梁清儀　王心儀　孫冬捷等

摘要：通過整體原位雜交和切片原位雜交技術系統(tǒng)全面地比較分析了斑馬魚胚胎四個發(fā)育時期（12、24、48 hpf和4 dpf）和成熟性腺中Sox9a和Sox9b基因的表達模式。結果顯示，兩個Sox9基因在腦和眼中持續(xù)表達，但在耳囊、頭部軟骨、胸鰭芽和體節(jié)中差異性表達。Sox9a特異性地在側線、尾部神經嵴、原腎管和精巢支持細胞中表達，而Sox9b在卵巢的卵黃顆粒中大量表達。與已發(fā)表的研究結果相比，本研究更廣泛地揭示了Sox9a和Sox9b的動態(tài)差異表達模式，且更清楚地顯示了其在性腺中的表達特征。

關鍵詞：Sox9a；Sox9b；斑馬魚；胚胎發(fā)育；成體性腺

中圖分類號：Q959.46+8∶Q786文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2014）07-0020-05

AbstractUsing whole mount and tissue section in situ hybridization techniques， the expression patterns of two Sox9 homologues genes，Sox9a and Sox9b，were comprehensively compared and analyzed in four stages of developing embryo （12， 24， 48 hpf and 4 dpf） and mature gonads of zebrafish （Danio rerio）. The two genes were persistently expressed in brain and eyes，but differentially expressed in otic vesicle， head cartilage， pectoral fin buds and somites. Distinct from high expression of Sox9b in the yolk granules of oocytes， Sox9a was specifically expressed in lateral line， tail neural crest， primary renal tubular and Sertoli cells in testis. Compared with other published results， the present data revealed a more extensive differential expression profile of two Sox9 genes in the developing embryo and gonads of zebrafish.

Key wordsSox9a； Sox9b；Zebrafish（Danio rerio）； Embryonic development； Gonad

Sox9被普遍認為是雄性睪丸決定必須基因，但其功能并不局限于性腺。小鼠胚胎原位雜交試驗顯示，在軟骨形成前和形成時間充質凝聚過程中均表現出較強的Sox9表達，且Sox9的表達模式與Col2a1基因非常相似[1，2]。Sox9缺乏患者會產生一種嚴重的骨骼畸形疾病——軀干發(fā)育異常癥（CD），有時也會導致男性性反轉[3，4]。與人類和鼠類不同的是，斑馬魚基因組存在兩個Sox9同源基因：Sox9a和Sox9b?；驁D譜顯示這兩個基因與四足動物的Sox9基因直系同源，但比四足動物多了一輪基因復制[5，6]。

在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中，Sox9a和Sox9b表達模式有所不同，但在一些區(qū)域如腦、頭骨和鰭中有重疊表達。在成熟的斑馬魚中，Sox9a在許多組織如腦、肌肉、鰭和睪丸中表達，而Sox9b只在卵巢中形成卵黃的卵母細胞中表達[7]。這種表達模式暗示了Sox9a和Sox9b可能在一些特定組織的發(fā)育過程中具有獨特作用。本研究對斑馬魚早期發(fā)育時期Sox9基因的表達模式進行了整體研究，完善了Sox9基因在斑馬魚胚胎發(fā)育中的作用，并進一步確定了Sox9a和Sox9b表達模式的共同點和差異點。

1材料與方法

1.1材料與試劑

試驗用AB品系斑馬魚均來自上海海洋大學海洋生物系統(tǒng)和神經科學研究所，斑馬魚試驗操作均遵守上海海洋大學實驗動物管理條例。在自動循環(huán)系統(tǒng)中飼養(yǎng)，按14 h/10 h晝夜燈控。所用試劑均購自上海生工生物工程有限公司和上海高信化玻有限公司。

