王庶+文慧+姚晶+盧永昌

摘要：對(duì)寬筋藤（Tinospora sinensis）多糖進(jìn)行提取純化研究，采用正交試驗(yàn)確定了影響寬筋藤多糖的提取因素主次順序?yàn)樘崛囟?、提取時(shí)間、料液比，即在提取溫度為90 ℃，提取90 min，料液比1∶10（m/V， g∶mL）的條件下提取，寬筋藤粗多糖提取率為3.94%，其中還原性多糖含量為20.40%，蛋白質(zhì)含量為8.21%；去除蛋白質(zhì)的方法中TCA法最適宜寬筋藤粗多糖的純化，能去除86.83%的蛋白質(zhì)，還原性多糖保留率為68.67%。

關(guān)鍵詞：寬筋藤（Tinospora sinensis）；多糖；蛋白質(zhì)；TCA法

中圖分類號(hào)：R284.2；O657.32文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：0439-8114（2014）10-2389-03

Extraction and Purification of Tinospora sinensis Polysaccharide

WANG Shu，WEN Hui，YAO Jing，LU Yong-chang

（College of Chemistry and Life Sciences，Qinghai University for Nationalities，Xining 810007，China）

Abstract： To study the extraction and purification of the polysaccharide from Tinospora sinensis，the extraction temperature， extraction timeand solid-liquid ratio was determined by phenol-sulfuric acid method. The optimal conditions were temperature 90 ℃， extracting 90 min twice with solid-liquid ratio 1∶10. The extraction rate of polysaccharide from Tinospora sinensis was 3.94%. The content of polysaccharide was 20.40%. The content of protein was 8.21%. The removal rate of protein was 86.83% and the retention rate of polysaccharide was 68.67% by TCA method.

Key words： Tinospora sinensis； polysaccharides； protein； TCA method

基金項(xiàng)目：青海省科技廳國(guó)際交流項(xiàng)目（2012-H-811）

寬筋藤（Tinospora sinensis）為防己科青牛膽屬植物中華青牛膽（Tinospora sinensis）的莖，是藏藥中的常用藥材。藏藥藥典《晶珠本草》中記載，其功效為清除隆熱癥[1，2]。多糖是構(gòu)成生命的基本物質(zhì)之一，近年來(lái)大量研究表明，植物多糖具有提高機(jī)體免疫功能，抗腫瘤，抗病毒，抗凝血，抗衰老等作用[3-10]。目前關(guān)于寬筋藤多糖的提取純化研究鮮見(jiàn)報(bào)道，本研究通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)探討了寬筋藤多糖的最佳提取條件，比較了Sevag法、TCA法，TCA-正丁醇法等對(duì)寬筋藤粗多糖中蛋白質(zhì)的去除效果，為寬筋藤多糖的進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)利用打好基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1儀器、試劑與材料

T6型新銳可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器）；KQ-300B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；AL204型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；SHBIII型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司），EYELA-N1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛(ài)明儀器有限公司），TD3型低速離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）。

葡萄糖，牛血清白蛋白，苯酚，硫酸，考馬斯亮藍(lán)G，磷酸，無(wú)水乙醇，氯化鈉，三氯乙酸，正丁醇，氯仿均為分析純。

寬筋藤于2012年9月采自青海省互助北山，經(jīng)青海民族大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院毛繼祖教授鑒定為藏藥寬筋藤。

1.2方法

1.2.1比色法測(cè)定還原性多糖及蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

1）標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。精確稱取經(jīng)105 ℃干燥至恒重的葡萄糖0.100 0 g定容至100 mL容量瓶中，得1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，從中準(zhǔn)確移取10 mL定容至100 mL，得0.1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)操作液。

精密稱取0.100 0 g牛血清白蛋白，用0.15 mol/L NaCl溶液定容至100 mL容量瓶中，得1 mg/mL蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，從中準(zhǔn)確移取10 mL定容至100 mL，得0.1 mg/mL蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)操作液。

2）還原性多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定。采用苯酚-硫酸法，分別移取0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、1.0 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)操作液置于10 mL容量瓶中并用去離子水補(bǔ)充至1 mL，加入2 mL 5%苯酚溶液，用98%濃硫酸定容至10 mL，搖勻，沸水浴加熱20 min后冷卻至室溫。以0 mL空白對(duì)照作為參比溶液，用1 cm比色皿在490 nm處測(cè)定吸光度A，以吸光度A為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度c為橫坐標(biāo)，得到回歸方程為Y（A）=0.009+6.002X（c），R2=0.998 4。結(jié)果表明，葡萄糖在0.01～0.10 mg/mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

