江維克，周濤，肖承鴻，楊昌貴，艾強(qiáng)

(貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550002)

中藥農(nóng)業(yè)

基于化學(xué)指紋圖譜的藥用植物種質(zhì)資源多樣性評(píng)價(jià)△
——以黔產(chǎn)川續(xù)斷種質(zhì)資源評(píng)價(jià)為例

江維克*，周濤，肖承鴻，楊昌貴，艾強(qiáng)

(貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽550002)

目的：以指紋圖譜的指紋峰面積為參數(shù)，探討藥用植物種質(zhì)資源多樣性評(píng)價(jià)方法。方法：以黔產(chǎn)川續(xù)斷為例，對(duì)其HPLC指紋圖譜進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，利用相關(guān)軟件計(jì)算指紋峰面積多樣性、指紋峰之間相關(guān)性分析以及主成分分析，并進(jìn)行不同種質(zhì)之間的聚類分析。結(jié)果：各指紋圖譜峰的峰面積表現(xiàn)出不同程度的多樣性；大多數(shù)指紋峰面積之間呈顯著的相關(guān)性；主成分分析結(jié)果表明，第一主成分反應(yīng)了川續(xù)斷的品質(zhì)特征；聚類分析顯示歐式遺傳距離與種質(zhì)資源的空間距離無關(guān)。結(jié)論：以指紋圖譜為指標(biāo)對(duì)藥用植物進(jìn)行多樣性評(píng)價(jià)，可以揭示藥用植物種質(zhì)資源多樣性規(guī)律和結(jié)構(gòu)，同時(shí)還能反映藥用植物種質(zhì)資源的內(nèi)在質(zhì)量，與其他研究藥用植物的遺傳多樣性的方法相比，具有明顯的特色。

指紋圖譜；多樣性；種質(zhì)資源；藥用植物；川續(xù)斷

多樣性評(píng)價(jià)研究是種質(zhì)資源研究的主要內(nèi)容之一，其方法主要有分子標(biāo)記、農(nóng)藝性狀、同工酶等，對(duì)藥用植物的研究而言，這些方法往往與藥材的內(nèi)在品質(zhì)沒有直接的關(guān)聯(lián)?；瘜W(xué)指紋圖譜代表中藥化學(xué)成分分布比例和含量特征、潛在的生物活性和藥效量化特征，與中藥藥效作用的整體性相一致。盡管圖譜中大量指紋峰還無法一一辨認(rèn)，但其仍然是藥用植物內(nèi)在質(zhì)量和化學(xué)特征的最好表征，指紋峰猶如植物的農(nóng)藝性狀，或者分子標(biāo)記中的條帶，能很好地表現(xiàn)出藥用植物種質(zhì)資源的多樣性，同時(shí)還能反映藥材的內(nèi)在質(zhì)量，具有明顯的特色。本文以黔產(chǎn)川續(xù)斷的HPLC指紋圖譜為例，探討以指紋峰面積為參數(shù)評(píng)價(jià)藥用植物多樣性的方法。

1 材料和方法

1.1材料

2011年10月～12月，在貴州省22個(gè)川續(xù)斷居群進(jìn)行采樣，每個(gè)居群采集5～10個(gè)單株，共152份樣品，樣品信息見表1。樣品均經(jīng)鑒定，為川續(xù)斷科植物川續(xù)斷DipsacusasperWall.ex Henry。樣品采集后，洗凈，50℃烘至半干，密閉發(fā)汗至藥材斷面變綠后再烘干，粉碎成細(xì)粉。

表1 樣品信息

1.2儀器與試劑

高效液相色譜儀(LC-20AD，日本島津)；電子天平(EL104，瑞士METTLERTOLEDO)；乙腈(色譜純，Tedia公司)；川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)111685-200401)。

1.3色譜條件

UltimateXB-18色譜柱(250mm×4.60mm，5μm)；以乙腈(A)-0.05%磷酸水(B)為流動(dòng)相，體積流量0.8mL·min-1。梯度洗脫：0～30min，9%～21%A；30～65min，21%～22%A；65～90min，22%～60%A。檢測(cè)波長212nm，柱溫30℃；進(jìn)樣量10μL。

1.4溶液的制備

對(duì)照品溶液：用甲醇溶解制成含量為0.1690mg·mL-1的對(duì)照品溶液。

供試品溶液：取川續(xù)斷藥材粗粉約1g，精密稱定，置于100mL錐形瓶中，加入70%乙醇50mL，稱定重量，回流提取2h，放冷，補(bǔ)足減失的重量，濾過，取續(xù)濾液過0.45μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