本試驗所用引物名稱及序列見表1，引物合成和測序鑒定均由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2.3RNA探針質粒構建將四個基因的PCR產物分別與pEASY-T3 Cloning Kit （北京全式金生物技術有限公司）混勻后加入Trans1-T1感受態(tài)細胞（北京全式金生物技術有限公司）中，靜置、短暫孵育后冰浴，在培養(yǎng)箱內于SOC培養(yǎng)基中短暫培養(yǎng)。取適量菌液涂布于含0.1%Amp的LB培養(yǎng)基平板上，37℃恒溫培養(yǎng)過夜。隔日挑出數個陽性單菌落于含0.1%Amp的LB液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)3 h。吸取適量菌液高速離心去上清，加1 mL蒸餾水，震蕩混勻，沸水浴5 min，高速離心取上清，根據2×Easy Taq PCR SuperMix產品說明書（北京全式金生物技術有限公司）進行PCR擴增以篩選陽性克隆。

從陽性樣本中取出少量菌液培養(yǎng)于含0.1%Amp的LB液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜。隔日取適量菌液高速離心去上清，加入裂解液Ⅰ（50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA）和裂解液Ⅱ（0.2 mol/L NaOH，1%SDS）短暫靜置，加入裂解液Ⅲ（5 mol/L乙酸鉀60 mL，冰乙酸11.5 mL，水28.5 mL）短暫冰浴。高速離心取上清，異丙醇沉淀質粒，70%乙醇洗滌離心，室溫干燥，加適量TE溶解，用于制備RNA探針。

1.2.4RNA探針制備根據2×Easy Taq PCR SuperMix產品說明書（北京全式金生物技術有限公司）對質粒進行PCR擴增（使用M13引物），擴增產物用酚-氯仿法抽提DNA。高速離心取上清，加1/10倍體積醋酸鈉和2倍體積乙醇沉淀DNA，-20℃保存過夜。隔日高速離心去上清，干燥后加入適量RNase-free水保存于-20℃。

取適量上述回收的PCR產物，37℃反應2 h轉錄DIG-RNA，加樣比例為：DNA 1/10，10×DIG RNA Labeling Mix 1/10（Roche），5×Transcription Buffer 2/10，RNase-free water 4/10，Sp6/T7 RNA Polymerase 1/10（Promega），DTT 1/10（Promega）。1倍體積的10 mmol/L EDTA終止反應，用3 mol/L氯化鋰和純乙醇沉淀，-80℃放置30 min。低溫高速離心棄上清，室溫干燥，加入RNase-free水和RNA酶抑制劑（RI），混勻分裝后保存于-80℃。

1.2.5斑馬魚整體胚胎原位雜交部分試驗步驟參考文獻[8]。取受精后12、24、48 h和4 d的胚胎用4%PFA固定，4℃過夜。第二天將胚胎用雙氧水/氫氧化鉀溶液脫色，以25%、50%、75%、100%梯度濃度換液至純甲醇，室溫短暫放置并儲存于-20℃。使用時室溫1×PBT漂洗多次，10 μg/mL蛋白酶K短暫消化，1×PBT漂洗數次，于預雜交液中70℃孵育2～5 h。換液為含30～50 ng探針的雜交液，70℃雜交過夜。第二天在同一溫度下按25%、50%、75%、100%的梯度濃度換液為2×SSC，后用0.2×SSC孵育數次。再以25%、50%、75%、100%的梯度濃度將0.2×SSC換液為1×PBT，置于水平搖床上漂洗。于封閉液中室溫放置3～4 h以封閉非特異結合位點，用含抗地高辛抗體的封閉液4℃過夜。次日在1×PBT中水平搖床室溫漂洗數次，堿性Tris緩沖液浸洗數次?，F配BCIP/NBT顯色液暗處顯色2～5 h。顯色滿意后終止液漂洗數次以終止反應。將胚胎置于純甘油中，對其側面、背面放大拍照。

