陳曉雪，于振洋，尹大強

同濟大學環(huán)境科學與工程學院 長江水環(huán)境教育部重點實驗室，上海 200092

環(huán)境濃度水平的鎳對不同生命階段秀麗線蟲(Caenorhabditiselegans)體長與運動的刺激效應

陳曉雪，于振洋，尹大強*

同濟大學環(huán)境科學與工程學院 長江水環(huán)境教育部重點實驗室，上海 200092

毒物興奮效應(hormesis)受到廣泛關注。本文以秀麗線蟲(Caenorhabditis elegans)的L1(自蟲卵開始培養(yǎng)10 h)、L3階段(36 h)和年輕成蟲階段(72 h)為起始暴露階段，進行環(huán)境濃度(3.18E-3、3.18E-2、3.18E-1和3.18 μmol·L-1)水平的72 h 鎳暴露試驗，以體長與行為學指標為終點研究了不同生命階段對毒物興奮效應的影響。在所有暴露濃度下，鎳對L1線蟲的體長均表現(xiàn)出顯著的刺激效應，3個較高濃度下(3.18E-2、3.18E-1和3.18 μmol·L-1)的刺激效應相似，均表現(xiàn)為比空白多23.6%(P<0.05)的水平；L3線蟲的體長在低濃度受到刺激，在高濃度受到抑制，表現(xiàn)為毒物興奮效應；年輕成蟲在所設4個濃度下均沒有顯著響應。在所有暴露濃度下，鎳對L1線蟲的身體彎曲運動無顯著效應；鎳對L3線蟲的身體彎曲頻率表現(xiàn)為刺激效應，并且該刺激效應隨暴露濃度增加，先增加后減小，在3.18E-2 μmol·L-1表現(xiàn)出最大刺激效應，比空白多59.0%(P<0.05)；鎳對年輕成蟲的身體彎曲頻率表現(xiàn)為比空白多17.7%～30.1%(P<0.05)的刺激效應，該刺激效應在不同濃度下不具有顯著性差異。鎳對L1線蟲的倒退運動表現(xiàn)出顯著的、隨暴露濃度增加而增加的刺激效應，在3.18 μmol·L-1表現(xiàn)出最大刺激效應，比空白多187.0%(P<0.05)；鎳對L3線蟲的倒退運動在3.18 μmol·L-1下表現(xiàn)為比空白多22.7%(P<0.05)的刺激效應；鎳對年輕成蟲的倒退運動在較高的3個濃度下(3.18E-2、3.18E-1和3.18 μmol·L-1)表現(xiàn)為比空白多46.7%～86.7%(P<0.05)的刺激效應。研究揭示環(huán)境濃度水平的鎳暴露對不同生命階段秀麗線蟲的體長與運動具有不同程度的刺激效應。

鎳；秀麗線蟲；生命階段；體長；運動；刺激效應

近年來，在低濃度暴露的毒性效應研究中，毒物興奮效應受到越來越多的關注。毒物興奮效應(hormesis)是指有害物質在高劑量時對生物體表現(xiàn)抑制作用，而在低劑量時卻表現(xiàn)為刺激作用(一般表現(xiàn)為比空白增高30%～60%的水平)的兩階段性效應[1]。毒物興奮效應，現(xiàn)在已經(jīng)被認為是廣泛存在、可重現(xiàn)的生物學效應。同時，毒物興奮效應模型是一類不同于傳統(tǒng)的漸近線或線性模型的新模型，這對現(xiàn)有的生態(tài)風險評價提出挑戰(zhàn)，并將在未來風險評價中的標準設定等方面發(fā)揮更為重要的作用[2]。同時，毒物興奮效應，尤其是其對生物學響應的刺激效應，具有通過改變生物適應性，進而影響生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性的潛力[3]，毒物興奮效應也受到生物學、生態(tài)學以及進化學的廣泛關注[4-5]。

大量研究表明，處于不同生命階段的生物體對有害物質具有不同的敏感性，導致同一種物質的生物效應差異顯著。以重金屬鉛和汞為例，Xing等[6]研究了2種金屬對L1階段秀麗線蟲神經(jīng)元缺失的影響，發(fā)現(xiàn)低濃度鉛的神經(jīng)毒性比汞高；而Du等[7]則發(fā)現(xiàn)同樣濃度下汞對L4階段的線蟲的神經(jīng)毒性高于鉛。再如Yu等[8]以L3階段的線蟲為受試生物，并以身體彎曲頻率為指標，發(fā)現(xiàn)鎘會造成線蟲的彎曲頻率明顯下降；另有文獻則報道鎘對L4階段的線蟲身體彎曲頻率影響不明顯[9]。還有學者將青鳉魚的卵暴露于雙酚A 4～8 d后，發(fā)現(xiàn)雙酚A導致魚卵嚴重畸形[10]；而Zha等[11]發(fā)現(xiàn)雙酚A不會使青鳉魚幼魚產(chǎn)生畸形。那么，毒物興奮效應是否會因為受試生物生命階段的不同而不同，尚需要直接的研究予以證實。

