王 星， 張 娜， 趙 樺

(陜西理工學(xué)院 陜西省資源生物重點實驗室， 陜西 漢中 723000)

高效液相色譜法測定開口箭藥材中綠原酸含量

王 星， 張 娜， 趙 樺

(陜西理工學(xué)院 陜西省資源生物重點實驗室， 陜西 漢中 723000)

以體積分數(shù)50%的甲醇溶液為溶劑，用超聲提取法從開口箭藥材中提取綠原酸，用高效液相色譜法檢測提取液中綠原酸含量。提取條件為：超聲功率240 W，超聲頻率40 kHz，提取溫度60 ℃，超聲提取30 min。色譜條件為：色譜柱為Inertsil ODS-3C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)柱，以乙腈-0.4%磷酸水溶液(體積比9∶91)為流動相，流速1.0 mL/min，檢測波長327 nm，柱溫30 ℃。綠原酸在0.255～3.06 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，y=31 388x+152.43(R2=0.999 9)，平均加樣回收率99.4%，RSD為2.12%(n=3)。檢測結(jié)果表明，不同產(chǎn)地開口箭藥材中綠原酸的含量有一定的差異，其變化范圍在32.84～6.62 μg/g。該方法簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于開口箭藥材的質(zhì)量控制。

開口箭； 綠原酸； HPLC； 含量測定

0 引 言

開口箭屬(Tupistra)隸屬于百合科鈴蘭族。該屬植物主要分布于亞洲，約20種，我國約12種，主產(chǎn)于長江以南各省區(qū)。在陜西開口箭主要生長于秦嶺、巴山海拔800～2 000 m林下陰濕處、溪邊和路旁[1-2]。本屬植物多為少數(shù)民族民間用藥，多以根狀莖及全株入藥，具有清熱解毒、散瘀止痛等功效[3]。目前，國內(nèi)外學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)，開口箭植物含有多種甾體皂苷類化合物，在體內(nèi)具有較強的抗炎作用[4-5]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)開口箭植物多糖也具有一定的生物活性[6-9]。但對開口箭中綠原酸成分的分析研究尚未見報道。

綠原酸(chlorogenic acid)又名3-咖啡酰奎寧酸，是許多中草藥如金銀花、杜仲、茵陳等的主要有效成分之一。綠原酸是一種重要的生物活性物質(zhì)，具有抗菌、抗病毒、升高白細胞、保肝利膽、抗腫瘤、降血壓、降血脂、清除自由基和興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等作用和多種藥理活性。綠原酸應(yīng)用非常廣泛，主要為醫(yī)藥、日用化工和食品等行業(yè)，近年來受到人們的廣泛關(guān)注[10-12]。

目前，綠原酸及其他酚酸的測定方法主要有紫外-可見光分光光度法、高效液相色譜(HPLC)法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MSn)法等[11-13]。分光光度法測定有相同發(fā)色團物質(zhì)的總含量，而不是單一成分的含量。HPLC-MSn法雖然快速、準(zhǔn)確，但預(yù)處理復(fù)雜，分析成本高。相比之下，HPLC法具有操作簡單、準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好的特點，是目前檢測綠原酸及其主要代謝產(chǎn)物含量的常用方法[13-15]，《中國藥典》2010版中許多藥材的含量測定標(biāo)準(zhǔn)也規(guī)定采用HPLC法測定[16-17]。

本文采用HPLC法，對開口箭藥材中綠原酸成分進行分析研究，建立開口箭中綠原酸HPLC分析測定方法，以便于對該藥材有效成分分析研究和質(zhì)量控制。

1 儀器與試劑

Waters e2695高效液相色譜儀、Empower色譜工作站(美國Waters)；UV-2550紫外分光光度計(日本島津)；AB204-S電子分析天平(瑞士Mettler Toledo)；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗機(昆山市超聲儀器有限公司)；IKARV 10D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國IKA公司)；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；101-2型電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京科偉永興有限公司)；FW-177型中藥粉碎機、DK98-11A型數(shù)顯恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)。

綠原酸對照品由中國食品藥品檢定研究院提供(批號：110753-201314)，乙腈、甲醇均為色譜純，磷酸為分析純，水為超純水，開口箭藥材購自陜西省漢中市藥材市場。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Waters e2695高效液相色譜儀；Inertsil ODS-3C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)柱；2489紫外檢測器；流動相為乙腈-0.4%磷酸水溶液(體積比9∶91)，流速1 mL/min，檢測波長327 nm，柱溫30 ℃，進樣量10 μL。

2.2 檢測波長的選擇

利用適當(dāng)濃度的綠原酸對照品溶液，以超純水做空白，在200～400 nm范圍內(nèi)掃描，在327 nm處有最大吸收，因此選擇327 nm作為檢測波長。

2.3 樣品溶液的配制

取開口箭藥材，在60 ℃條件下烘干，粉碎過四號篩。稱取約2 g，精密稱定，置于具塞100 mL錐形瓶中，加20 mL體積分數(shù)50%的甲醇溶液，浸泡30 min，在超聲功率為240 W，超聲頻率為40 kHz，溫度為60 ℃條件下，超聲提取30 min，過濾，藥渣用20 mL 體積分數(shù)50%的甲醇溶液在相同條件下再提取一次，過濾，合并兩次濾液并定容至50 mL容量瓶中。進樣前用0.45 μm濾膜過濾。