3）蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定。采用考馬斯亮藍(lán)法，分別移取0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)操作液置于10 mL容量瓶中并用0.15 mol/L NaCl溶液補(bǔ)充至1 mL，加入5 mL考馬斯亮藍(lán)溶液（稱取100 mg考馬斯亮藍(lán)溶于50 mL 95%乙醇中，加入100 mL 85%磷酸，用去離子水定容至1 L），靜置10 min。以0 mL空白對(duì)照作為參比溶液，用1 cm比色皿，在595 nm處測(cè)定吸光度A，以吸光度A為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度c為橫坐標(biāo)，得到回歸方程為Y（A）=0.002+6.084X（c），R2=0.995 3。結(jié)果表明，蛋白質(zhì)在0.01～0.10 mg/mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

1.2.2寬筋藤多糖的提取及含量測(cè)定準(zhǔn)確稱取10.00 g寬筋藤粉末，用100 mL石油醚超聲脫脂2次，過(guò)濾，加入100 mL去離子水在90 ℃下熱回流提取90 min，提取兩次，過(guò)濾，合并兩次濾液并濃縮至30 mL，加入70 mL無(wú)水乙醇，靜置8 h，過(guò)濾得寬筋藤粗多糖。粗多糖提取率按公式（1）計(jì)算。

粗多糖提取率=×100%（1）

其中，m1為過(guò)濾所得粗多糖質(zhì)量，m2為取用寬筋藤藥材質(zhì)量。

將寬筋藤粗多糖重新溶解并定容至250 mL，移取0.10 mL置于10 mL容量瓶中并用去離子水補(bǔ)充至1 mL，加入2 mL 5%苯酚溶液，用98%濃硫酸定容至10 mL。以空白對(duì)照為參比溶液，用1 cm比色皿在490 nm處測(cè)定吸光度A。寬筋藤還原性多糖含量按公式（2）計(jì)算。

寬筋藤還原性多糖含量=（2）

其中，A1為吸光度，V1為稀釋體積。

移取上述0.50 mL寬筋藤粗多糖溶液液置于10 mL容量瓶中并用0.15 mol/L NaCl溶液補(bǔ)充至1 mL，加入5 mL考馬斯亮藍(lán)溶液靜置10 min。以0 mL空白對(duì)照作為參比溶液，用1 cm比色皿，在595 nm處測(cè)定吸光度A2。寬筋藤蛋白質(zhì)含量按公式（3）計(jì)算。

寬筋藤蛋白質(zhì)含量= （3）

其中，A2為吸光度，V2為稀釋體積。

1.2.3正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)選擇提取溫度，提取時(shí)間，料液比作為考察因素，各因素下設(shè)3個(gè)水平（表1），按L9（34）設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，以還原性多糖質(zhì)量作為標(biāo)準(zhǔn)確定最佳提取條件。

1.2.4Sevag法等對(duì)寬筋藤粗多糖中蛋白質(zhì)的去除

1）稱取0.203 4 g寬筋藤粗多糖粉末定容至200 mL容量瓶中，測(cè)定其中還原性多糖與蛋白質(zhì)質(zhì)量。

2）Sevag法去除蛋白。移取25 mL上述溶液加入5 mL氯仿、1 mL正丁醇混合液進(jìn)行萃取操作，分液，重復(fù)6次，將水相濃縮后重新用去離子水定容至25 mL容量瓶中，測(cè)定其中還原性多糖與蛋白質(zhì)質(zhì)量。

3）TCA法除蛋白。移取25 mL上述溶液加入25 mL 10%三氯乙酸溶液，靜置一夜，離心去除沉淀，將溶液濃縮后重新用去離子水定容至25 mL容量瓶中，測(cè)定其中還原性多糖與蛋白質(zhì)質(zhì)量。

4）TCA-正丁醇法除蛋白。移取25 mL上述溶液加入5 mL 10%三氯乙酸溶液、20 mL正丁醇混合液進(jìn)行萃取操作，分液，將水相濃縮后重新用去離子水定容至25 mL容量瓶中，測(cè)定其中還原性多糖與蛋白質(zhì)質(zhì)量。

