黃成鋼　劉岸　唐敏

【摘要】 目的：探討直腸癌組織中生長激素釋放肽（Ghrelin）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。方法：應(yīng)用免疫組織化學方法及Western blot檢測Ghrelin和MMP-9在21例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及35例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移直腸癌組織中的表達水平的表達，分析Ghrelin和MMP-9與直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的關(guān)系及兩者的相關(guān)性。結(jié)果：Ghrelin和MMP-9在直腸癌組織中的陽性表達率分別為53.57%和80.36%，明顯高于癌旁正常組織（P<0.05）；Ghrelin和MMP-9蛋白表達與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比率聯(lián)系密切，并且在直腸癌組織中的陽性表達隨著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個數(shù)增加而增加（P<0.05）；Ghrelin與MMP-9的陽性表達呈正相關(guān)（κ=0.832，P<0.001）。結(jié)論：Ghrelin和MMP-9表達升高與直腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，聯(lián)合檢測Ghrelin和MMP-9可能對直腸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預后評估具有重要臨床價值。

【關(guān)鍵詞】 直腸癌； Ghrelin； MMP-9； 淋巴轉(zhuǎn)移

作為消化系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一，直腸癌患者的預后與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[1]。淋巴轉(zhuǎn)移作為直腸癌最常見的轉(zhuǎn)移方式，也是影響患者預后的重要因素，目前尚未有效的預測指標對臨床發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的高危人群進行篩選，因此，尋找新的可用于臨床診斷和預后預測的分子標記，早期發(fā)現(xiàn)并給予早期干預，對提高直腸癌患者預后具有積極的意義。近年來的研究表明，生長激素釋放肽（growth hormone releasing peptide，Ghrelin）作為一種生長激素促泌劑受體的內(nèi)源性配體，可產(chǎn)生廣泛的生物學效應(yīng)，在前列腺癌、胃癌和結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤中表達升高，并與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[2-4]?；|(zhì)金屬蛋白酶-9（Matrix metalloproteinases-9，MMP-9）作為基質(zhì)金屬蛋白酶家族中最重要的蛋白水解酶，在調(diào)控腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮了重要作用[5]。本研究通過檢測Ghrelin和MMP-9在21例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移直腸癌組織及35例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移直腸癌組織中的表達水平，并分析其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，以期更好地評價直腸癌患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風險。

1 資料與方法

1.1 一般資料 56例直腸癌組織標本取自2010年1月-2013年1月在本院胃腸外科行手術(shù)切除的直腸癌患者，其中男31例，女25例，年齡24～81歲，中位年齡53歲。所有病例均術(shù)后經(jīng)病理檢查證實為直腸腺癌，患者均為首次接受腫瘤手術(shù)治療，術(shù)前均未行放化療。送檢淋巴結(jié)12～45枚，平均（15.21±3.58）枚，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以術(shù)后病理檢查為準，其中無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移35例。術(shù)后20 min內(nèi)每份標本取材于腫瘤組織和癌旁正常黏膜組織（距腫瘤組織邊緣>5 cm），迅速分成兩份，分別置于-80 ℃冰箱保存和10%中性甲醛中固定備用。

1.2 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比率（LNR） 將腫瘤標本按淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比率分為：LNR0（0），LNR1（<10%），LNR2（10%～25%），LNR3（>25%）。LNR=陽性淋巴結(jié)數(shù)/全部被檢淋巴結(jié)數(shù)×100%。

1.3 試劑 兔抗人Ghrelin多克隆抗體購自Sigma公司，兔抗人MMP-9多克隆抗體購自Cell Signaling公司，DAB顯色試劑盒和S-P試劑盒均購至北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)研究所。