1.5黔產(chǎn)川續(xù)斷化學(xué)指紋圖譜的建立

將測(cè)定的152份川續(xù)斷樣品圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版”，以樣地1(黔南州龍里縣1)中的1號(hào)樣本作為參照?qǐng)D譜，選擇80%樣本都有、且峰面積超過10000的峰作指紋圖譜峰，結(jié)果得到指紋圖譜峰16個(gè)，以fAi表示，其中第16號(hào)峰(fA16)為川續(xù)斷皂苷Ⅵ，見圖1。

圖1 1號(hào)川續(xù)斷樣品(A)及對(duì)照品川續(xù)斷皂苷Ⅵ(B)的HPLC圖

1.6指紋峰面積的標(biāo)準(zhǔn)化處理

對(duì)每個(gè)樣本的指紋峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，得到每個(gè)樣本標(biāo)準(zhǔn)化指紋峰面積Aijs，Aijs=Aij/(WiAS)，其中Aij為第i個(gè)樣本的第j個(gè)峰面積，Wi為第i個(gè)樣本的取樣量(g)，AS為對(duì)照品的峰面積。

1.7數(shù)據(jù)分析

采用SPSS17.0軟件，計(jì)算Aijs的平均數(shù)(Xjs)、標(biāo)準(zhǔn)差(Sjs)、極差(Rjs)、變異系數(shù)(CVjs)等統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)和遺傳多樣性指數(shù)(H′)。遺傳多樣性指數(shù)采用Shannon-Weiner index(H′)指數(shù)，計(jì)算公式為：H′=-∑Pk×lnPk，式中Pk為某j個(gè)峰標(biāo)準(zhǔn)峰面積在第k級(jí)別出現(xiàn)的頻率(先在[Xjs-2Sjs，Xjs+2Sjs]區(qū)間等分為10等級(jí)，統(tǒng)計(jì)各標(biāo)準(zhǔn)化面積在各等級(jí)中的分布頻率)[1]。主成分和聚類分析采用DPS7.0軟件，種質(zhì)間遺傳距離為歐氏距離。

2 黔產(chǎn)川續(xù)斷種質(zhì)資源多樣性的化學(xué)指紋圖譜分析結(jié)果

2.1川續(xù)斷化學(xué)指紋峰多樣性分析

黔產(chǎn)川續(xù)斷各指紋圖譜峰的峰面積表現(xiàn)出不同程度的多樣性，16個(gè)指紋圖譜峰的平均多樣性指數(shù)為1.8365，fA總的多樣性指數(shù)為2.0639，fA16(川續(xù)斷皂苷Ⅵ)的多樣性指數(shù)為1.7523。16個(gè)指紋峰面積的變異系數(shù)均大于40%，fA總的變異系數(shù)為40.32%。fA16的峰面積變異系數(shù)為77.03%。一方面說明黔產(chǎn)川續(xù)斷藥材質(zhì)量差異較大，需要全面對(duì)種源進(jìn)行篩選和歸類，另一方面也反映黔產(chǎn)川續(xù)斷種質(zhì)資源的遺傳改良利用的潛力較大，對(duì)有目的的尋找選育目標(biāo)性狀與成分的種質(zhì)具有重要意義，見表2。

表2 川續(xù)斷16個(gè)指紋圖譜峰的多樣性分析(n=152)

2.2 川續(xù)斷化學(xué)指紋圖譜各指紋峰之間的相關(guān)性分析

各指紋峰面積間存在不同程度的相關(guān)性，每一個(gè)指紋峰面積至少與9個(gè)指紋峰的峰面積顯著相關(guān)；這種相關(guān)性是川續(xù)斷中各化學(xué)成分含量之間相關(guān)性的直接表現(xiàn)，可以推測(cè)，指紋峰面積與農(nóng)藝性狀的指標(biāo)相似，是受相關(guān)基因表達(dá)或環(huán)境影響的結(jié)果。結(jié)果見表3。

表3 川續(xù)斷16個(gè)指紋峰的相關(guān)性分析(n=152)

注：上標(biāo)1)在0.05水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)；2)在0.01水平(雙側(cè))上極顯著相關(guān)

2.3川續(xù)斷化學(xué)指紋圖譜的主成分分析

前6個(gè)主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率為70.093%，包含了川續(xù)斷指紋圖譜的絕大部分信息。第1主成分貢獻(xiàn)率最大，其特征向量中載荷大且符號(hào)為正的指紋峰中包含了峰面積較大的四個(gè)指紋峰(fA3、fA10、fA11、fA12)，因此第1主成分表征了影響川續(xù)斷質(zhì)量的主要因子；第2主成分在特征向量中載荷大且符號(hào)為正的指紋峰包含了川續(xù)斷皂苷Ⅵ的指紋峰；第3～6主成分在特征向量中載荷大的指紋峰較少；fA總與fA3、fA4、fA9、fA10、fA11、fA12、fA15峰面積的變化趨勢(shì)極其相似，這與相關(guān)性分析結(jié)果基本一致。見表4。