本文選擇秀麗線蟲(Caenorhabditis elegans)作為受試生物。秀麗線蟲易于實驗室培養(yǎng)，對環(huán)境變化(溫度、化學物質等)敏感，并且其不同生命階段容易獲得，因而廣泛應用于毒性研究以及新型藥品的探索中[8,12-13]。體長與運動是采用秀麗線蟲進行毒性效應檢測的常用指標。體長，體現(xiàn)的是線蟲整體健康水平，廣泛應用于重金屬的毒性表征[8,14]。同時，秀麗線蟲的運動，可體現(xiàn)線蟲神經(jīng)與肌肉的整體效應，廣泛應用于包括重金屬、藥品等多種物質的毒性效應評價中[8,12-13,15]。

本文采用鎳作為受試物質。鎳是植物和某些動物的必需微量元素[16]，也是人類膳食的自然組成[17]。但是，過量的鎳能夠對生命有機體產(chǎn)生傷害。人類活動導致鎳通過大氣、水以及排泄物等多種方式排入環(huán)境中，甚至能夠在有機體，尤其是植物中富集[18]。目前對鎳的環(huán)境毒性研究以急性暴露的效應為主。鎳對唐魚(Tanichthys albonubes)的96 h半數(shù)致死濃度(LC50)為1.58E+2 μmol·L-1，屬于中毒物質[19]。鎳對秀麗線蟲48 h暴露的LC50為4.36E+2 μmol·L-1[20]；在10.0 μmol·L-1鎳中暴露12 h能夠顯著誘導秀麗線蟲生殖細胞的凋亡[21]。此外，暴露于加標淡水沉積物(鎳濃度≥3.05E+3 μmol·kg-1)會對無脊椎動物(例如Hyalella azteca等)的生長、繁殖與生存產(chǎn)生顯著的負面影響[22]；Vangheluwe等[23]在此基礎上，推薦鎳在沉積物質量標準(reasonable worst case-sediment quality guidelines)中的限值為1.60E+3 μmol·kg-1。但是這些研究所采用的濃度范圍，均遠遠高于環(huán)境以及食品中鎳的濃度。例如，鎳在香禾糯、大米中的含量為6.98、10.7 μmol·kg-1[24]。因此這些研究結果并不能夠用于判斷實際暴露條件下鎳對有機體的生物學效應。

近期的研究表明，鎳在環(huán)境介質(例如太湖的沉積物)中的存在濃度為μmol·kg-1的水平[25]。本文在此濃度下，設定多組鎳濃度水平(3.18E-3、3.18E-2、3.18E-1和3.18 μmol·L-1)，采用秀麗線蟲的L1、L3階段幼蟲與年輕成蟲(自蟲卵開始培養(yǎng)的時間分別為10、36、72 h)為起始暴露階段，進行72 h暴露試驗，以體長與行為學指標為終點研究了不同生命階段對毒物興奮效應的影響。本研究旨在揭示在環(huán)境濃度水平的鎳暴露下，不同生命階段秀麗線蟲的不同程度的毒物興奮效應。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 主要儀器與試劑

儀器：蔡康XTL-3400C型體視顯微鏡(配視頻捕獲設備，上海蔡康光學儀器有限公司)。采用可溶性鎳鹽硝酸鎳(Ni(NO3)2·6H2O)作為暴露體系中鎳的來源，購自上海恒信化學試劑有限公司，純度>98.0%。采用鉀溶液(1 L蒸餾水中，3.00 g氯化鈉，2.36 g氯化鉀；在121 ℃、0.105 MPa滅菌20 min)進行溶解[26]。

1.2 秀麗線蟲的培養(yǎng)

本研究所采用的秀麗線蟲(C. elegans)，由上海復旦大學發(fā)育生物學研究所惠贈。秀麗線蟲采用覆有尿嘧啶缺陷型大腸桿菌(E. coli OP50)的線蟲生長培養(yǎng)基(nematode growth media, NGM)[27]，在22 ℃條件下進行培養(yǎng)；E. coli采用Luria-Bertani培養(yǎng)基在37 ℃恒溫搖床中120 r·min-1進行培養(yǎng)[28]。