1.4 免疫組化檢測Ghrelin和MMP-9蛋白的表達 采用S-P法進行免疫組織化學檢測，具體步驟：將直腸癌組織標本超薄切片后常規(guī)脫蠟，0.3%的H2O2去離子水孵化20 min，經(jīng)抗原修復后分別加入Ghrelin（工作濃度1：50）和MMP-9（工作濃度為1∶150）在37 ℃下孵育3 h，PBS液沖洗3次；滴加生物素標記的二抗在室溫下孵育30 min，PBS液沖洗3次；應(yīng)用DAB顯色劑顯色，經(jīng)充分沖洗、復染、脫水、透明和封片。并以PBS代替一抗作為陰性對照。在直腸癌組織中Ghrelin和MMP-9陽性細胞以細胞質(zhì)呈棕黃色顆粒為陽性。結(jié)果由2位病理科醫(yī)師獨立閱片判斷結(jié)果。低倍鏡（×100）下隨機選擇5個視野，每個視野計數(shù)200個細胞，共計數(shù)1000個細胞。結(jié)果判定標準為：（1）無陽性細胞為0分，陽性細胞數(shù)<25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%計3分，76%～100%計4分；（2）著色強度為淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色計3分。以（1）和（2）的乘積作為評分，≤3分為陰性，>3分為陽性。

1.5 Western blot檢測Ghrelin和MMP-9蛋白的表達 直腸癌標本從-80 ℃冰箱內(nèi)取出后，裂解細胞并分離細胞蛋白質(zhì)，用Bradford法測量蛋白濃度后取等量蛋白質(zhì)樣品（20 μg/孔），常規(guī)8% SDS-PAGE電泳，半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，加入p-AKT一抗（1∶1000）于4 ℃下孵育過夜，HRP標記的羊抗兔IgG為第二抗體（1∶2500）室溫孵育1 h，ECL顯色，條帶暴光強度用Quantity One 4.6.2（BIO，RAD）軟件分析，以β-actin為內(nèi)參，通過與內(nèi)參的灰度比，得出目的條帶的相對表達水平。

1.6 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，對所有實驗數(shù)據(jù)進行組間樣本率比較用 字2檢驗，相關(guān)性分析應(yīng)用等級資料的Spearman秩相關(guān)檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Ghrelin和MMP-9在直腸癌組織中的表達情況 如圖1所示，Ghrelin和MMP-9染色陽性細胞表現(xiàn)為胞核不著色，胞質(zhì)染成棕褐色。在56例直腸癌中，Ghrelin和MMP-9的陽性表達率分別為53.57%和80.36%，在56例癌旁正常黏膜組織中，Ghrelin和MMP-9的陽性表達率分別為12.50%和16.07%，Ghrelin和MMP-9在直腸癌組織中的表達率均明顯高于癌旁正常黏膜組織中的表達（P<0.05）。如表1所示，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性率低的患者相比較，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高的患者中Ghrelin和MMP-9陽性表達率明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。各組腫瘤組織切片均以PBS（Phosphate Buffer solution）代替特異性一抗作為空白對照組，腫瘤組織鏡下均無陽性表達。

圖1 Ghrelin和MMP-9在直腸癌組織中的表達（400×）

注：有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（圖1a、1b），無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（圖1c、1d）

表1 Ghrelin、MMP-9蛋白在癌旁正常組織及直腸癌組織中的

表達 例

組織來源 Ghrelin 字2值 P值 MMP-9 字2值 P值

- + - +

癌旁正常組織（n=56） 49 7 4.624 0.021 47 9 9.624 0.003

LNR0（n=21） 14 7 7 14

LNR1（n=9） 5 4 2 7

LNR2（n=17） 5 12 2 15

LNR3（n=9） 2 7 0 9

2.2 Ghrelin和MMP-9在直腸癌組織中的表達 如圖2所示，Western blot檢測結(jié)果表明Ghrelin和MMP-9蛋白在直腸癌組織中的表達隨著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移增加而明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.3 直腸癌中Ghrelin與MMP-9表達的相關(guān)性分析 在56例直腸癌組織標本中，通過Spearman等級相關(guān)分析顯示直腸癌組織中Ghrelin的陽性表達與和MMP-9的陽性表達呈顯著正相關(guān)（κ=0.832，P<0.001），見表2。

表2 直腸癌中Ghrelin與MMP-9表達的關(guān)系 例

Ghrelin MMP-9 合計

- + ++ +++

- 7 11 4 4 26

+ 2 6 4 2 14

++ 1 3 5 2 11

+++ 1 1 1 2 5

合計 11 21 14 10 56

3 討論

直腸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響直腸癌患者根治術(shù)后生存率的最重要因素之一，侵襲和轉(zhuǎn)移作為惡性腫瘤的主要生物學特性，其過程是是由多種基因調(diào)控共同作用的結(jié)果。直腸癌作為消化道最常見的惡性腫瘤之一，腫瘤轉(zhuǎn)移是判斷患者預后和確定治療方案的重要依據(jù)，當前僅靠單一化驗指標對直腸癌患者預后進行評估的準確性不高，因此尋求一種新的生物學標志物以期早期發(fā)現(xiàn)及阻斷直腸癌轉(zhuǎn)移，從而提高患者預后成為當前直腸癌的重點研究方向。