蛋白質(zhì)去除率=×100%

其中，m1為寬筋藤粗多糖中總蛋白質(zhì)的質(zhì)量，m2為去除蛋白質(zhì)后寬筋藤粗多糖中蛋白質(zhì)的質(zhì)量。

還原性多糖保留率=×100%

其中，m3為寬筋藤粗多糖中還原性多糖的質(zhì)量，m4為去除蛋白質(zhì)后寬筋藤粗多糖中還原性多糖的質(zhì)量。

2結(jié)果與分析

2.1寬筋藤多糖的最佳提取條件

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知各因素對(duì)多糖提取率的影響依次為提取溫度、提取時(shí)間、料液比（m/V，g：mL）。最佳提取組合為A3B3C2，即提取溫度90 ℃、提取時(shí)間90 min、料液比1∶10，此條件下寬筋藤粗多糖提取率為3.94%，其中還原性多糖含量為20.40%，蛋白質(zhì)含量為8.21%。

2.2Sevag法等對(duì)寬筋藤多糖中蛋白質(zhì)的去除效果

未除去蛋白質(zhì)的寬筋藤粗多糖溶液中還原性多糖含量為20.40%，蛋白質(zhì)含量為8.21%。Sevag法處理寬筋藤粗多糖溶液6次后，蛋白質(zhì)去除率為43.11%，還原性多糖保留率為83.86%；TCA法處理寬筋藤粗多糖溶液后，蛋白質(zhì)去除率為86.83%，還原性多糖保留率為68.67%；TCA-正丁醇法處理寬筋藤粗多糖溶液后，蛋白質(zhì)去除率為56.29%，還原性多糖保留率為65.06%。試驗(yàn)結(jié)果表明，TCA-正丁醇法去除蛋白質(zhì)效果較差，多糖保留率也較低。Sevag法雖多糖保留較多，但去除蛋白質(zhì)效果較差，且操作繁瑣。TCA法能有效去除寬筋藤粗多糖中的蛋白質(zhì)，相對(duì)多的保留多糖組分，操作簡(jiǎn)單。

3小結(jié)

試驗(yàn)確定了寬筋藤多糖的最優(yōu)提取條件，即提取溫度90 ℃、提取時(shí)間90 min、料液比1∶10，此條件下寬筋藤粗多糖的提取率為3.94%，其中還原性多糖含量為20.40%，蛋白質(zhì)含量為8.21%。去除蛋白質(zhì)的方法中TCA法最適宜寬筋藤粗多糖的純化，能去除86.83%的蛋白質(zhì)，還原性多糖保留率68.67%。

參考文獻(xiàn)：

[1] 帝瑪爾·丹增彭措.晶珠本草[M].毛繼祖，譯.上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，2012.329.

[2] 鐘 文，翟 瑤，盧永昌.藏藥寬筋藤中總黃酮和蘆丁含量的測(cè)定[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，52（9）：2151-2152，2170.

[3] 孫文平.三種藥用植物類水溶性多糖對(duì)小鼠免疫調(diào)節(jié)作用及其規(guī)律的研究[D].遼寧大連：大連醫(yī)科大學(xué)，2006.

[4] ZHU X L， CHEN A F， LIN Z B. Ganoderma lucidum polysaccharides enhance the function of immunological effector cells in immunosuppressed mice[J]. Journal of Ethnopharmacology，2007，111（2）：219-226.

[5] 趙俊霞.刺五加多糖對(duì)人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞的抑制作用及免疫調(diào)節(jié)作用研究[D].石家莊：河北醫(yī)科大學(xué)，2008.

[6] CHEN H，QI X D.Study on the effect of polysaccharides from solanum nigrum linne on cellular immune function in tumour-bearing mice[J].Afr J TraditComplement Altern Med，2013，10 （4）：41-46.

[7] 張紅英.3種植物多糖抗豬藍(lán)耳病病毒及免疫增強(qiáng)作用研究[D].鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[8] 高秀妹.四種植物多糖抑菌抗病毒作用及其對(duì)波氏桿菌免疫增強(qiáng)作用的比較研究[D].山東泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[9] 馮以明.四種綠藻多糖的提取分離及其結(jié)構(gòu)與抗凝活性研究[D].山東青島：中國(guó)海洋大學(xué)，2012.

[10] CAI W R，XIE L L，CHEN Y，et al.Purification，characterization and anticoagulant activity of the polysaccharides from green tea[J].Carbohydrate Polymers，2013，92（2）：1086-1090.

