王云等

摘 要： 2013年，在山東泰安采集到疑似感染黃瓜綠斑駁花葉病毒（Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）的絲瓜樣品，利用該病毒外殼蛋白（Coat protein，CP）特異引物CG-CPF/CPR對(duì)樣品進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序。所得序列（GenBank登錄號(hào)：KJ187042）經(jīng)NCBI BLAST比對(duì)，與已登錄的CGMMV序列的相似性均大于92.6%，確定為黃瓜綠斑駁花葉病毒。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，CGMMV山東絲瓜分離物（CGMMV-SDLoofah）與遼寧分離物（CGMMV-LN）等大多數(shù)國(guó)內(nèi)CGMMV分離物同聚為一個(gè)進(jìn)化組，從而進(jìn)一步確定了CGMMV山東絲瓜病毒分離物為黃瓜綠斑駁花葉病毒。這是首次報(bào)道黃瓜綠斑駁花葉病毒侵染絲瓜。

關(guān)鍵詞： 絲瓜；黃瓜綠斑駁花葉病毒；外殼蛋白；分子鑒定

中圖分類號(hào)： S436.429 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)： 1001 - 4942（2014）08 - 0010 - 05

Molecular Identification of an Isolate of Cucumber

Green Mottle Mosaic Virus Infecting Loofah in Shandong

Wang Yun1， Xin Zhimei2， Zhao Liming3， Zhu Xiaoping3*， Wang Yunxiang4

（1. Qiaoguan Agricultural Extension Center of Changle County， Changle 262408， China；2. Institute of Plant Protection，

Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250100， China；3. College of Plant Protection， Shandong Agricultural

University， Taian 271018， China； 4.Xing an Street Office of Anqiu City， Anqiu 262100， China）

Abstract An isolate of cucumber green mottle mosaic virus （CGMMV） was obtained from loofah showing typical symptoms in Taian， Shandong Province， in 2013. The nucleotide sequence of the coat protein （CP） of this isolate （CGMMV-SDLoofah） was amplified and sequenced using specific primer pair CG-CPF/CPR. The sequence analysis showed the sequence of CGMMV-SDLoofah （GenBank accession number： KJ187042） had 92.6% of identity with other isolates of CGMMV in GenBank， so it was confirmed as the CGMMV. The phylogenic analysis results indicated that CGMMV-SDLoofah could be clustered together with Liaoning isolate （CGMMV-LN） and most other CGMMV isolates from China， which further confirmed that the CGMMV-SDLoofah was an isolate of CGMMV. This was the first report of CGMMV infecting loofah in China.

Key words Loofah； Cucumber green mottle mosaic virus （CGMMV）； Coat protein；Molecular identification

黃瓜綠斑駁花葉病毒（Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）為煙草花葉病毒屬 （Tobamovirus） 成員，該病毒最早在黃瓜上發(fā)現(xiàn)，西瓜、甜瓜、葫蘆等瓜類植物都是該病毒的寄主，主要癥狀為葉片斑駁、系統(tǒng)性花葉。在西瓜上，該病毒常引起果肉爛瓤變質(zhì)而失去商品價(jià)值，是重要的種傳葫蘆科蔬菜病毒病，常造成產(chǎn)量和品質(zhì)的嚴(yán)重?fù)p失，為我國(guó)進(jìn)境和全國(guó)植物檢疫性有害生物。

CGMMV在日本、韓國(guó)等東亞國(guó)家以及西亞的阿拉伯地區(qū)、中亞的巴基斯坦等國(guó)家發(fā)生普遍[1]。在我國(guó)，2004年首次從日本進(jìn)口的南瓜種子中檢測(cè)截獲CGMMV，2005年秦碧霞等在廣西的觀賞南瓜上發(fā)現(xiàn)該病毒[2]，隨后在遼寧、北京、山東、甘肅、廣東等地也陸續(xù)報(bào)道了該病毒在田間的為害發(fā)生[3～6]。國(guó)內(nèi)已報(bào)道的受該病毒侵染的葫蘆科蔬菜多為西瓜、黃瓜、西葫蘆和南瓜，本研究2013年首次在絲瓜上檢測(cè)到CGMMV，并對(duì)其外殼蛋白基因進(jìn)行了測(cè)序和分子鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 感病樣品采集 待測(cè)絲瓜樣品于2013年采自山東泰安田間，并保存在-80℃冰箱，用于RNA提取等后續(xù)試驗(yàn)。

