HPLC同時測定廣東王不留行中綠原酸和蘆丁的含量

何鵬，王英，金建平，金陽，吳敏

(1.蕪湖市食品藥品檢驗所，安徽 蕪湖 241006；2.暨南大學 藥學院，廣東 廣州 510632)

HPLC同時測定廣東王不留行中綠原酸和蘆丁的含量

何鵬1*，王英2，金建平1，金陽1，吳敏1

(1.蕪湖市食品藥品檢驗所，安徽 蕪湖 241006；2.暨南大學 藥學院，廣東 廣州 510632)

目的：運用高效液相色譜法(HPLC)建立廣東王不留行中綠原酸和蘆丁的含量測定方法。方法：色譜柱為Inersil ODS-3 C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇(A)-1%醋酸水溶液(B)，梯度洗脫，檢測波長為340 nm，柱溫為40 ℃，流速為1.0 mL·min-1。結(jié)果：綠原酸在0.101 6～1.015 5 μg與峰面積線性關(guān)系良好(r=1.000 0，n=5)；蘆丁在0.021 5～0.214 9 μg與峰面積線性關(guān)系良好(r=1.000 0，n=5)。綠原酸的平均加樣回收率為98.3%，RSD=1.53%(n=6)；蘆丁的平均加樣回收率為102.9%，RSD=1.46%(n=6)。結(jié)論：所用方法操作簡單、快捷、準確，可用于廣東王不留行的質(zhì)量控制。

廣東王不留行；綠原酸；蘆?。桓咝б合嗌V法

廣東王不留行為?？浦参镛道驠icuspumilaL.的干燥隱頭花序托，具有活血通經(jīng)、補腎固精功能，主治乳汁不下，陽痿遺精，閉經(jīng)，久痢脫肛等[1]。主要分布于我國廣東、廣西、江蘇、四川等地[2]。廣東王不留行目前收載于《中國藥典》2010版一部附錄Ⅲ，未收載于標準正文中，《中國藥典》2015版一部正文擬將收載此品種。目前廣東王不留行中黃酮類成分的含量測定研究已有報道[3]，但是同時測定綠原酸和蘆丁含量的文獻尚未見報道。本文采用HPLC同時測定廣東王不留行中綠原酸和蘆丁兩種指標成分，結(jié)果表明此法簡便快捷，準確可靠，為廣東王不留行的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

Waters e2695高效液相色譜儀；Waters 2489紫外檢測器；JU-2106超聲波清洗器(上海杰恩普公司)；Mettler Toledo XP205電子分析天平(瑞士梅特勒托利多公司)；KEDA UV-VIS 8500紫外-可見分光光度計(無錫科達公司)。

綠原酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，含量：96.6%，批號：110753-201314)；蘆丁對照品(中國食品藥品檢定研究院，含量：90.5%，批號：100080-200707)；甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純；廣東王不留行(共收集15批，產(chǎn)地均為廣東，批號：20130301，20130311，20130321，20130325，20130406，20130413，20130418，20130426，20130512，20130517，20130523，20130527，20130605，20130402，20130805)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Inersil ODS-3 C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為甲醇(A)-1%醋酸水溶液(B)，梯度洗脫，洗脫程序見表1；檢測波長為340 nm；柱溫為40 ℃；流速為1.0 mL·min-1；進樣量為10 μL。理論板數(shù)按蘆丁峰計算應不低于3 000。在此條件下綠原酸峰和蘆丁峰與其他相鄰色譜峰均達到有效分離，分離度均大于1.5，見圖1。

表1 流動相梯度洗脫程序

A.綠原酸、蘆丁混合對照品 B.廣東王不留行樣品圖1 廣東王不留行樣品及對照品溶液HPLC圖

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取綠原酸對照品13.14 mg，置10 mL量瓶中，加入50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得綠原酸對照品儲備液(1.269 3 mg·mL-1)；精密稱取蘆丁對照品14.84 mg，置50 mL量瓶中，加入50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得蘆丁對照品儲備液(0.268 6 mg·mL-1)；分別精密量取上述兩種儲備液各2 mL，置同一50 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液(其中綠原酸質(zhì)量濃度為0.050 8 mg·mL-1，蘆丁質(zhì)量濃度為0.010 7 mg·mL-1)。