1.2.2寬筋藤多糖的提取及含量測(cè)定準(zhǔn)確稱取10.00 g寬筋藤粉末，用100 mL石油醚超聲脫脂2次，過(guò)濾，加入100 mL去離子水在90 ℃下熱回流提取90 min，提取兩次，過(guò)濾，合并兩次濾液并濃縮至30 mL，加入70 mL無(wú)水乙醇，靜置8 h，過(guò)濾得寬筋藤粗多糖。粗多糖提取率按公式（1）計(jì)算。

粗多糖提取率=×100%（1）

其中，m1為過(guò)濾所得粗多糖質(zhì)量，m2為取用寬筋藤藥材質(zhì)量。

將寬筋藤粗多糖重新溶解并定容至250 mL，移取0.10 mL置于10 mL容量瓶中并用去離子水補(bǔ)充至1 mL，加入2 mL 5%苯酚溶液，用98%濃硫酸定容至10 mL。以空白對(duì)照為參比溶液，用1 cm比色皿在490 nm處測(cè)定吸光度A。寬筋藤還原性多糖含量按公式（2）計(jì)算。

寬筋藤還原性多糖含量=（2）

其中，A1為吸光度，V1為稀釋體積。

移取上述0.50 mL寬筋藤粗多糖溶液液置于10 mL容量瓶中并用0.15 mol/L NaCl溶液補(bǔ)充至1 mL，加入5 mL考馬斯亮藍(lán)溶液靜置10 min。以0 mL空白對(duì)照作為參比溶液，用1 cm比色皿，在595 nm處測(cè)定吸光度A2。寬筋藤蛋白質(zhì)含量按公式（3）計(jì)算。

寬筋藤蛋白質(zhì)含量= （3）

其中，A2為吸光度，V2為稀釋體積。

1.2.3正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)選擇提取溫度，提取時(shí)間，料液比作為考察因素，各因素下設(shè)3個(gè)水平（表1），按L9（34）設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，以還原性多糖質(zhì)量作為標(biāo)準(zhǔn)確定最佳提取條件。

1.2.4Sevag法等對(duì)寬筋藤粗多糖中蛋白質(zhì)的去除

1）稱取0.203 4 g寬筋藤粗多糖粉末定容至200 mL容量瓶中，測(cè)定其中還原性多糖與蛋白質(zhì)質(zhì)量。

2）Sevag法去除蛋白。移取25 mL上述溶液加入5 mL氯仿、1 mL正丁醇混合液進(jìn)行萃取操作，分液，重復(fù)6次，將水相濃縮后重新用去離子水定容至25 mL容量瓶中，測(cè)定其中還原性多糖與蛋白質(zhì)質(zhì)量。

3）TCA法除蛋白。移取25 mL上述溶液加入25 mL 10%三氯乙酸溶液，靜置一夜，離心去除沉淀，將溶液濃縮后重新用去離子水定容至25 mL容量瓶中，測(cè)定其中還原性多糖與蛋白質(zhì)質(zhì)量。

4）TCA-正丁醇法除蛋白。移取25 mL上述溶液加入5 mL 10%三氯乙酸溶液、20 mL正丁醇混合液進(jìn)行萃取操作，分液，將水相濃縮后重新用去離子水定容至25 mL容量瓶中，測(cè)定其中還原性多糖與蛋白質(zhì)質(zhì)量。

蛋白質(zhì)去除率=×100%

其中，m1為寬筋藤粗多糖中總蛋白質(zhì)的質(zhì)量，m2為去除蛋白質(zhì)后寬筋藤粗多糖中蛋白質(zhì)的質(zhì)量。

還原性多糖保留率=×100%

其中，m3為寬筋藤粗多糖中還原性多糖的質(zhì)量，m4為去除蛋白質(zhì)后寬筋藤粗多糖中還原性多糖的質(zhì)量。

2結(jié)果與分析

2.1寬筋藤多糖的最佳提取條件

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知各因素對(duì)多糖提取率的影響依次為提取溫度、提取時(shí)間、料液比（m/V，g：mL）。最佳提取組合為A3B3C2，即提取溫度90 ℃、提取時(shí)間90 min、料液比1∶10，此條件下寬筋藤粗多糖提取率為3.94%，其中還原性多糖含量為20.40%，蛋白質(zhì)含量為8.21%。