1.1.2 菌株、載體和試劑 克隆載體pMD18-T購自TaKaRa公司；大腸桿菌 （Escherichia coli） DH5α菌株由本試驗(yàn)室保存；RNA提取試劑，購自天根公司；RNase Inhibitor、RTase M-MLV（RNase H-）、T4 DNA連接酶購自TaKaRa公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒，購自杭州愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司；Easy Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Trans 2K Plus，均購自北京全式金公司；其它生化試劑及普通化學(xué)試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 感病絲瓜樣品總RNA的提取及RT-PCR擴(kuò)增 稱取寄主植物葉片0.1 g，加液氮研磨成粉末，按TRIzol法提取葉片總RNA，用于后續(xù)試驗(yàn)cDNA的合成，以未發(fā)病的健康絲瓜植株葉片總RNA作為陰性對(duì)照。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與RT-PCR擴(kuò)增 參照GenBank中HM008919序列設(shè)計(jì)上游引物（CG-CPF，位于5763-5765）：5′-ATGGCTTACAATCCGATCACACC-3′；下游引物（CG-CPR，位于6224-6248）：5′-CTAAGCTTTCGAGGTGGTAGCCTC-3′，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小為486 bp。 反轉(zhuǎn)錄體系：模板RNA 6.0 μL，下游引物2.0 μL，RNase- Free H2O 5.5 μL，70℃變性10 min，冰上放置2 min，再加入下列試劑：5×M-MLV Buffer 4 μL，dNTP mixture （各10 mmol/L）1.0 μL，RTase M-MLV（RNase H-）（200 U/μL）1.0 μL，RNase Inhibitor（40 U/μL）0.5 μL，總體積為20 μL。42℃保溫60 min，再70℃保溫15 min。取上述反應(yīng)產(chǎn)物2 μL做模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件：94℃ 3 min，1個(gè)循環(huán)；94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 50 s，25個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pMD18-T 載體上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α細(xì)菌細(xì)胞，選擇陽性克隆，委托上海博尚生物科技有限公司完成雙向測(cè)序。

1.2.3 序列比對(duì)分析 利用BLAST對(duì)病毒樣品外殼蛋白核苷酸的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，在NCBI上選取已登錄的有代表性的CGMMV外殼蛋白序列（表1），通過DNAStar軟件中的MegAlign對(duì)已知序列進(jìn)行一致率分析，系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建利用Mega 5.0的鄰接法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 感病絲瓜樣品的分子檢測(cè)

在亞洲，韓國(guó)從1995年開始爆發(fā)黃瓜綠斑駁花葉病毒病害[11]，而日本早在1971年即在關(guān)東地區(qū)大面積發(fā)生該病害[12]，商品化育苗和種苗貿(mào)易是該病毒地區(qū)間傳播和擴(kuò)散的主要原因[13～15]。一般認(rèn)為，國(guó)內(nèi)該病害來自日、韓等疫區(qū)引進(jìn)的種子[5，6，9]，山東設(shè)施種植的葫蘆科蔬菜均采用工廠化育苗，且絕大多數(shù)種苗采用嫁接苗，帶毒種子的引進(jìn)和調(diào)運(yùn)應(yīng)該是CGMMV在山東及我國(guó)其他地區(qū)尤其是設(shè)施蔬菜種植區(qū) 蔓延擴(kuò)展的主要因素，因此加強(qiáng)種子的檢疫和種苗處理才能有效控制CGMMV的蔓延。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1] Varveri C， Vassilakos N， Bem F. Characterization and detection of cucumber green mottle mosaic virus in Greece [J]. Phytoparasitica， 2002， 30（5）：493-501.

[2] 秦碧霞， 蔡健和， 劉志明， 等. 侵染觀賞南瓜的黃瓜綠斑 駁花葉病毒的初步鑒定[J]. 植物檢疫， 2005，19（4）：198- 200.

[3] 陳紅運(yùn)， 趙文軍， 程毅， 等. 遼中地區(qū)西瓜花葉病病原的分子鑒定[J]. 植物病理學(xué)報(bào)， 2006， 36（4）：306-309.

[4] 李紅霞， 白靜， 陳紅運(yùn)， 等.南瓜果實(shí)中黃瓜綠斑駁花葉病毒的RT-PCR檢測(cè)及cp基因序列分析[J].植物檢疫， 2007，21（5）：268-270.

[5] 田永蕾， 劉冬梅， 張永江， 等. 黃瓜綠斑駁花葉病毒北京和山東分離物的生物學(xué)測(cè)定及其基因組比較[J]. 植物檢疫， 2009，23（6）：1-6.

