高 翔，楊柏林，丁光輝，熊德琪

（大連海事大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連 116026）

隨著石油工業(yè)和海上運(yùn)輸業(yè)的發(fā)展，各類(lèi)溢油事故頻發(fā)［1］，大量石油烴通過(guò)各種途徑進(jìn)入海洋。溢油污染已經(jīng)嚴(yán)重?fù)p害了海洋生態(tài)環(huán)境［2］，并給我國(guó)海洋漁業(yè)，海洋生物資源造成了極大損失［3－6］。溢油污染使得海底環(huán)境油污染程度日益增高，破壞了底棲生物的生存環(huán)境，對(duì)底棲生物的生長(zhǎng)、繁殖產(chǎn)生不同程度的影響［7］。更為嚴(yán)重的是，石油烴會(huì)通過(guò)生物攝取進(jìn)入食物鏈，進(jìn)而在人體中富集，而它在人體內(nèi)的持久存在會(huì)對(duì)人類(lèi)健康產(chǎn)生極大的負(fù)面影響［8－11］。因此，石油烴污染對(duì)海洋生物產(chǎn)生的毒性效應(yīng)以及海洋環(huán)境的石油烴污染監(jiān)測(cè)亟待人們深入研究。

目前，國(guó)內(nèi)外研究人員已經(jīng)開(kāi)展了大量關(guān)于石油烴污染對(duì)海洋生物毒性效應(yīng)方面的研究［12－17］，但大部分研究主要針對(duì)原油對(duì)海洋浮游植物及魚(yú)貝類(lèi)的毒性效應(yīng)［18－21］。前人的研究發(fā)現(xiàn)石油烴污染會(huì)造成魚(yú)貝類(lèi)氧化脅迫，抑制其酶活性，產(chǎn)生遺傳毒性和生物蓄積作用［22－24］，而其對(duì)海洋底棲生物的毒性效應(yīng)和致毒機(jī)理尚不完全明確。大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)海水中石油的質(zhì)量濃度為1mg／L或溶于水的石油烴的質(zhì)量濃度為1μg／L時(shí)，就能對(duì)敏感生物產(chǎn)生危害［25］。國(guó)內(nèi)外許多研究也已經(jīng)證實(shí)輕質(zhì)燃油的毒性較其它油品更大［26－28］。谷胱甘肽（GSH）作為生物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的一部分，對(duì)污染物的脅迫十分敏感，其活性變化可為污染物脅迫下機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)提供敏感信息。因此，GSH被作為分子生物標(biāo)志物廣泛用于環(huán)境污染的早期預(yù)警。綜上，本研究選取國(guó)內(nèi)常用的船用輕質(zhì)燃油——0號(hào)柴油作為受試油品，以國(guó)內(nèi)常見(jiàn)的海洋底棲生物——馬糞海膽作為受試生物，考察了石油烴污染對(duì)海膽體內(nèi)GSH含量的影響，為評(píng)估溢油污染對(duì)海洋底棲生物的毒性效應(yīng)并尋找適合檢測(cè)石油烴污染的生物標(biāo)志物提供一定依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 受試生物

本實(shí)驗(yàn)采用的馬糞海膽（Hemicentrotuspulcherrimus）購(gòu)于大連碧龍海珍品養(yǎng)殖公司。在水溫18±2℃、鹽度31.4的實(shí)驗(yàn)室條件下暫養(yǎng)3個(gè)月后，選擇健康、反應(yīng)靈活、大小一致的海膽進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)用海膽直徑6±0.2cm、體重67.2±4.6g、30個(gè)月齡左右。

1.2 主要儀器與試劑

主要儀器：JDS－109U紅外測(cè)油儀（吉林市北光分析儀器廠）；JB－3型磁力攪拌器（上海市悅豐儀器儀表有限公司）；Beckman J2－MC型高速冷凍離心機(jī)（BECKMAN美國(guó)公司）；BS210S萬(wàn)分之一電子天平 （北京賽多利斯天平公司）。

主要試劑：GSH檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）；考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；紅外測(cè)油專(zhuān)用四氯化碳（天津光復(fù)精細(xì)化工研究所）。

1.3 受試液的制備

1.3.1 過(guò)濾海水

砂濾海水取自大連市星海灣，其鹽度為31.35，電導(dǎo)率為47.3ms／cm，pH值為8.130。

1.3.2 0號(hào)柴油分散液（WAFs）的制備

本研究所用0號(hào)柴油由大連市海事局提供。將0號(hào)柴油與過(guò)濾海水按體積比1∶9混合，磁力攪拌器低速攪拌24h，靜置4h后，分離下層水相即為母液。將母液置于4℃環(huán)境中避光保存，實(shí)驗(yàn)前稀釋至所需質(zhì)量濃度。