1.3 秀麗線蟲的同步化及不同生命階段的獲得

同步化：秀麗線蟲正常培養(yǎng)一段時間后，采用新配制的堿裂解液(Clorox)殺死成蟲，獲得對堿裂解液具有抵抗力的蟲卵[29]，將同步化后得到的卵液接種到覆有大腸桿菌OP50的NGM培養(yǎng)基上，22 ℃恒溫培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)10、36、72 h后，得到相對應L1、L3階段幼蟲及年輕成蟲階段的線蟲[30]。

1.4 暴露試驗

采用24孔板進行不同生命階段線蟲的鎳暴露試驗，設定4個鎳暴露濃度組(3.18E-3、3.18E-2、3.18E-1和3.18 μmol·L-1)和1個空白組；每組占用4孔作為平行。染毒組的每孔中，含有500 μL毒液(含不同濃度梯度的鎳)、300 μL含有食物的鉀溶液以及200 μL不同生命階段的秀麗線蟲；空白組的每孔中，加入500 μL鉀溶液、300 μL含有食物的鉀溶液以及200 μL相應生命階段的秀麗線蟲。線蟲經(jīng)過72 h暴露后，將24孔板中的線蟲轉移到?jīng)]有大腸桿菌OP50覆蓋的NGM培養(yǎng)基上，進行相關指標的檢測，得到鎳對線蟲的毒性效應。

1.5 指標的測定

1.5.1 體長的測定

采用體式顯微鏡配備的圖像捕捉設備對暴露后的秀麗線蟲進行拍照并保存，然后使用上海蔡康光學儀器有限公司發(fā)行的二維測量軟件(DS-3000)進行秀麗線蟲體長的測定。具體測定步驟為：沿秀麗線蟲身體中線從頭部至尾部、再從尾部至頭部劃折線，折線長度的一半即為秀麗線蟲的體長[31]。

1.5.2 行為指標的測定

采用體式顯微鏡配備的視頻捕捉設備對暴露后的秀麗線蟲的運動進行錄像并保存，然后遵循Wang等[9]的研究方法，進行身體彎曲與倒退運動的檢測。身體彎曲(body bending)定義為：如果設定秀麗線蟲的運動方向為x軸方向，則其咽后部球形部分在y軸方向上的運動方向的一次改變，即為一次身體彎曲。倒退運動(reverse movement)：任何從前向后的運動的改變就計數(shù)為一次逆向運動；Omega運動也作為逆向運動的一種。Omega運動：秀麗線蟲的身體通過頭部向尾部的彎曲、形成類似希臘字母Omega(Ω)的形狀而完成180°轉彎，從而使得其運動方向反向的轉向。

1.6 數(shù)據(jù)處理方法

采用軟件Microsoft Office Excel和Origin Pro 7.5軟件對數(shù)據(jù)進行處理，包括正態(tài)性檢驗、平均值計算、顯著性差異分析等內(nèi)容。本研究所采用的數(shù)據(jù)表達方式在未經(jīng)特殊說明的情況下均采用“相對于空白組秀麗線蟲相同指標的百分比(相對空白百分比/%)”的形式表達，圖中數(shù)據(jù)均采用平均值±標準差的方式表達[13]。

2 結果與討論(Results and discussion)

2.1 環(huán)境濃度水平的鎳對不同生命階段秀麗線蟲體長的效應

環(huán)境濃度水平的鎳對不同生命階段秀麗線蟲體長的效應如圖1所示。在暴露濃度下，鎳沒有顯著抑制L1線蟲的體長，相反，表現(xiàn)出顯著的刺激效應，鎳在3.18E-2 μmol·L-1濃度下表現(xiàn)出對線蟲體長的最大刺激效應，比空白多23.6%(P<0.05)。鎳對L3線蟲的體長表現(xiàn)出低濃度刺激、高濃度抑制的效應，鎳在3.18E-2 μmol·L-1濃度下產(chǎn)生的最大刺激效應比空白多10.9%(P<0.05)，在3.18 μmol·L-1濃度下產(chǎn)生的最大抑制效應比空白小15.5%(P<0.05)。鎳在所選濃度范圍內(nèi)對年輕成蟲體長沒有產(chǎn)生顯著影響。

圖1 環(huán)境濃度水平的鎳暴露對不同 生命階段秀麗線蟲體長的效應Fig. 1 Effects of nickel at environmental concentration on body length of nematodes (Caenorhabditis elegans) at different life stages