[6] 張衛(wèi)東， 權(quán)永兵， 廖力，等. 黃瓜綠斑駁花葉病毒廣東分離物的分子鑒定[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011（20）：73-76.

[7] 秦碧霞， 蔡健和， 劉志明， 等. 侵染葫蘆的黃瓜綠斑駁花葉病毒廣西分離物分子鑒定[J]. 植物保護(hù)， 2008， 34（1）： 116-118.

[8] 吳鑫， 丁元明， 何月秋， 等. 黃瓜綠斑駁花葉病毒的分子檢測(cè)及云南分離物的序列分析[J]. 揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)：農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，2010，31（3）： 75-80.

[9] 陳紅運(yùn)， 林石明，陳青，等. 黃瓜綠斑駁花葉病毒遼寧分離物全基因組序列測(cè)定[J]. 病毒學(xué)報(bào)，2009，25（1）： 68-72.

[10] 李曉穎， 江蓓蓓， 王迅， 等. 黃瓜綠斑駁花葉病毒山東南瓜分離物外殼蛋白基因序列分析[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（7）：1-4.

[11] Choi G S. Occurrence of two tobamovirus diseases in cucurbits and control measures in Korea [J]. Plant Pathology Journal， 2001， 17（5）： 243-248.

[12] Komuro Y， Tochihara H ， Fukatsu R， et al . Cucumber green mottle mosaic virus （watermelon strain） in watermelon and its bearing on deterioration of watermelon fruit known as konnyaku disease [J]. Annals Phytopathologica1 Society of Japan， 1971， 37： 34-42.

[13] Lee K W. Occurrence of cucumber green mottle mosaic virus disease of watermelon in Korea [J]. Korean Journal of Plant Pathology， 1990， 6（2）： 250- 255.

[14] Tochihara H， Komuro Y. Infectivity test and serological relationships among various isolates of cucumber green mottle mosaic virus some deduction of the invasion route of the virus into Japan [J]. Annals of the Phytopathological Society of Japan， 1974， 40 （1）： 52-58.

[15] Yoon J Y， Choi G S， Choi S K，et al. Molecular and biological diversities of cucumber green mottle mosaic virus from cucurbitaceous crops in Korea [J]. Phytopathology， 2008， 156：408-412.

1.2 方法

1.2.1 感病絲瓜樣品總RNA的提取及RT-PCR擴(kuò)增 稱取寄主植物葉片0.1 g，加液氮研磨成粉末，按TRIzol法提取葉片總RNA，用于后續(xù)試驗(yàn)cDNA的合成，以未發(fā)病的健康絲瓜植株葉片總RNA作為陰性對(duì)照。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與RT-PCR擴(kuò)增 參照GenBank中HM008919序列設(shè)計(jì)上游引物（CG-CPF，位于5763-5765）：5′-ATGGCTTACAATCCGATCACACC-3′；下游引物（CG-CPR，位于6224-6248）：5′-CTAAGCTTTCGAGGTGGTAGCCTC-3′，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小為486 bp。 反轉(zhuǎn)錄體系：模板RNA 6.0 μL，下游引物2.0 μL，RNase- Free H2O 5.5 μL，70℃變性10 min，冰上放置2 min，再加入下列試劑：5×M-MLV Buffer 4 μL，dNTP mixture （各10 mmol/L）1.0 μL，RTase M-MLV（RNase H-）（200 U/μL）1.0 μL，RNase Inhibitor（40 U/μL）0.5 μL，總體積為20 μL。42℃保溫60 min，再70℃保溫15 min。取上述反應(yīng)產(chǎn)物2 μL做模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件：94℃ 3 min，1個(gè)循環(huán)；94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 50 s，25個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pMD18-T 載體上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α細(xì)菌細(xì)胞，選擇陽性克隆，委托上海博尚生物科技有限公司完成雙向測(cè)序。

1.2.3 序列比對(duì)分析 利用BLAST對(duì)病毒樣品外殼蛋白核苷酸的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，在NCBI上選取已登錄的有代表性的CGMMV外殼蛋白序列（表1），通過DNAStar軟件中的MegAlign對(duì)已知序列進(jìn)行一致率分析，系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建利用Mega 5.0的鄰接法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 感病絲瓜樣品的分子檢測(cè)