1.2.6斑馬魚切片原位雜交組織切片原位雜交參見文獻[9]。30日齡的斑馬魚和成魚用1×PBS漂洗數次，4%PFA固定，4℃過夜。次日用乙醇梯度脫水，二甲苯透明，組織浸蠟和包埋，-20℃密封保存蠟塊。使用時用石蠟切片機取得組織切片，攤片、烤片后37℃恒溫干燥箱過夜烘干。二甲苯脫蠟，乙醇梯度復水，0.1% Tween 20 于PBS （1×PBT）中孵育多次，蛋白酶K短暫消化后用甘氨酸終止。將玻片轉移到PBT染缸漂洗數次后，5×SSC于55℃短暫平衡。預雜交液孵育3 h，換液為適量雜交液于65℃濕盒中雜交過夜。次日在65℃先后用2×SSCT和0.1×SSCT漂洗兩次，將玻片轉移到PBT中室溫漂洗數次。加封閉液封閉1 h，加入地高辛-堿性磷酸酶（AP）結合物，濕盒孵育2 h。PBS漂洗數次，堿性磷酸酶緩沖液浸洗3次，現配BCIP/NBT顯色液過夜顯色。顯色滿意后用PBT浸洗數次以終止反應，蒸餾水沖洗后用梯度乙醇和二甲苯脫水，封片后用顯微鏡觀察性腺并拍照。

2 結果與分析

2.1斑馬魚早期胚胎整體原位雜交

2.1.1斑馬魚12 hpf胚胎（5-somite stage）由圖1 A～D（見本期封三圖版）可知，出現Sox9a和Sox9b基因信號的部位相近，主要分布在還未發(fā)育成型的眼原基、腦原基、頭部的預遷移神經嵴、體軸上的神經板和中胚層中。雖然兩者表達部位相近，但Sox9a信號的表達量明顯低于Sox9b。

2.1.2斑馬魚24 hpf胚胎（prim-5）Sox9a基因在眼、腦（包含間腦、中腦、小腦、后腦菱節(jié)和腦底板）、耳囊、背部和尾部神經嵴、側線原基、表皮以及原腎管中大量表達。Sox9b主要表達在眼、腦（也包含間腦、中腦、小腦、后腦菱節(jié)和腦底板）、耳囊、背部神經嵴與表皮中（圖1 E～H，見本期封三圖版）。Sox9b在胚胎腦的區(qū)域表達較Sox9a多，但在側線原基和尾部神經嵴上不表達或極少表達。

2.1.3斑馬魚48 hpf胚胎（high pec）孵化期胚胎顎原基開始分化成軟骨。Sox9a和Sox9b基因信號位置相似（圖1 I～L，見本期封三圖版），包括眼、腦（主要是間腦）、頜軟骨（鄂弓、舌弓和鰓弓）、鰭芽和體節(jié)。Sox9a在胚胎頭部的表達量略高于Sox9b，但在體節(jié)處的表達量則相反。

2.1.4斑馬魚4 dpf胚胎（early larval period）Sox9a基因主要表達于眼、腦、耳囊、下頜、胸鰭以及肝臟中。Sox9b較前者腦部信號表達量較多，并且除了眼、耳囊、下頜、胸鰭和肝臟外，胚胎體側肌肉中也觀察到適量的Sox9b表達信號（圖1 M～P，見本期封三圖版）。

綜合斑馬魚胚胎整體原位雜交試驗結果發(fā)現，Sox9a/b基因在四個胚胎早期發(fā)育時期的眼和腦中都有一定表達。對比受精后12 h與24 h的胚胎，Sox9a/b隨著神經嵴細胞從胚胎頭部遷移到胚胎背部以及尾部，并且在頭部（腦）的表達信號比較晚期胚胎的信號要強、范圍要大。48 hpf胚胎顎原基開始分化成軟骨，觀察到Sox9a/b在顎軟骨分化中的表達。48 hpf及之后的胚胎在胸鰭發(fā)育中有較強的Sox9a/b基因表達信號。4 dpf胚胎在肝臟部位具有較強的信號表達。

2.2斑馬魚性腺切片原位雜交

結果顯示，斑馬魚受精后30日齡性腺正處在類卵巢向精巢轉變時期，其間質細胞（未分化性腺細胞間的支持細胞）大量表達Sox9a，呈彌散型分布（圖2 A，見本期封三圖版）。