2.4川續(xù)斷化學(xué)指紋圖譜的的聚類分析

對(duì)152份樣本進(jìn)行聚類分析，以歐式距離為遺傳距離，在距離30處將供試材料聚為4大類群，見圖2，以下又可分為不同的亞類(在此對(duì)亞類不作細(xì)分)。川續(xù)斷各種質(zhì)類群的特征見表5。

第Ⅰ類群主要包含11個(gè)產(chǎn)地的樣本，為地理分布廣的類群，其主要特征是指紋峰面積的平均多樣性指數(shù)和總峰面積的多樣性指數(shù)最高，進(jìn)一步佐證了多樣性是藥用植物適應(yīng)環(huán)境生長的主要因素。同時(shí)提示該類群作為良種選育的潛力較大。

第Ⅱ類群主要包含3個(gè)產(chǎn)地的樣本，其主要特征是指紋峰fA2、fA13、fA14、fA16的峰面積平均值最高，其中fA16為川續(xù)斷皂苷Ⅵ，表明川續(xù)斷皂苷Ⅵ成分含量較高，可作為川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量高的種源加以利用。

表4 川續(xù)斷16個(gè)指紋峰的主成分分析(n=152)

圖2 基于指紋峰面積的川續(xù)斷種質(zhì)資源聚類圖

峰ⅠⅡⅢⅣAverageCV/%H'AverageCV/%H'AverageCV/%H'AverageCV/%H'fA10.13488.601.82130.10978.101.96170.16374.071.84200.12938.631.8946fA21.55477.931.80722.26244.862.01121.33387.551.63911.44377.551.6217fA38.96349.382.03326.24149.301.871414.79631.801.96762.11650.341.9870fA40.24847.931.90740.20167.371.77510.33140.471.75610.023181.200.6809fA50.60069.121.91250.64092.411.66680.71295.291.70070.48429.621.9475fA60.60756.872.04670.87452.291.76150.62749.061.92741.16053.781.6749fA70.17961.742.03140.18373.341.85390.19594.411.77670.016192.131.0377fA80.12858.511.94080.12392.761.69070.12260.621.74460.041159.911.3505fA91.28859.201.93970.69387.871.90502.71851.871.90300.61564.032.0219fA107.69847.171.95374.79060.451.756110.23947.331.84082.58068.461.7447fA119.91630.382.07298.00450.011.937812.69131.431.90403.12758.321.8946fA129.78055.431.83734.96039.241.981812.53242.931.74732.62362.261.7673fA131.09666.481.90571.55279.421.92850.92258.621.94421.07364.521.7957fA140.331145.341.20080.379205.340.51580.27379.101.63910.11658.351.7673fA150.92158.601.81470.77176.471.58311.27458.221.59670.41288.291.3175fA161.34773.181.66651.47185.851.61521.35451.881.85130.46658.912.0219fA總44.79127.502.086933.25231.491.875260.28026.701.951316.42442.071.6929平均2.79965.371.86822.07877.191.73853.76859.661.79881.02681.641.6579

第Ⅲ類群主要包含6個(gè)產(chǎn)地的樣本，該類群的指紋峰面積的平均值最大，說明此類群的藥材整體化學(xué)成分含量較高，內(nèi)在品質(zhì)好，是值得引種馴化的種源。

第Ⅳ類群主要包含2個(gè)產(chǎn)地的樣本，該類群指紋峰面積的平均值小、變異系數(shù)大、多樣性指數(shù)最低，說明此類群藥材整體化學(xué)成分含量低，內(nèi)在品質(zhì)差。同時(shí)分布也較窄。

3 討論

黔產(chǎn)川續(xù)斷的化學(xué)指紋圖譜有豐富多樣性，與筆者前期采用SRAP分析的結(jié)果一致[2]，指紋圖譜的多樣性是通過各指紋峰面積的差異表現(xiàn)的，即對(duì)應(yīng)的化學(xué)成分的含量差異；同時(shí)，指紋峰面積之間具有明顯的相關(guān)性，各指紋峰面積的大小并不是孤立的，而是受到其他指紋峰面積大小的制約，顯示出任何一個(gè)指紋峰不是受到單一因素或一個(gè)基因控制，而是受到多因素或多基因的調(diào)控。