在亞洲，韓國(guó)從1995年開始爆發(fā)黃瓜綠斑駁花葉病毒病害[11]，而日本早在1971年即在關(guān)東地區(qū)大面積發(fā)生該病害[12]，商品化育苗和種苗貿(mào)易是該病毒地區(qū)間傳播和擴(kuò)散的主要原因[13～15]。一般認(rèn)為，國(guó)內(nèi)該病害來自日、韓等疫區(qū)引進(jìn)的種子[5，6，9]，山東設(shè)施種植的葫蘆科蔬菜均采用工廠化育苗，且絕大多數(shù)種苗采用嫁接苗，帶毒種子的引進(jìn)和調(diào)運(yùn)應(yīng)該是CGMMV在山東及我國(guó)其他地區(qū)尤其是設(shè)施蔬菜種植區(qū) 蔓延擴(kuò)展的主要因素，因此加強(qiáng)種子的檢疫和種苗處理才能有效控制CGMMV的蔓延。

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[4] 李紅霞， 白靜， 陳紅運(yùn)， 等.南瓜果實(shí)中黃瓜綠斑駁花葉病毒的RT-PCR檢測(cè)及cp基因序列分析[J].植物檢疫， 2007，21（5）：268-270.

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[6] 張衛(wèi)東， 權(quán)永兵， 廖力，等. 黃瓜綠斑駁花葉病毒廣東分離物的分子鑒定[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011（20）：73-76.

[7] 秦碧霞， 蔡健和， 劉志明， 等. 侵染葫蘆的黃瓜綠斑駁花葉病毒廣西分離物分子鑒定[J]. 植物保護(hù)， 2008， 34（1）： 116-118.

[8] 吳鑫， 丁元明， 何月秋， 等. 黃瓜綠斑駁花葉病毒的分子檢測(cè)及云南分離物的序列分析[J]. 揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)：農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，2010，31（3）： 75-80.

[9] 陳紅運(yùn)， 林石明，陳青，等. 黃瓜綠斑駁花葉病毒遼寧分離物全基因組序列測(cè)定[J]. 病毒學(xué)報(bào)，2009，25（1）： 68-72.

[10] 李曉穎， 江蓓蓓， 王迅， 等. 黃瓜綠斑駁花葉病毒山東南瓜分離物外殼蛋白基因序列分析[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（7）：1-4.

[11] Choi G S. Occurrence of two tobamovirus diseases in cucurbits and control measures in Korea [J]. Plant Pathology Journal， 2001， 17（5）： 243-248.

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[13] Lee K W. Occurrence of cucumber green mottle mosaic virus disease of watermelon in Korea [J]. Korean Journal of Plant Pathology， 1990， 6（2）： 250- 255.

[14] Tochihara H， Komuro Y. Infectivity test and serological relationships among various isolates of cucumber green mottle mosaic virus some deduction of the invasion route of the virus into Japan [J]. Annals of the Phytopathological Society of Japan， 1974， 40 （1）： 52-58.

[15] Yoon J Y， Choi G S， Choi S K，et al. Molecular and biological diversities of cucumber green mottle mosaic virus from cucurbitaceous crops in Korea [J]. Phytopathology， 2008， 156：408-412.

1.2 方法

1.2.1 感病絲瓜樣品總RNA的提取及RT-PCR擴(kuò)增 稱取寄主植物葉片0.1 g，加液氮研磨成粉末，按TRIzol法提取葉片總RNA，用于后續(xù)試驗(yàn)cDNA的合成，以未發(fā)病的健康絲瓜植株葉片總RNA作為陰性對(duì)照。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與RT-PCR擴(kuò)增 參照GenBank中HM008919序列設(shè)計(jì)上游引物（CG-CPF，位于5763-5765）：5′-ATGGCTTACAATCCGATCACACC-3′；下游引物（CG-CPR，位于6224-6248）：5′-CTAAGCTTTCGAGGTGGTAGCCTC-3′，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小為486 bp。 反轉(zhuǎn)錄體系：模板RNA 6.0 μL，下游引物2.0 μL，RNase- Free H2O 5.5 μL，70℃變性10 min，冰上放置2 min，再加入下列試劑：5×M-MLV Buffer 4 μL，dNTP mixture （各10 mmol/L）1.0 μL，RTase M-MLV（RNase H-）（200 U/μL）1.0 μL，RNase Inhibitor（40 U/μL）0.5 μL，總體積為20 μL。42℃保溫60 min，再70℃保溫15 min。取上述反應(yīng)產(chǎn)物2 μL做模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件：94℃ 3 min，1個(gè)循環(huán)；94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 50 s，25個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pMD18-T 載體上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α細(xì)菌細(xì)胞，選擇陽性克隆，委托上海博尚生物科技有限公司完成雙向測(cè)序。