從結果中可以看出，鎳的刺激效應在L1秀麗線蟲中表現(xiàn)最明顯，L3階段次之，在年輕成蟲中沒有表現(xiàn)；與此同時，高濃度鎳對L3秀麗線蟲具有抑制效應，而對L1和年輕成蟲沒有表現(xiàn)出抑制效應，這說明鎳對L1秀麗線蟲表現(xiàn)為顯著的毒物興奮效應，而對L3線蟲表現(xiàn)為顯著的毒性效應。在Wang等[32]用硫酸鎳進行世代毒性的研究中，鎳在2.5 μmol·L-1濃度下也顯著刺激了秀麗線蟲體長的增加。盡管該研究中未對所采用秀麗線蟲的生命階段進行界定，但是其研究結果與本文中鎳在3.18 μmol·L-1條件下刺激L1秀麗線蟲體長增加的結果相似。然而，不同生命階段對毒物興奮效應的影響機制還不清楚，需要進一步探索。

2.2 環(huán)境濃度水平的鎳對不同生命階段秀麗線蟲運動的效應

環(huán)境濃度水平的鎳對不同生命階段秀麗線蟲身體彎曲頻率的效應如圖2所示。在暴露濃度下，鎳對L1線蟲的身體彎曲沒有顯著影響，鎳對L3線蟲身體彎曲表現(xiàn)為刺激效應，而且這種刺激效應隨著鎳濃度的增加，先增加后減小，在3.18E-02 μmol·L-1條件下表現(xiàn)為比空白多59.0%(P<0.05)的最大刺激水平。鎳對年輕成蟲的身體彎曲表現(xiàn)為一定的刺激效應，該刺激效應在不同濃度之間不具有顯著性的差異，維持在比空白多17.7%～30.1%(P<0.05)的水平。

圖2 環(huán)境濃度水平的鎳對不同生命階段 秀麗線蟲身體彎曲頻率的效應Fig. 2 Effects of nickel at environmental concentration on body bending frequency of nematodes (Caenorhabditis elegans) at different life stages

環(huán)境濃度水平的鎳對不同生命階段秀麗線蟲倒退運動的效應如圖3所示。在暴露濃度下，鎳對L1線蟲的倒退運動產(chǎn)生了顯著的刺激效應，而且該刺激效應隨著暴露濃度的增加而增加，鎳在3.18 μmol·L-1暴露條件下表現(xiàn)出的最大刺激效應比空白多187.0%(P<0.05)。鎳在對較低的3個鎳濃度(3.18E-03、3.18E-02、3.18E-01 μmol·L-1)條件下對L3線蟲的倒退運動無顯著影響，但是在最大暴露濃度(3.18 μmol·L-1)下產(chǎn)生了為比空白多22.7%(P<0.05)的刺激效應。較高的3個鎳濃度(3.18E-02、3.18E-01、3.18 μmol·L-1)對年輕成蟲的倒退運動表現(xiàn)為一定的刺激效應，但是該刺激效應在3個濃度間不具有顯著性的差異，表現(xiàn)為比空白多46.7%～86.7%(P<0.05)的水平。在每一個暴露濃度中，不同生命階段秀麗線蟲倒退運動的順序為：L1 > 年輕成蟲 ≥ L3。

圖3 環(huán)境濃度水平的鎳對不同生命 階段秀麗線蟲倒退運動的效應Fig. 3 Effects of nickel at environmental concentration on reverse movement of nematodes (Caenorhabditis elegans) at different life stages

秀麗線蟲的運動軌跡表現(xiàn)為正弦曲線的形狀，該運動模式通過其體內(nèi)神經(jīng)突觸對背、腹部體壁肌肉的控制完成[33-34]，并且這種運動模式能夠被多種因素改變，例如突變[35]，飲食、產(chǎn)卵與交配等自然行為以及來自于環(huán)境的刺激等。因此，本研究中發(fā)現(xiàn)鎳對行為學指標的抑制效應可能源自于鎳對秀麗線蟲神經(jīng)系統(tǒng)的影響，而且這種效應與生命階段緊密相關。Xing等[6]采用不同生命階段的秀麗線蟲研究鉛和汞的神經(jīng)毒性時，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)毒性與生命階段的相關性，受試物質對L1～L3線蟲的神經(jīng)抑制效應高于L4與年輕成蟲。該研究并沒有發(fā)現(xiàn)刺激效應，可能原因不僅與不同物質的毒性機制有關，而且可能與諸多不同暴露條件的設定有關，例如Xing等[6]采用2.5～20 μmol·L-1的濃度范圍、在無食物條件下進行了6 h的暴露，而本文采用的最高濃度為3.18 μmol·L-1、在有食物條件下進行了72 h的暴露。