2.2Sevag法等對(duì)寬筋藤多糖中蛋白質(zhì)的去除效果

未除去蛋白質(zhì)的寬筋藤粗多糖溶液中還原性多糖含量為20.40%，蛋白質(zhì)含量為8.21%。Sevag法處理寬筋藤粗多糖溶液6次后，蛋白質(zhì)去除率為43.11%，還原性多糖保留率為83.86%；TCA法處理寬筋藤粗多糖溶液后，蛋白質(zhì)去除率為86.83%，還原性多糖保留率為68.67%；TCA-正丁醇法處理寬筋藤粗多糖溶液后，蛋白質(zhì)去除率為56.29%，還原性多糖保留率為65.06%。試驗(yàn)結(jié)果表明，TCA-正丁醇法去除蛋白質(zhì)效果較差，多糖保留率也較低。Sevag法雖多糖保留較多，但去除蛋白質(zhì)效果較差，且操作繁瑣。TCA法能有效去除寬筋藤粗多糖中的蛋白質(zhì)，相對(duì)多的保留多糖組分，操作簡(jiǎn)單。

3小結(jié)

試驗(yàn)確定了寬筋藤多糖的最優(yōu)提取條件，即提取溫度90 ℃、提取時(shí)間90 min、料液比1∶10，此條件下寬筋藤粗多糖的提取率為3.94%，其中還原性多糖含量為20.40%，蛋白質(zhì)含量為8.21%。去除蛋白質(zhì)的方法中TCA法最適宜寬筋藤粗多糖的純化，能去除86.83%的蛋白質(zhì)，還原性多糖保留率68.67%。

參考文獻(xiàn)：

[1] 帝瑪爾·丹增彭措.晶珠本草[M].毛繼祖，譯.上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，2012.329.

[2] 鐘 文，翟 瑤，盧永昌.藏藥寬筋藤中總黃酮和蘆丁含量的測(cè)定[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，52（9）：2151-2152，2170.

[3] 孫文平.三種藥用植物類水溶性多糖對(duì)小鼠免疫調(diào)節(jié)作用及其規(guī)律的研究[D].遼寧大連：大連醫(yī)科大學(xué)，2006.

[4] ZHU X L， CHEN A F， LIN Z B. Ganoderma lucidum polysaccharides enhance the function of immunological effector cells in immunosuppressed mice[J]. Journal of Ethnopharmacology，2007，111（2）：219-226.

[5] 趙俊霞.刺五加多糖對(duì)人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞的抑制作用及免疫調(diào)節(jié)作用研究[D].石家莊：河北醫(yī)科大學(xué)，2008.

[6] CHEN H，QI X D.Study on the effect of polysaccharides from solanum nigrum linne on cellular immune function in tumour-bearing mice[J].Afr J TraditComplement Altern Med，2013，10 （4）：41-46.

[7] 張紅英.3種植物多糖抗豬藍(lán)耳病病毒及免疫增強(qiáng)作用研究[D].鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[8] 高秀妹.四種植物多糖抑菌抗病毒作用及其對(duì)波氏桿菌免疫增強(qiáng)作用的比較研究[D].山東泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[9] 馮以明.四種綠藻多糖的提取分離及其結(jié)構(gòu)與抗凝活性研究[D].山東青島：中國(guó)海洋大學(xué)，2012.

[10] CAI W R，XIE L L，CHEN Y，et al.Purification，characterization and anticoagulant activity of the polysaccharides from green tea[J].Carbohydrate Polymers，2013，92（2）：1086-1090.

1.2.2寬筋藤多糖的提取及含量測(cè)定準(zhǔn)確稱取10.00 g寬筋藤粉末，用100 mL石油醚超聲脫脂2次，過(guò)濾，加入100 mL去離子水在90 ℃下熱回流提取90 min，提取兩次，過(guò)濾，合并兩次濾液并濃縮至30 mL，加入70 mL無(wú)水乙醇，靜置8 h，過(guò)濾得寬筋藤粗多糖。粗多糖提取率按公式（1）計(jì)算。

粗多糖提取率=×100%（1）

其中，m1為過(guò)濾所得粗多糖質(zhì)量，m2為取用寬筋藤藥材質(zhì)量。

將寬筋藤粗多糖重新溶解并定容至250 mL，移取0.10 mL置于10 mL容量瓶中并用去離子水補(bǔ)充至1 mL，加入2 mL 5%苯酚溶液，用98%濃硫酸定容至10 mL。以空白對(duì)照為參比溶液，用1 cm比色皿在490 nm處測(cè)定吸光度A。寬筋藤還原性多糖含量按公式（2）計(jì)算。

寬筋藤還原性多糖含量=（2）

其中，A1為吸光度，V1為稀釋體積。

移取上述0.50 mL寬筋藤粗多糖溶液液置于10 mL容量瓶中并用0.15 mol/L NaCl溶液補(bǔ)充至1 mL，加入5 mL考馬斯亮藍(lán)溶液靜置10 min。以0 mL空白對(duì)照作為參比溶液，用1 cm比色皿，在595 nm處測(cè)定吸光度A2。寬筋藤蛋白質(zhì)含量按公式（3）計(jì)算。