1.3.3 0號(hào)柴油分散液（WAFs）石油烴質(zhì)量濃度的測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)參照GB／T16488－1996《水質(zhì)石油類(lèi)和動(dòng)植油的測(cè)定》所介紹的紅外光度法測(cè)定母液中的石油烴質(zhì)量濃度：1）用CCl4分兩次萃取水體中的石油烴；2）將萃取液通過(guò)特定活性的硅酸鎂吸附，脫除動(dòng)植物油等極性化合物；3）將其置于紅外測(cè)油儀中，分別于波數(shù)為2 930，2 960和3 030cm－1譜帶處測(cè)得吸光度A2930、A2960和A3030，并進(jìn)行計(jì)算。計(jì)算公式為：

式中，C為溶劑中石油烴質(zhì)量濃度；X、Y、Z為各波長(zhǎng)對(duì)應(yīng)的校正系數(shù)；F為脂肪烴對(duì)芳烴的影響校正因子。

1.4 暴露實(shí)驗(yàn)

暴露實(shí)驗(yàn)按照0號(hào)柴油分散液的質(zhì)量濃度差異設(shè)置為低質(zhì)量濃度組（5mg／L）、中質(zhì)量濃度組（20mg／L）、高質(zhì)量濃度組（50mg／L）。每組隨機(jī)選取馬糞海膽5只（不區(qū)分雌雄），置于32cm×16.5cm×24cm玻璃缸中采用靜水法避光暴露，暴露溶液總體積為6 500mL。實(shí)驗(yàn)期間每隔12h換受試液一次，并投入一定的餌料。暴露時(shí)長(zhǎng)為13d，之后為恢復(fù)期。分別于暴露1、5、9、13和24d后進(jìn)行海膽體內(nèi)GSH含量的分析和測(cè)定。

1.5 GSH含量測(cè)定

用電子天平準(zhǔn)確稱(chēng)量一定質(zhì)量的海膽組織（腸和性腺）。用4℃預(yù)冷的滅菌注射器準(zhǔn)確抽取一定體積（80μL）的海膽體液，分別置于1mL離心管中。然后加入pH為7.8的磷酸緩沖液或生理鹽水稀釋9倍后，用勻漿儀沖搗制成10%的組織勻漿液，轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中（冰上操作）。將離心管置于高速冷凍離心機(jī)中，以9 000r／min（約為9 257.14g）的轉(zhuǎn)速離心20min，取上清液，置于4℃環(huán)境中保存。GSH及蛋白質(zhì)含量（考馬斯亮藍(lán)法）的測(cè)定均按照試劑盒方法進(jìn)行操作。

測(cè)定組織中GSH含量時(shí)，所采用單位為：U／mgprot，表示每mg蛋白質(zhì)中的活力單位。測(cè)定體現(xiàn)中GSH含量時(shí)所用單位為U／mL，表示每mL液體中的活力單位。

1.6 數(shù)據(jù)處理

1.6.1 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

本研究采用SPSS 19.0數(shù)據(jù)分析軟件，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析：當(dāng)P≤0.05時(shí)認(rèn)為差異顯著；P≤0.01時(shí)認(rèn)為差異極顯著。

1.6.2 誘導(dǎo)率及抑制率計(jì)算方法

1）誘導(dǎo)率計(jì)算公式：

式中，Ni為實(shí)驗(yàn)組受誘導(dǎo)后GSH含量；N為對(duì)照組GSH含量。

2）抑制率計(jì)算公式：

式中，Ns為實(shí)驗(yàn)組受抑制后GSH含量；N為對(duì)照組GSH含量。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 馬糞海膽體內(nèi)GSH含量的組織分布

將正常生理?xiàng)l件下馬糞海膽體內(nèi)的GSH含量加以統(tǒng)計(jì)（表1），由表1可見(jiàn)，在正常條件下海膽的腸、體液和生殖腺中GSH含量有明顯差異。

表1 馬糞海膽GSH含量在各組織中的分布情況Table 1 The tissue distributions of GSH content in Hemicentrotus Pulcherrimus