鎳在3.18E-3 μmol·L-1(0.187 mg·L-1)濃度下對不同生命階段線蟲體長和運動產(chǎn)生了不同程度的毒物興奮效應，尤其值得注意的是其中的刺激效應。毒物興奮效應的特殊性使其備受爭議。一方面，毒物興奮效應在細菌、植物、動物甚至人類中具有很高的保守性，這些發(fā)現(xiàn)使得這種特殊的效應在疾病的臨床治療、農(nóng)業(yè)/養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展等領域獲得重要應用[2]。另一方面，毒物興奮效應具有通過改變生物適應性，進而影響生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性的潛力[3]。因而，需要在綜合考慮受試物質、受試生物及其生命階段、暴露時間(甚至暴露世代)等多種因素的基礎上，對毒物興奮效應的產(chǎn)生機理展開更為深入、全面、合理的研究[36]。

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StimulationsofNickelatEnvironmentalConcentrationsonLocomotionandGrowthofCaenorhabditiselegansatDifferentLifeStages

Chen Xiaoxue, Yu Zhenyang, Yin Daqiang*

Key Laboratory of Yangtze River Water Environment of Ministry of Education, College of Environmental Science and Engineering, Tongji University, Shanghai 200092, China

18 September 2013accepted5 December 2013

Hormesis is receiving wide attentions. L1 (cultured for 10 h since synchronized eggs), L3 larvae (36 h) and young adult (72 h) of Caenorhabditis elegans were exposed to 3.18E-3, 3.18E-2, 3.18E-1 and 3.18 μmol·L-1of nickel for 72 h to study the hormetic responses of nematodes at different life stages using growth and behavior as endpoints. The body length of L1 nematodes after exposure was significantly stimulated, and the stimulation levels were 23.6% higher than the control (P<0.05), which were similar at the three higher concentrations (3.18E-2, 3.18E-1 and 3.18 μmol·L-1). The body length of L3 nematodes was stimulated at low concentration and inhibited at high concentration, indicating hormetic effects. The body length of young adults was not significantly influenced after exposure to the four concentrations of nickel. The body bending of L1 nematodes was not affected by nickel exposure. The body bending of L3 nematodes was stimulated, and the stimulated levels firstly increased to the maximum of 59.0% higher than the control (P<0.05) at 3.18E-2 μmol·L-1and then deceased with increasing concentration. The body bending of young adult nematodes was stimulated at the levels of 17.7%-30.1% higher than the control (P<0.05), and the stimulation levels had no significant differences among the four exposure concentrations. The reversal movement of L1 nematodes showed significant and concentration-dependent stimulations by nickel exposure, with a maximum of 187.0% higher than the control (P<0.05) at 3.18 μmol·L-1. The reversal movement of L3 nematodes was stimulated at the level of 22.7% higher than the control (P<0.05) at 3.18 μmol·L-1. The reversal movement of young adults increased by 46.7%-86.7% than the control (P<0.05) at the three higher concentrations (3.18E-2, 3.18E-1 and 3.18 μmol·L-1). The body length and l℃omotion movement in nematodes at different life stages showed different degrees of stimulations at environmental concentrations of nickel.

nickel; Caenorhabditis elegans; life stage; body length; l℃omotion; stimulation

國家自然科學基金(21307095)，中國博士后科學基金(2013M540390)

陳曉雪(1987-)，女，學士，研究方向為毒理學，E-mail: cxxxil@163.com；

*通訊作者(Corresponding author)，E-mail: yindq@#edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20130918001

陳曉雪，于振洋，尹大強. 環(huán)境濃度水平的鎳對不同生命階段秀麗線蟲(Caenorhabditis elegans)體長與運動的刺激效應[J]. 生態(tài)毒理學報, 2014, 9(2): 299-305

Chen X X, Yu Z Y, Yin D Q. Stimulations of nickel at environmental concentrations on locomotion and growth of Caenorhabditis elegans at different life stages [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2014, 9(2): 299-305 (in Chinese)

2013-09-18錄用日期2013-12-05

1673-5897(2014)2-299-07

X171.5

A

尹大強(1962—)，男，博士，教授，主要從事污染物生態(tài)效應與毒性機理、化學品生態(tài)與健康風險的研究。