寬筋藤蛋白質(zhì)含量= （3）

其中，A2為吸光度，V2為稀釋體積。

1.2.3正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)選擇提取溫度，提取時(shí)間，料液比作為考察因素，各因素下設(shè)3個(gè)水平（表1），按L9（34）設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，以還原性多糖質(zhì)量作為標(biāo)準(zhǔn)確定最佳提取條件。

1.2.4Sevag法等對(duì)寬筋藤粗多糖中蛋白質(zhì)的去除

1）稱取0.203 4 g寬筋藤粗多糖粉末定容至200 mL容量瓶中，測(cè)定其中還原性多糖與蛋白質(zhì)質(zhì)量。

2）Sevag法去除蛋白。移取25 mL上述溶液加入5 mL氯仿、1 mL正丁醇混合液進(jìn)行萃取操作，分液，重復(fù)6次，將水相濃縮后重新用去離子水定容至25 mL容量瓶中，測(cè)定其中還原性多糖與蛋白質(zhì)質(zhì)量。

3）TCA法除蛋白。移取25 mL上述溶液加入25 mL 10%三氯乙酸溶液，靜置一夜，離心去除沉淀，將溶液濃縮后重新用去離子水定容至25 mL容量瓶中，測(cè)定其中還原性多糖與蛋白質(zhì)質(zhì)量。

4）TCA-正丁醇法除蛋白。移取25 mL上述溶液加入5 mL 10%三氯乙酸溶液、20 mL正丁醇混合液進(jìn)行萃取操作，分液，將水相濃縮后重新用去離子水定容至25 mL容量瓶中，測(cè)定其中還原性多糖與蛋白質(zhì)質(zhì)量。

蛋白質(zhì)去除率=×100%

其中，m1為寬筋藤粗多糖中總蛋白質(zhì)的質(zhì)量，m2為去除蛋白質(zhì)后寬筋藤粗多糖中蛋白質(zhì)的質(zhì)量。

還原性多糖保留率=×100%

其中，m3為寬筋藤粗多糖中還原性多糖的質(zhì)量，m4為去除蛋白質(zhì)后寬筋藤粗多糖中還原性多糖的質(zhì)量。

2結(jié)果與分析

2.1寬筋藤多糖的最佳提取條件

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知各因素對(duì)多糖提取率的影響依次為提取溫度、提取時(shí)間、料液比（m/V，g：mL）。最佳提取組合為A3B3C2，即提取溫度90 ℃、提取時(shí)間90 min、料液比1∶10，此條件下寬筋藤粗多糖提取率為3.94%，其中還原性多糖含量為20.40%，蛋白質(zhì)含量為8.21%。

2.2Sevag法等對(duì)寬筋藤多糖中蛋白質(zhì)的去除效果

未除去蛋白質(zhì)的寬筋藤粗多糖溶液中還原性多糖含量為20.40%，蛋白質(zhì)含量為8.21%。Sevag法處理寬筋藤粗多糖溶液6次后，蛋白質(zhì)去除率為43.11%，還原性多糖保留率為83.86%；TCA法處理寬筋藤粗多糖溶液后，蛋白質(zhì)去除率為86.83%，還原性多糖保留率為68.67%；TCA-正丁醇法處理寬筋藤粗多糖溶液后，蛋白質(zhì)去除率為56.29%，還原性多糖保留率為65.06%。試驗(yàn)結(jié)果表明，TCA-正丁醇法去除蛋白質(zhì)效果較差，多糖保留率也較低。Sevag法雖多糖保留較多，但去除蛋白質(zhì)效果較差，且操作繁瑣。TCA法能有效去除寬筋藤粗多糖中的蛋白質(zhì)，相對(duì)多的保留多糖組分，操作簡(jiǎn)單。

3小結(jié)

試驗(yàn)確定了寬筋藤多糖的最優(yōu)提取條件，即提取溫度90 ℃、提取時(shí)間90 min、料液比1∶10，此條件下寬筋藤粗多糖的提取率為3.94%，其中還原性多糖含量為20.40%，蛋白質(zhì)含量為8.21%。去除蛋白質(zhì)的方法中TCA法最適宜寬筋藤粗多糖的純化，能去除86.83%的蛋白質(zhì)，還原性多糖保留率68.67%。

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