與Sox9a相反，Sox9b只在成熟斑馬魚卵巢中表達。在成熟卵巢細胞中，Sox9b基因大量表達于卵母細胞中的卵黃顆粒位置（卵黃顆粒是細胞里的一種油脂狀結構），且大多分布于體積較大的卵母細胞中（圖2 B，見本期封三圖版）。

為了證明切片原位雜交探針的特異性和雜交信號細胞定位的準確性，我們同時檢測了精巢支持細胞標志基因amh和卵巢濾泡細胞標志基因cyp19a的表達分布。結果發(fā)現，amh在成熟的斑馬魚卵巢細胞中不表達（圖2 C，見本期封三圖版）；而cyp19a基因在成熟卵巢切片中有較強的表達信號，且信號集中在卵母細胞周圍的濾泡細胞中（圖2 D，見本期封三圖版）。

3結論與討論

本試驗對斑馬魚Sox9的兩個同源基因在早期胚胎發(fā)育時期的表達位置和表達信號強弱進行了觀察和對比。發(fā)現在12 hpf和48 hpf的胚胎中，Sox9a和Sox9b的信號表達區(qū)域相似。24 hpf時，Sox9基因開始出現在表皮和體神經嵴上。其中Sox9a表達范圍比Sox9b大，除了共同表達在頭部、背部神經嵴和表皮外，Sox9a基因還在尾部神經嵴上有十分強的信號，并且在原腎管和側線原基上也有一定量的表達。受精后4 d的胚胎中，雖然兩同源基因表達位置較近，但可以觀察到Sox9b在胚胎腦和尾部肌肉中有相對較高的表達信號。先前關于斑馬魚兩個Sox9基因的研究主要集中于胚胎早期面部軟骨、腦、胸鰭發(fā)育以及感受器官上[7，12]。本試驗在觀察兩個Sox9基因在胚胎頭部（包括腦、眼和耳囊）、胸鰭以及顎軟骨中表達的同時，也觀察了它們在尾部神經嵴、原腎管、表皮、側線原基和部分肌肉中的表達。

在斑馬魚性腺發(fā)育的早期，不論遺傳上的性別是雌性或雄性，所有個體都先形成未分化的類似卵巢的性腺結構。20日齡后雄性仔魚未分化的性腺逐漸轉變?yōu)榫?。這種在生殖腺中隨著卵巢樣組織逐漸呈現出精巢表現型時卵母細胞逐漸消失的現象是由細胞凋亡所引起的[13～16]。在斑馬魚類卵巢性腺向精巢轉變的階段中，原本分布于性腺細胞群周圍的支持細胞逐漸遷移到了卵泡細胞間，并且包圍住卵泡細胞。隨后卵泡細胞由規(guī)則的圓形變得形狀不規(guī)則，細胞開始出現凋亡的特征，圓形的“卵巢”形狀將逐漸變得細長。最后，性腺中的“卵母細胞”會全部消失，性腺的形狀也變成前后粗細相近的棒狀的精巢形狀[17]。在哺乳動物性腺分化時期，Sox9基因缺失會導致雄性性逆轉，說明該基因在雄性發(fā)育路徑的重要性。Sox9被認為在精巢中為上游調控基因，在卵巢中為下游基因[18～20]。在斑馬魚中，Sox9的功能被Sox9a和Sox9b取代。從本試驗結果觀察到，性腺分化時期Sox9a大量表達于支持細胞中，并且這些支持細胞包裹在未分化性腺的卵泡單個細胞周圍，形成一種類似細胞包裹體的結構。這個結果支持斑馬魚性腺分化時Sox9a基因可能通過在支持細胞中的表達抑制類卵巢中卵泡細胞Sox9b的表達而導致其凋亡。有研究通過RT-PCR發(fā)現精巢中只有Sox9a基因的表達，卵巢中只有Sox9b基因的表達[7]。本試驗通過組織切片觀察到Sox9b并不是表達在整個卵巢細胞中，而是表達于卵母細胞中的卵黃顆粒上。

致謝：感謝上海海洋大學海洋生物系統(tǒng)和神經科學研究所老師和同學對我們在課題研究上的技術幫助。

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