2.4 對照品溶液的配制

精密稱取綠原酸對照品5.1 mg，用體積分數(shù)50%的甲醇溶液定容至100 mL的棕色容量瓶中，得51 μg/mL綠原酸對照品溶液，備用。

2.5 線性關(guān)系考察

圖1 綠原酸工作曲線圖

取51 μg/mL綠原酸對照品溶液各0.5、1、2、4、6 mL，用體積分數(shù)50%的甲醇溶液定容至100 mL的棕色容量瓶中，制成0.255、0.51、1.02、2.04、3.06 μg/mL的綠原酸對照品溶液，分別進樣，每次平行進樣5次，進樣量10 μL，進樣前用0.45 μm的濾膜過濾，測定峰面積，以綠原酸對照品的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得綠原酸的回歸方程為y=31 388x+152.43(R2=0.999 9)，在0.255～3.06 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。綠原酸曲線圖見圖1，色譜圖見圖2。

2.6 精密度試驗

用綠原酸對照品溶液重復(fù)進樣5次，每次進樣10 μL，綠原酸峰面積分別為96 376、95 793、95 350、96 036、96 157，RSD為0.41%。

2.7 重復(fù)性試驗

稱取開口箭樣品5份，每份約2 g，均精密稱定。按本文方法提取和測定，每份進樣5次，每次進樣10 μL。5份樣品中綠原酸的峰面積分別為40 655.7、40 256.7、39 579.3、39 304.7、39 082.3，RSD為1.66%。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

2.8 穩(wěn)定性試驗

用某產(chǎn)地開口箭樣品提取液為供試液，分別于提取后0、1、2、4、8、12、24 h進樣。綠原酸的峰面積分別為39 971、40 608、40 581、40 224、40 018、39 803、38 953，RSD為1.4%。

2.9 加樣回收率試驗

精密稱取開口箭樣品3份，其質(zhì)量分別為0.999 7、0.999 8、1.000 1 g。向這3份樣品中分別加入一定量的綠原酸對照品，按本文方法提取和測定，并計算回收率，結(jié)果見表1。

表1 綠原酸加樣回收率實驗

2.10 樣品含量測定

取秦巴山區(qū)陜西省略陽縣、陜西省留壩縣、陜西省南鄭縣、甘肅省康縣4個產(chǎn)地的開口箭藥材，按2.3項下樣品制備方法制備開口箭藥材供試液，按2.5項下測定供試液中綠原酸含量，進樣前用0.45 μm濾膜過濾，進樣量10 μL，綠原酸含量分別為(每個產(chǎn)地樣品各取3份)：陜西省略陽縣32.84 μg/g，RSD=1.26%；甘肅省康縣16.98 μg/g，RSD=1.07%；陜西省留壩縣8.18 μg/g，RSD=1.11%；陜西省南鄭縣6.62 μg/g，RSD=1.17%。樣品中綠原酸含量測定色譜圖見圖3。

圖3 陜西省略陽縣產(chǎn)開口箭藥材供試品色譜圖

3 討 論

HPLC法測定不同植物中綠原酸含量時所用流動相不盡相同，多為乙腈-0.4%磷酸混合溶液，兩種溶液的比例有一定的變化?！吨袊幍洹吩诜治鼋疸y花中綠原酸含量時采用的流動相為乙腈-0.4%磷酸混合溶液(體積比13∶87)[16]。本實驗用乙腈-0.4%磷酸混合溶液作為流動相，對兩種溶液的配比情況與綠原酸色譜峰的變化進行了比較分析。在乙腈與0.4%磷酸的體積比為13∶87時不能將供試液中綠原酸色譜峰和其相鄰雜質(zhì)的色譜峰分開；在減少乙腈、增加磷酸比例時綠原酸色譜峰分離效果漸漸好轉(zhuǎn)；當(dāng)將流動相中乙腈與0.4%磷酸的體積比調(diào)至9∶91時，綠原酸和其相鄰組分達到了很好的分離效果，分離度大于1.5，符合定量分析要求；若再繼續(xù)減少乙腈比例時，分離效果又變的較差。故本實驗在分析開口箭藥材中綠原酸使用的流動相最終確定為乙腈-0.4%磷酸(體積比9∶91)，在此條件下供試液中綠原酸的色譜峰較為理想。

通過實驗，建立了開口箭藥材中綠原酸成分的提取方法及HPLC檢測方法。開口箭藥材中綠原酸的提取方法為：以體積分數(shù)50%的甲醇溶液為溶劑，超聲提取功率240 W，超聲頻率40 kHz，提取溫度60 ℃，超聲提取30 min。高效液相色譜法檢條件為：Inertsil ODS-3C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)色譜柱，乙腈-0.4%磷酸水溶液(體積比9∶91)為流動相，流速1.0 mL/min，檢測波長327 nm，柱溫30 ℃。

本研究首次報道了秦巴山區(qū)產(chǎn)開口箭藥材中綠原酸的含量，最高可達32.84 μg/g，相比與其他富含綠原酸的中藥材其含量較低。研究結(jié)果還表明，秦巴山區(qū)不同產(chǎn)地開口箭中綠原酸含量相差較大，在所檢測的4個產(chǎn)地樣品中最高為32.84 μg/g，最低為6.62 μg/g，說明開口箭藥材中綠原酸含量受產(chǎn)地、環(huán)境、氣候等因素的影響較大。

[1] 中國科學(xué)院西北植物研究所.秦嶺植物志:第1卷第1冊[M].北京:科學(xué)出版社,1976:337-338.

