譜抗病毒作用最為顯著。利用基因工程技術(shù)獲得的具有生物學(xué)活性的重組豬α－干擾素對豬病毒感染的防治具有重要的意義［2］。

筆者所在實(shí)驗(yàn)室在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了干擾素的可溶性表達(dá)和純化工藝的研究，但需對產(chǎn)品活性高低和冷凍干燥方法進(jìn)行研究。因此，本文旨在對該方法制備的干擾素進(jìn)行體外活性測定和凍干保護(hù)劑的篩選，從而為干擾素注射劑的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、毒株和細(xì)胞

大腸桿菌BL-21干擾素工程菌株、Marc-145細(xì)胞株均由重慶理工大學(xué)生物制藥實(shí)驗(yàn)室保存，豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)毒株由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)饋贈。

1.1.2 主要試劑及材料

Ni-NTA Sefinose Resin填料購自生工生物工程有限公司;蛋白Marker和牛血清白蛋白購自鼎國昌盛生物技術(shù)公司;四季青無支原體新生牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司;甘露醇為溫州市東升化工試劑廠產(chǎn)品。

1.1.3 儀器

LaboGene冷凍干燥機(jī)，型號:Coolsafe 110-4;全自動凝膠成像系統(tǒng)，型號:Gel Doc EZ，廠家:美國伯樂公司。

1.1.4 凍干保護(hù)劑的含量

選擇甘露醇和牛血清白蛋白作為保護(hù)劑，含量分別為1%，3%，5%。

1.2 樣品制備

重組豬α干擾素按照本實(shí)驗(yàn)室已建立的誘導(dǎo)表達(dá)，采用純化工藝進(jìn)行制備［3］。取保存的干擾素工程菌株，接種到含氨芐青霉素(Amp)100 μg/mL的固體LB平板，分離單菌落。挑取單一菌落接種到50 mL含Amp(100 μg/mL)的液體LB培養(yǎng)基，37℃、200 r/min過夜培養(yǎng)。將菌液按體積比1∶100的比例接種到2 L含Amp(100 μg/mL)的液體LB培養(yǎng)基，37℃、200 r/min培養(yǎng)至 OD600為0.6～0.8時(shí)，加入終濃度為0.5 mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，20℃、120 r/min誘導(dǎo)10 h。收集菌液，5000 r/min離心收集菌體，稱重，按10 mL/g菌體加入裂解液使其重懸，超聲破菌。破菌液10000 r/min離心收集上清液。用0.45 μm濾膜過濾一次，上樣到已平衡好的Ni-NTA親和層析柱，收集穿透液。用平衡buffer平衡柱子收集平衡液，再用20 mmol/L，200 mmol/L咪唑洗脫，用SDS-PAGE分析純化效果。洗脫液用0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)透析，所得即為干擾素原料。

1.3 PRRSV 的擴(kuò)增

按常規(guī)方法培養(yǎng)Marc-145細(xì)胞，至細(xì)胞長成單層。棄去細(xì)胞培養(yǎng)中的瓶上清液，用PBS(0.01 mol/L)清洗2次。加入1mL提前融化的毒種，37℃吸附1 h，每15 min搖勻一次。棄去病毒液，加入5 mL含2%小牛血清的DMEM維持液，37℃繼續(xù)培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞病變情況，當(dāng)80%細(xì)胞產(chǎn)生病變時(shí)，反復(fù)凍融3～4次，吹散并分裝到無菌Eppendorf離心管中，－80℃保存。

1.4 PRRSV的細(xì)胞培養(yǎng)半數(shù)感染量 CCID50測定

將細(xì)胞消化成單個細(xì)胞，加10%完全培養(yǎng)基吹打成細(xì)胞懸液。計(jì)數(shù)并稀釋至每毫升含105個細(xì)胞。以每孔100 μL懸液接種到96孔板，邊緣孔各加100 μL無菌水或PBS。待細(xì)胞長滿孔底，棄去上清，用PBS洗去殘余血清，2號列加入無血清培養(yǎng)基，3～11列分別加入10倍系列稀釋的病毒液。37℃吸附1h，棄去上清，每孔加入100 μL維持液。37℃培養(yǎng)觀察，當(dāng)最高濃度孔細(xì)胞80%以上發(fā)生病變時(shí)，讀取每個稀釋度發(fā)生病變的孔數(shù)并做記錄，按Reed-Muench法［4］計(jì)算公式計(jì)算病毒 CCID50。

1.5 干擾素活性測定［5］

保存的干擾素用含7%血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋至31.84 μg/mL，并做4倍系列稀釋，共7個稀釋度。取病毒液，稀釋至100倍CCID50。96孔板培養(yǎng)細(xì)胞同上。將孔板按以下程序進(jìn)行實(shí)驗(yàn):棄去上清，每孔加梯度稀釋的干擾素100 μL作用18 h，然后洗去殘余血清，每孔加100 μL病毒稀釋液攻毒1 h，換維持液，37℃培養(yǎng)觀察。96孔板布局如下(邊緣孔加無菌水):2號列做空白對照;3號列為干擾素組，不加病毒;4號列為病毒組，不加干擾素;5～11列為實(shí)驗(yàn)組。72 h后讀取每個稀釋度發(fā)生病變的孔數(shù)并做記錄，按Reed-Muench法計(jì)算干擾素活性。

1.6 凍干保護(hù)劑的篩選

1.6.1 分裝

按照配方配制干擾素溶液，在潔凈層流局部100級超凈臺中，用0.22 μm濾膜除菌過濾，分裝在潔凈的青霉素瓶中，每瓶分裝4 mL。

1.6.2 凍干

－80℃預(yù)凍3 h，放入已調(diào)試好的凍干機(jī)中進(jìn)行凍干。48 h后取出樣品，－20℃保存。

1.6.3 凍干成品測定

①外觀檢查:應(yīng)為白色疏松體，骨架成型好;② 體外活性測定:凍干成品溶解后，按照1.5節(jié)方案進(jìn)行活性測定。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 干擾素的制備