2.3 供試品溶液的制備

取廣東王不留行粉末(過二號篩)約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率33 kHz)40 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取混合對照品溶液2，5，10，15，20 μL，注入高效液相色譜儀，按2.1色譜條件測定峰面積。以峰面積為縱坐標(Y)，分別以綠原酸、蘆丁的進樣量為橫坐標(X)，繪制綠原酸和蘆丁的標準曲線，得綠原酸回歸方程：Y=2 787 075.756 5X-96 639.285 4(r=1.000 0)；蘆丁回歸方程：Y=1 747 157.771 8X-19 431.269 5(r=1.000 0)。綠原酸在0.101 6～1.015 5 μg、蘆丁在0.021 5～0.214 9 μg與峰面積線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗

精密吸取混合對照品溶液10 μL，照2.1色譜條件，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結(jié)果綠原酸和蘆丁的RSD分別為0.65%和0.70%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取廣東不留行樣品(批號：20130301)1份，按2.3方法制備供試品溶液，室溫放置，分別于0，2，4，6，8 h時進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果綠原酸和蘆丁的RSD分別為0.64%和0.54%，表明供試品溶液室溫下至少在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復性試驗

取同一批樣品(批號：20130301)6份，分別按2.3方法制備供試品溶液，進樣測定含量。結(jié)果綠原酸和蘆丁的RSD分別為0.96%和1.43%，表明方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

取已知含量的樣品(批號：20130301，綠原酸質(zhì)量分數(shù)：0.271%，蘆丁質(zhì)量分數(shù)：0.061%)6份，每份0.5 g，精密稱定，分別精密加入一定量的綠原酸對照品和蘆丁對照品，按2.3方法制備供試品溶液，進樣測定，計算回收率，結(jié)果見表2、3。

表2 廣東王不留行中綠原酸加樣回收試驗

注：綠原酸對照品加入量均為1.269 3 mg

表3 廣東王不留行中蘆丁加樣回收試驗

注：蘆丁對照品加入量均為0.268 6 mg

2.9 廣東王不留行樣品含量測定

取15批廣東王不留行樣品，按2.3方法制備供試品溶液，進樣測定綠原酸及蘆丁的質(zhì)量分數(shù)，結(jié)果見表4。

表4 廣東王不留行樣品中綠原酸及蘆丁的測定 %

3 討論

3.1 藥材名稱的考證

很多地方存在廣東王不留行與《中國藥典》2010版收載的石竹科藥材王不留行混用的情況，尤其在廣東、廣西、河南等地區(qū)習慣將廣東王不留行當作王不留行使用[4]，在這些地區(qū)廣東王不留行常被稱為薜荔果、涼粉果、木饅頭、廣東王不留行[5]。《中國藥典》2015版將把廣東王不留行作為正式法定名稱，與石竹科的王不留行嚴格區(qū)分。

3.2流動相的選擇

資料[6-8]，考察了不同比例的甲醇-0.4%磷酸溶液、乙腈-0.4%磷酸水溶液、甲醇-1%冰醋酸水溶液、甲醇-水的多種等度和梯度洗脫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)等度洗脫運行時間在40 min以上時綠原酸和蘆丁與各自相鄰峰的分離度才能大于1.5；選用磷酸時指標成分拖尾因子略高于使用醋酸時得到的結(jié)果；以甲醇-1%冰醋酸水溶液按表1中規(guī)定進行梯度洗脫時綠原酸和蘆丁峰保留時間適中，基線平穩(wěn)，峰形理想，目標成分峰與相鄰峰的分離度均大于1.5，故按表1中的梯度程序作為流動相。