Ghrelin是1999年由日本Kojima等發(fā)現(xiàn)的生長激素促泌劑受體的內(nèi)源性配體，為含有28個氨基酸的活性多肽，其與受體結(jié)合后可產(chǎn)生廣泛的生物學效應(yīng)，如促進生長激素分泌、減少脂肪利用、維持能量正平衡[5]。另外，Ghrelin還可促進胃酸分泌，增加胃腸蠕動和保護心臟等[6-7]。研究表明，嬰兒和胎兒有大量的Ghrelin生成細胞，但隨年齡增長Ghrelin分泌細胞不斷減少，從而提示Ghrelin與細胞增殖和分化有一定聯(lián)系[8]。2002年，Riondino等[4]首先報道Ghrelin與肝癌細胞的惡性增殖有一定聯(lián)系；在隨后的研究中，更多報道表明Ghrelin在促進多種惡性腫瘤增殖中發(fā)揮了巨大作用[2-3]；另外，在對結(jié)腸癌研究中發(fā)現(xiàn)，Ghrelin不僅與體外惡性腫瘤細胞侵襲有巨大聯(lián)系，而且與體內(nèi)腫瘤分期有一定聯(lián)系，從而表明Ghrelin與惡性腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[9]。在本研究中，Ghrelin在56例直腸癌組織中的陽性表達率為53.57%，明顯高于癌旁正常黏膜組織中的表達（12.50%），提示Ghrelin的表達上調(diào)與可能與直腸癌的發(fā)生相關(guān)。同時對Ghrelin的表達與直腸癌臨床病理特征進行分析可知，Ghrelin表達與直腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度相關(guān)；另外Ghrelin在直腸癌中的表達隨著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移增加而增加，進一步提示Ghrelin在促進直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了一定的作用，與文獻[4]報道相符。

在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的過程中，金屬蛋白酶家族（MMPs）在促進腫瘤細胞侵襲、細胞外基質(zhì)降解和腫瘤細胞遠處轉(zhuǎn)移等多種生物學行為中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，Ⅳ型膠原酶（MMP-9）作為金屬蛋白酶家族中最重要成員，MMP-9可降解細胞外基質(zhì)和基底膜，并促進腫瘤新生血管的生成，與腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[10-13]。同時有研究表明，惡性腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的能力與腫瘤細胞產(chǎn)生MMP-9的能力呈正相關(guān)，從而在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中扮演著重要角色[14]。在本研究中，筆者采用免疫組織化學的方法檢測MMP-9在直腸惡性腫瘤組織以及癌旁正常黏膜組織中的表達，結(jié)果表明，MMP-9在人直腸癌組織的陽性表達率高于癌旁正常黏膜組織中的表達，并且MMP-9在直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高的患者中表達進一步上調(diào)。表明MMP-9的陽性表達與直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，MMP-9蛋白的表達可作為判斷直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的參考標志物，有助于直腸癌患者預后的評價。筆者在對Ghrelin和MMP-9在直腸癌組織中的表達進行相關(guān)性分析可知，Ghrelin的陽性表達同MMP-9的陽性表達成正相關(guān)，表明Ghrelin和MMP-9在直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移過程中存在協(xié)同作用，Ghrelin和MMP-9的表達程度越高，直腸癌越容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

綜上所述，本研究表明Ghrelin和MMP-9的陽性表達與直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，并且Ghrelin和MMP-9在直腸癌組織中的表達呈正相關(guān)，聯(lián)合檢測Ghrelin和MMP-9在直腸癌患者中的表達可能為腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移提供一定有價值的臨床參考，并為下一步探討Ghrelin和MMP-9在直腸癌中的作用機制打下基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2014-05-28） （本文編輯：歐麗）

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（收稿日期：2014-05-28） （本文編輯：歐麗）