1.2.3 序列比對(duì)分析 利用BLAST對(duì)病毒樣品外殼蛋白核苷酸的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，在NCBI上選取已登錄的有代表性的CGMMV外殼蛋白序列（表1），通過DNAStar軟件中的MegAlign對(duì)已知序列進(jìn)行一致率分析，系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建利用Mega 5.0的鄰接法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 感病絲瓜樣品的分子檢測(cè)

在亞洲，韓國(guó)從1995年開始爆發(fā)黃瓜綠斑駁花葉病毒病害[11]，而日本早在1971年即在關(guān)東地區(qū)大面積發(fā)生該病害[12]，商品化育苗和種苗貿(mào)易是該病毒地區(qū)間傳播和擴(kuò)散的主要原因[13～15]。一般認(rèn)為，國(guó)內(nèi)該病害來自日、韓等疫區(qū)引進(jìn)的種子[5，6，9]，山東設(shè)施種植的葫蘆科蔬菜均采用工廠化育苗，且絕大多數(shù)種苗采用嫁接苗，帶毒種子的引進(jìn)和調(diào)運(yùn)應(yīng)該是CGMMV在山東及我國(guó)其他地區(qū)尤其是設(shè)施蔬菜種植區(qū) 蔓延擴(kuò)展的主要因素，因此加強(qiáng)種子的檢疫和種苗處理才能有效控制CGMMV的蔓延。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1] Varveri C， Vassilakos N， Bem F. Characterization and detection of cucumber green mottle mosaic virus in Greece [J]. Phytoparasitica， 2002， 30（5）：493-501.

[2] 秦碧霞， 蔡健和， 劉志明， 等. 侵染觀賞南瓜的黃瓜綠斑 駁花葉病毒的初步鑒定[J]. 植物檢疫， 2005，19（4）：198- 200.

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[4] 李紅霞， 白靜， 陳紅運(yùn)， 等.南瓜果實(shí)中黃瓜綠斑駁花葉病毒的RT-PCR檢測(cè)及cp基因序列分析[J].植物檢疫， 2007，21（5）：268-270.

[5] 田永蕾， 劉冬梅， 張永江， 等. 黃瓜綠斑駁花葉病毒北京和山東分離物的生物學(xué)測(cè)定及其基因組比較[J]. 植物檢疫， 2009，23（6）：1-6.

[6] 張衛(wèi)東， 權(quán)永兵， 廖力，等. 黃瓜綠斑駁花葉病毒廣東分離物的分子鑒定[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011（20）：73-76.

[7] 秦碧霞， 蔡健和， 劉志明， 等. 侵染葫蘆的黃瓜綠斑駁花葉病毒廣西分離物分子鑒定[J]. 植物保護(hù)， 2008， 34（1）： 116-118.

[8] 吳鑫， 丁元明， 何月秋， 等. 黃瓜綠斑駁花葉病毒的分子檢測(cè)及云南分離物的序列分析[J]. 揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)：農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，2010，31（3）： 75-80.

[9] 陳紅運(yùn)， 林石明，陳青，等. 黃瓜綠斑駁花葉病毒遼寧分離物全基因組序列測(cè)定[J]. 病毒學(xué)報(bào)，2009，25（1）： 68-72.

[10] 李曉穎， 江蓓蓓， 王迅， 等. 黃瓜綠斑駁花葉病毒山東南瓜分離物外殼蛋白基因序列分析[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（7）：1-4.

[11] Choi G S. Occurrence of two tobamovirus diseases in cucurbits and control measures in Korea [J]. Plant Pathology Journal， 2001， 17（5）： 243-248.

[12] Komuro Y， Tochihara H ， Fukatsu R， et al . Cucumber green mottle mosaic virus （watermelon strain） in watermelon and its bearing on deterioration of watermelon fruit known as konnyaku disease [J]. Annals Phytopathologica1 Society of Japan， 1971， 37： 34-42.

[13] Lee K W. Occurrence of cucumber green mottle mosaic virus disease of watermelon in Korea [J]. Korean Journal of Plant Pathology， 1990， 6（2）： 250- 255.

[14] Tochihara H， Komuro Y. Infectivity test and serological relationships among various isolates of cucumber green mottle mosaic virus some deduction of the invasion route of the virus into Japan [J]. Annals of the Phytopathological Society of Japan， 1974， 40 （1）： 52-58.

[15] Yoon J Y， Choi G S， Choi S K，et al. Molecular and biological diversities of cucumber green mottle mosaic virus from cucurbitaceous crops in Korea [J]. Phytopathology， 2008， 156：408-412.