2.2 0號(hào)柴油分散液對(duì)馬糞海膽腸道GSH含量的影響

0號(hào)柴油分散液對(duì)海膽腸道GSH含量影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)海水對(duì)照組的GSH含量基本穩(wěn)定。低質(zhì)量濃度組GSH含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在9d時(shí)GSH含量達(dá)到峰值；中質(zhì)量濃度組GSH合成在5d時(shí)受到誘導(dǎo)，含量較1d時(shí)有顯著上升，暴露9d時(shí)GSH含量較5d時(shí)變化不大，13d時(shí)含量則大幅降低；高質(zhì)量濃度組GSH合成在1d時(shí)即受到誘導(dǎo)，含量明顯上升，并在此后幾天持續(xù)下降。3個(gè)質(zhì)量濃度組腸道GSH含量隨時(shí)間的變化基本上遵循先升高后降低的規(guī)律，而高質(zhì)量濃度組GSH含量在1d時(shí)即達(dá)到峰值，為對(duì)照組的152%，時(shí)間－劑量效應(yīng)十分顯著。當(dāng)24d完成恢復(fù)實(shí)驗(yàn)時(shí)，3個(gè)質(zhì)量濃度組之間GSH含量基本趨于一致，無(wú)明顯差異。

2.3 0號(hào)柴油分散液對(duì)馬糞海膽體液GSH含量的影響

0號(hào)柴油分散液對(duì)海膽體液中GSH含量影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期中海水對(duì)照組GSH含量基本不變。由圖2可知：低濃度組在暴露5d時(shí)GSH含量開(kāi)始升高并在9d時(shí)達(dá)到最大值，在13d時(shí)GSH含量回落，且下降幅度較大；中濃度組在暴露1d時(shí)GSH含量較對(duì)照組明顯偏低，在暴露5d后GSH合成受到誘導(dǎo)而上升，并在9d時(shí)達(dá)到峰值，13d時(shí)GSH含量回落；高濃度組在暴露1d時(shí)GSH含量偏高并持續(xù)上升，在5d時(shí)達(dá)到最大值，暴露9d時(shí)GSH含量顯著下降，13d時(shí)含量與9d時(shí)基本持平。3個(gè)濃度組體液GSH含量隨時(shí)間的變化基本上遵循先升高后降低的規(guī)律，時(shí)間－劑量效應(yīng)明顯。當(dāng)24d完成恢復(fù)實(shí)驗(yàn)時(shí)，3個(gè)質(zhì)量濃度組之間GSH含量基本恢復(fù)，與對(duì)照組無(wú)顯著差異。

圖1 0號(hào)柴油分散液影響馬糞海膽腸道GSH含量的時(shí)間－效應(yīng)曲線Fig.1 The time－effect responses of GSH content in intestine of Hemicentrotus pulcherrimus

圖2 0號(hào)柴油分散液影響馬糞海膽體液GSH含量的時(shí)間－效應(yīng)曲線Fig.2 The time－effect responses of GSH content in coelomic fluid of Hemicentrotus pulcherrimus

2.4 0號(hào)柴油分散液對(duì)馬糞海膽生殖腺GSH含量的影響

0號(hào)柴油分散液對(duì)海膽生殖腺GSH含量影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。暴露1d時(shí)，低、中、高質(zhì)量濃度組GSH含量均有所上升，且上升幅度與分散液濃度呈線性關(guān)系，組間差異較大；低質(zhì)量濃度組GSH含量在暴露5d時(shí)繼續(xù)上升且到達(dá)峰值，在9、13d時(shí)GSH含量持續(xù)下降；中質(zhì)量濃度組在暴露1d時(shí)GSH含量即達(dá)到最大值，并在5、9、13d時(shí)依次下降；高質(zhì)量濃度組所呈現(xiàn)趨勢(shì)與中質(zhì)量濃度組基本一致，即GSH含量在1d時(shí)達(dá)到最大值，并在此后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，3個(gè)質(zhì)量濃度組生殖腺中GSH含量隨時(shí)間延長(zhǎng)，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，時(shí)間－效應(yīng)關(guān)系明顯。當(dāng)24d完成恢復(fù)實(shí)驗(yàn)時(shí)，3個(gè)質(zhì)量濃度組之間GSH含量已趨于一致。

圖3 0號(hào)柴油分散液影響馬糞海膽生殖腺GSH含量的時(shí)間－效應(yīng)曲線Fig.3 The time－effect responses of GSH content in gonad of Hemicentrotus pulcherrimus

2.5 0號(hào)柴油分散液暴露下GSH含量的變化規(guī)律比較

為了直觀地說(shuō)明0號(hào)柴油分散液對(duì)馬糞海膽GSH含量的影響，將暴露期間海膽體內(nèi)GSH含量變化情況列于表2中。

表2 不同質(zhì)量濃度0號(hào)柴油分散液對(duì)GSH含量影響比較Table 2 Effects of concentration of WAFs on GSH content