[2] 傅立國,陳潭清,郎開永,等.中國高等植物:第13卷[M].青島:青島出版社,2002:178-181.

[3] 南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典:上冊[M].2版.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,2006:428-429.

[4] 陳江華,劉忠華,李鳳蘭,等.開口箭屬植物研究進展[J].中藥材,2008,31(5):792.

[5] 周媛,鄒坤,喻玲玲,等.RP-HPLC測定開口箭中2個皂苷的含量[J].中國中藥雜志,2008,33(22):2647-2649.

[6] 趙樺,王慧娜,徐皓.開口箭多糖含量測定及生物學(xué)活性研究[J].陜西理工學(xué)院學(xué)報:自然科學(xué)版,2013,29(3):62-68.

[7] 蔡晶,朱正光,余傳林,等.開口箭皂苷抑制小鼠S-180肉瘤細胞增殖及實體瘤生長的實驗研究[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2007,27(2):188-194.

[8] 解燕,朱正光,余傳林,等.開口箭酸性多糖對小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用及抗腫瘤作用的初步研究[J].中藥材,2010,33(4):596-599.

[9] 解燕.開口箭多糖免疫調(diào)節(jié)作用的實驗研究[D].廣州:南方醫(yī)科大學(xué),2010.

[10] 鄧良,袁華,喻宗沅.綠原酸的研究進展[J].化學(xué)與生物工程,2005(7):4-6.

[11] 張萬明,甄攀,白雪梅,等.RP-HPLC測定吳茱萸中綠原酸的含量[J].中成藥,2006,28(1):130-132.

[12] 丘秀珍,郭會時,王少玲,等.百香果中綠原酸含量的高效液相色譜法測定[J].食品研究與開發(fā),2013,34(6):80-83.

[13] 羅曉燕,吳九九,溫艷梅,等.高效液相色譜法同時測定綠原酸及其五種主要代謝產(chǎn)物[J].食品工業(yè)科技,2013,34(4):66-69.

[14] 刁全平,侯冬巖,回瑞華,等.超聲波法提取胎菊中綠原酸的研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2013,25(1):101-103.

[15] 李克,吳龍琴,湯淏,等.RP-HPLC法同時測定忍冬藤中綠原酸和咖啡酸含量[J].現(xiàn)代中藥研究與實踐,2013,27(1):17-20.

[16] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:一部[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2010,205-206.

[17] 馬雙成,錢勇,安哲.2010版《中國藥典》中藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分析圖譜:上冊[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2012.

[責(zé)任編輯：魏 強]

Abstract: The chlorogenic acid is extracted fromTupistrachinensisusing 50% methanol, and the conditions of the ultrasonic wave are as follows: extraction ultrasonic power of 240 W, ultrasonic frequency of 40 kHz, temperature of 60 ℃ and ultrasonic treatment time of 30 min. Samples are analyzed on an Inertsil ODS-3C18column(4.6 mm×150 mm, 5 μm)using acetonitrile-0.4%phosphoric acid as mobile phase, and speed of flow is 1.0 mL/min, the examination wave length is 327 nm and the column temperature is 30 ℃. The chlorogenic acid shows a good linearity in the range of 0.255～3.06 μg/mL, egression equation beingy=31 388x+152.43(R2=0.999 9)and the average recovery being 99.4%(RSD=2.12%). The result shows that there are some differences in the content of chlorogenic acid inTupistrachinensisamong different origins. The established method is simple, credible, accurate, repeatable and can be used for the quality control ofTupistrachinensis.

Keywords:Tupistrachinensis; chlorogenic acid; HPLC; determination of the content

Determination of chlorogenic acid inTupistrachinensisby HPLC

WANG Xing, ZHANG Na, ZHAO Hua

(Bio-Resources Key Laboratory of Shaanxi Province, Shaanxi University of Tecnology,Hanzhong 723000, China)

1673-2944(2014)03-0059-04

2014-03-03

陜西省教育廳重點實驗室科學(xué)研究計劃項目(14JS)；陜西理工學(xué)院研究生創(chuàng)新基金資助項目(SLGYCX1312)

王星(1987—)，男，陜西省商洛市人，陜西理工學(xué)院碩士研究生，主要研究方向為植物資源開發(fā)利用；[通訊作者]趙樺(1957—)，男，陜西省漢中市人，陜西理工學(xué)院教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要研究方向為植物資源開發(fā)利用。

Q946.91+9

A