3.3提取條件的選擇

本文首先考察了50%甲醇、甲醇、乙酸乙酯的提取效果，結(jié)果以50%甲醇-水溶液的提取效果最好；通過比較超聲提取法和加熱回流提取法，發(fā)現(xiàn)超聲提取效果較好且操作更簡便；通過比較不同固液比(1∶25，1∶50，1∶75，1∶100)提取率，發(fā)現(xiàn)1∶25時提取效果差，后3個比例效果差別不大，從環(huán)保及節(jié)約試劑考慮，選擇加入溶劑量為50 mL；超聲時間考察了10，20 ，40，60 min，發(fā)現(xiàn)指標成分含量隨著提取時間先增大后減小，當超聲處理40 min時最大，故選擇超聲時間為40 min。

3.4檢測限和定量限

根據(jù)《中國藥典》2010版一部附錄XⅧ A中藥質(zhì)量標準分析方法驗證指導原則的規(guī)定[6]，按照國家藥典委員會頒布的《〈中國藥典〉中藥質(zhì)量標準研究制定技術(shù)要求》、《〈中國藥典〉中藥質(zhì)量標準起草與復核工作規(guī)范》和《〈中國藥典〉中藥質(zhì)量標準起草說明編寫細則》等相關(guān)文件的要求，本研究未考察檢測限和定量限，而且標準曲線中濃度最低點的綠原酸和蘆丁峰面積分別為19萬和2萬左右，峰面積較大，可推算出檢測限和定量限非常小，沒有必要考察驗證檢測限和定量限。

3.5含量的差異

本研究選擇了15批樣品進行測定，結(jié)果個別批次含量偏差較大，分析可能的原因有：藥材來源于花序托即為薜荔果的果殼，體積較大，對取樣均勻性要求較高；果實的成熟度可能與含量也有著一定的關(guān)系；收集樣品過程中發(fā)現(xiàn)部分果殼內(nèi)帶有較多的種子，同一藥材中種子與果殼的含量也可能存在一定的差異。這些可能造成含量偏差的原因在今后的工作中將作進一步的研究考證。

參考文獻

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[8] 李瑋，楊秀偉.HPLC法同時測定款冬花中9個主要成分的含量[J].藥物分析雜志，2012，32(9)：1517-1524.

SimultaneousDeterminationfortheContentofChlorogenicAcidandRutinintheSeedofVaccariasegetalisbyHPLC

HE Peng1*，WANGYing2，JINJianping1，JINYang1，WUMin1

(1.WuhuInstituteforFoodandDrugControl，Wuhu241006，China；2.CollegeofPharmacy，JinanUniversity，Guangzhou510562，China)

Objective：To establish a method for detecting the content of Chlorogenic acid and Rutin in the seed ofVaccariasegetalisby high performance liquid chromatography(HPLC).Methods：The sample was separated on the Inersil ODS-3 C18column(250 mm×4.6 mm，5 μm),and was gradient elution using methanol(A)-1% acetic acid-water(B)as the mobile phase at a flow rate of 1.0 ml·min-1and at 40 ℃ of column temperature.The detection wavelength was 340 nm.Results：The linear range of Chlorogenic acid was at 0.101 6～1.015 5 μg(r=1.000 0，n=5)，and Rutin was at 0.021 5～0.214 9 μg(r=1.000 0，n=5).The average recovery rate was 98.3% for Chlorogenic acid，and the RSD was 1.53%(n=6).The average recovery rate was 102.9% for Rutin，and the RSD was 1.46%(n=6).Conclusion：This method is simple to handle，rapid and accurate，which can be used to control the quality for the seed ofVaccariasegetalis.

Vaccariasegetalis；Chlorogenic acid；Rutin；HPLC

2014-04-22)

*

何鵬，主管中藥師，研究方向：藥品標準和藥品檢驗分析；Tel：(0553)5853053，E-mail：frankwade@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.12.007