通過主成分分析可以挖掘出在某些特征起主要貢獻(xiàn)的指紋峰，例如，第1主成分包含了平均面積最大的4個(gè)指紋峰，顯然代表了川續(xù)斷內(nèi)在質(zhì)量的主要因素，通過比較第一主成分，即可大致分析出不同類群川續(xù)斷的質(zhì)量差異。

聚類分析顯示，川續(xù)斷種質(zhì)間遺傳歐氏距離的遠(yuǎn)近與川續(xù)斷種質(zhì)資源的空間距離并不一致，相關(guān)指紋峰面積與種質(zhì)資源空間的關(guān)系完全是隨機(jī)的，這與筆者前期的研究相一致[3]。特征指紋峰面積平均值、變異系數(shù)、多樣性指數(shù)等參數(shù)，表示了每一類群種質(zhì)資源的內(nèi)在質(zhì)量差異和多樣性的特征。指紋峰面積大、變異系數(shù)小、多樣性指數(shù)低，說明該類群的質(zhì)量好且比較穩(wěn)定，是比較適合引種馴化的類群；指紋峰面積大，但變異系數(shù)大、多樣性指數(shù)較高的類群，可能包含豐富的基因類型，是優(yōu)良品種選育的優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源。

植物的遺傳分化即基因或染色體的變異有不同的表型形式，包括化學(xué)成分的組成和含量的變化[4]。由于受其本身的遺傳結(jié)構(gòu)和所處生態(tài)環(huán)境影響，植物的形態(tài)和次生代謝物既具有變異性又具有穩(wěn)定性，這是一個(gè)種群生存、發(fā)展和進(jìn)化的基礎(chǔ)，也是生物多樣性具體體現(xiàn)的重要方式[5]?；瘜W(xué)指紋圖譜是一種能比較全面地反映中藥中化學(xué)成分分布比例和含量特征的方法[6]，盡管化學(xué)指紋圖譜中有大量指紋峰還無法一一辨認(rèn)，但每個(gè)指紋峰與農(nóng)藝性狀相似，受多基因和環(huán)境的影響，在數(shù)值上呈連續(xù)分布，指紋峰面積之間有不同程度的關(guān)聯(lián)，能夠反映出基因型上的變異和環(huán)境的影響。因此，利用指紋圖譜對(duì)藥用植物的種質(zhì)資源進(jìn)行多樣性評(píng)價(jià)，與其他多樣性評(píng)價(jià)方法相比，還可以同時(shí)顯示中藥成分的差異，可以更好地指導(dǎo)藥用植物種質(zhì)資源的開發(fā)利用和保護(hù)；如果結(jié)合植物化學(xué)分類學(xué)理論，將指紋圖譜對(duì)多樣性評(píng)價(jià)方法擴(kuò)展到更高的分類等級(jí)，例如屬或科的樣本進(jìn)行指紋圖譜多樣性分析，也可能為分類系統(tǒng)的建立提供依據(jù)。

[1] 顧萬春.統(tǒng)計(jì)遺傳學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社，2006：158.

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ANovelMethodforGermplasmDiversityEvaluationofMedicinalPlantBasedonChemicalFingerprint：ACaseStudyonDipsacusasper

JIANG Weike*，ZHOU Tao，XIAO Chenghong，YANG Changgui，AI Qiang

(Guiyang College of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550002，China)

Objective：To create a novel method for germplasm diversity evaluation of medicinal plant based on the chemical fingerprints.Methods：An example ofDipsacusasperin Guizhou，the fingerprint peak areas were standardized，then the diversity of fingerprint peak area，the correlation between fingerprint peaks and the principal components，and the cluster analysis of the different germplasm resources were analyzed by SPSS 17.0 and DPS 7.0.Results：There were abundant diversity of fingerprint peak areas and close correlation among each fingerprint peaks which could offer help to quality evaluation ofD.asper.The principal components analysis of the fingerprint peaks showed that the first principal component obviously reflected the inner quality ofD.aspercharacteristics.The cluster analysis showed that the euclidean genetic distance had nothing to do with the space distance of germplasm resources.Conclusion：The germplasm diversity evaluation based on the chemical fingerprints could reveal the diversity regularity and structure of medicinal plant germplasm.Meanwhile，it reflected the inner quality of medicinal plant germplasm resources.

Fingerprints；Germplasm diversity；Germplasm resource；Medicinal plant；Dipsacusasper

國家自然科學(xué)地區(qū)基金項(xiàng)目(81160501)；國家十一五科技支撐項(xiàng)目(2009BA174B01)；貴州省普通高等學(xué)校特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)項(xiàng)目(黔教合KY字[2013]108號(hào))

*

江維克，教授，研究方向：中藥資源鑒定與評(píng)價(jià)；Tel：(0851)5622506，E-mail：jwk_88@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.10.008

2014-07-31)