由表2可見(jiàn)：

1）當(dāng)海膽暴露于0號(hào)柴油分散液后，體內(nèi)GSH含量會(huì)發(fā)生明顯變化：GSH作為生物體內(nèi)一種重要的抗氧化劑，可以有效地清除體內(nèi)過(guò)多的活性氧。結(jié)合GSH含量的變化可知：暴露初期，海膽受到石油烴脅迫后，體內(nèi)活性氧含量增加，使機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而產(chǎn)生適應(yīng)性誘導(dǎo)反應(yīng)，導(dǎo)致GSH含量上升。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，當(dāng)石油烴持續(xù)作用產(chǎn)生的氧化脅迫超出了機(jī)體適應(yīng)性反應(yīng)的抵御能力時(shí)，會(huì)使生物體產(chǎn)生中毒反應(yīng)，進(jìn)而抑制GSH的合成，導(dǎo)致體內(nèi)GSH含量降低。

GSH最大誘導(dǎo)量的高低與暴露時(shí)間的長(zhǎng)短及柴油分散液質(zhì)量濃度有關(guān)。實(shí)驗(yàn)前期各組織中GSH含量基本呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。說(shuō)明在暴露前期GSH含量會(huì)受分散液影響，誘導(dǎo)其合成，且最大誘導(dǎo)量隨分散液質(zhì)量濃度升高呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。這與陳榮等［29］所研究的石油暴露對(duì)僧帽牡蠣谷胱甘肽含量的影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。隨著暴露時(shí)間延長(zhǎng)，GSH受毒性作用影響合成受到抑制，其含量開(kāi)始下降，且中低質(zhì)量濃度組抑制率普遍較高濃度組高。Richardson等［30］研究多環(huán)芳烴暴露下的貽貝體內(nèi)GSH含量的變化、鄭微云等［31］及羅朝暉等［32］分別研究0號(hào)柴油水溶性成分對(duì)真鯛、褐菖鲉臟器組織中GSH含量的影響、Cheung等［33］研究苯并［a］芘暴露對(duì)貽貝的GSH含量的影響，都得到了相似的結(jié)論。

2）馬糞海膽在正常生理?xiàng)l件下，體內(nèi)GSH含量存在組織差異性，這與不同組織的生理結(jié)構(gòu)和功能有關(guān)。其中體液中GSH的含量高于組織，而組織中GSH含量的大小順序?yàn)槟c＞生殖腺。通過(guò)比較暴露實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知：在受到誘導(dǎo)時(shí)，組織中GSH變化量的大小表現(xiàn)為組織＞體液，而在組織中腸的變化量＞生殖腺。這可能是由于海膽體內(nèi)GSH主要來(lái)源是腸，而體液中的GSH則是外源性的。

高質(zhì)量濃度組GSH最大誘導(dǎo)量出現(xiàn)時(shí)間早于低質(zhì)量濃度組，是由于高質(zhì)量濃度污染產(chǎn)生的誘導(dǎo)信號(hào)較強(qiáng)，由此海膽的適應(yīng)性誘導(dǎo)反應(yīng)較中、低質(zhì)量濃度組更為顯著。結(jié)合Steadman等［34］及汪美珍等［35］分別對(duì)虹鱒魚(yú)和黑斑蛙的研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)較低質(zhì)量濃度下，在未被誘導(dǎo)合成的污染初期，GSH作為抗氧化劑被大量消耗，而誘導(dǎo)在時(shí)間上又有一定的滯后性，因此GSH含量變化表現(xiàn)出誘導(dǎo)期的延后。

3 結(jié) 論

本文研究了0號(hào)柴油分散液對(duì)馬糞海膽體內(nèi)各組織中GSH含量的影響，得到如下結(jié)論：

（1）海膽暴露后各組織中GSH含量隨暴露時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先誘導(dǎo)后抑制的趨勢(shì)。說(shuō)明機(jī)體既可在石油烴暴露下產(chǎn)生適應(yīng)性誘導(dǎo)反應(yīng)（GSH含量上升），也可由于其毒性作用而產(chǎn)生中毒反應(yīng)，導(dǎo)致GSH含量下降。

（2）GSH最大誘導(dǎo)量出現(xiàn)的時(shí)間隨分散液質(zhì)量濃度的降低而有所延后。分散液質(zhì)量濃度與最大誘導(dǎo)量呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，而與抑制率呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系。

（3）馬糞海膽體內(nèi)GSH含量在暴露前后都呈現(xiàn)出組織差異性，表現(xiàn)為暴露前體液＞腸＞生殖腺，而當(dāng)GSH受到誘導(dǎo)時(shí)，其變化量則表現(xiàn)為腸＞生殖腺＞體液。

（4）0號(hào)柴油分散液暴露后，海膽體內(nèi)GSH含量變化的劑量－效應(yīng)和時(shí)間－效應(yīng)關(guān)系顯著。證明GSH含量對(duì)石油烴暴露較為敏感，適合作為監(jiān)測(cè)石油烴污染的生物標(biāo)志物。

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