SDS-PAGE電泳膠經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)掃描，干擾素條帶位置與前期研究結(jié)果一致(圖1)。干擾素在200 mmol洗脫液中純度可達(dá)到90%以上。通過Bradford法測定，200 mmol洗脫液中蛋白濃度為3.79 mg/mL，干擾素表達(dá)量達(dá)到每升菌液121.28 mg，占菌體總蛋白的30%以上，實(shí)現(xiàn)了干擾素的高效表達(dá)。

2.2 PRRSV 增殖

細(xì)胞在接種病毒后發(fā)生皺縮，形成網(wǎng)狀隆起且病變逐漸增多，如圖2所示。

2.3 PRRSV 的 CCID50的測定

PRRSV感染Marc-145細(xì)胞的情況(見表1)，細(xì)胞對照組均無細(xì)胞病變。計(jì)算得增殖的PRRSV的 CCID50為10－5.5/0.1 mL。利用 Marc －145 細(xì)胞成功獲得了高滴度的PRRSV。

圖1 干擾素蛋白SDS-PAGE電泳

圖2 接種病毒后與正常細(xì)胞對比

表1 PRRSV感染Marc－145細(xì)胞觀察結(jié)果

2.4 重組豬IFN-α活性測定

記錄重組豬α干擾素對Marc-145細(xì)胞病變保護(hù)的結(jié)果如表2所示。按Reed-Muench法計(jì)算干擾素的比活性為4.41×105U/mg，細(xì)胞對照組均未發(fā)生病變，病毒對照組均出現(xiàn)病變，達(dá)到了《中華人民共和國獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》的要求。

表2 重組豬α干擾素對Marc-145細(xì)胞病變保護(hù)的結(jié)果

2.5 凍干保護(hù)劑篩選

2.5.1 外觀檢查

含1%、3%、5%的甘露醇樣品，表面平整，均勻一致，與空白組沒有明顯區(qū)別;含3%和5%白蛋白的樣品在同樣的條件下出現(xiàn)萎縮;含1%白蛋白的樣品稍微離壁。根據(jù)凍干產(chǎn)品的外觀要求，含3%和5%白蛋白的樣品不再進(jìn)行活性測定。

2.5.2 體外活性測定

經(jīng)過活性測定，3種含量的甘露醇保護(hù)率均在90%以上，而3%甘露醇的保護(hù)率最高。1%白蛋白對干擾素的保護(hù)率僅有73.47%，故選擇3%甘露醇作為凍干保護(hù)劑(表3)。

表3 凍干保護(hù)劑篩選

3 討論與結(jié)論

目前干擾素活性測定的規(guī)定方法是采用WISH/VSV系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞病變抑制法實(shí)驗(yàn)，但也有研究采用 Marc-145/PRRSV系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)［6］。本研究選擇Marc-145/PRRSV系統(tǒng)進(jìn)行活性測定更具有針對性。

對于凍干保護(hù)劑的選擇，應(yīng)力求成本低、無污染、配方簡單［8］。血清白蛋白是經(jīng)典的凍干保護(hù)劑，雖然血液制品的安全性一直限制著血清白蛋白的應(yīng)用［9］，但仍有一些產(chǎn)品使用血清白蛋白作為凍干保護(hù)劑。甘露醇無吸濕性，干燥快，在凍干制品中既可以作為載體又可以作為賦形劑，同時(shí)價(jià)格低廉，生物相容性好。經(jīng)過對比性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)甘露醇對干擾素凍干保護(hù)效率較高，因此選擇甘露醇作為凍干保護(hù)劑。對于凍干工藝的研究，是下一步研究要解決的問題。

本研究中，干擾素蛋白為可溶性表達(dá)，可以在實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)的同時(shí)具有較強(qiáng)的活性，一步純化即可獲得較高純度的產(chǎn)品。經(jīng)保護(hù)率測定，用3%甘露醇作為保護(hù)劑可以有效保護(hù)蛋白活性免受冷凍干燥的影響，對豬α干擾素凍干粉針劑型的進(jìn)一步研究具有很重要的意義。

［1］Susan L，Brockmeier，Crystal L L.The Presence of Alpha Interferon at the Time of Infection Alters the Innate and Adaptive Immune Responses to Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus［J］.Clinical and Vaccine Immunology，2012，19(4):508 －514.

［2］Robert M F.Antiviral Activity of Interferons［J］.Bacteriological Reviews.1977，41(3):543 －567.

［3］蔡家利，戶國達(dá)，孫加燕，等.重組豬IFN-α的構(gòu)建及原核可溶性表達(dá)研究［J］.重慶理工大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2013，27(2):23 －27.

［4］中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.中華人民共和國獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(2001年)［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)科技出版社，2001:附錄314 －315.

［5］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典第三部(2010年)［M］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄 71－72.

［6］王彥彬，黃艷群，崔保安，等.豬α干擾素在桿狀病毒中表達(dá)及其對PRRSV的抑制作用［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2009，29(12):1522 －1526.

［7］段博芳，沈艷萍，楊貴樹，等.PRRSV云南株的分離鑒定［J］.動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，31(4):11 －15.

［8］董世娟，朱于敏，于瑞嵩，等.重組豬干擾素凍干保護(hù)劑的篩選［J］.中國獸藥雜志，2010，44(3):37 －40.

［9］張代寶，吳志明，趙明軍，等.干擾素制劑凍干技術(shù)研究進(jìn)展［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2012，39(8):57 －60.