劉明，李海濤，劉榮梅，高繼國

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)測試中心，大慶163319；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院）

1901年日本生物學(xué)家石渡繁胤（Shigetane Ishiwatari）在研究蠶枯萎病的時候，分離出一株細(xì)菌，命名為碎倒細(xì)菌（Bacillus sotto），10年后，德國科學(xué)家貝爾林納（Ernst Berliner）從患病的地中海粉斑螟（Ephestia kuehniella）幼蟲中又分離出這種細(xì)菌，并用發(fā)現(xiàn)地德國圖林根（Thuringia）正式命名為蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt)[1]。Bt是一種內(nèi)生芽胞的革蘭氏陽性土壤細(xì)菌，在芽胞形成的同時，能產(chǎn)生不同形狀的由cry或cyt編碼的晶體蛋白，這種晶體蛋白對多種昆蟲具有特異殺蟲活性。

在農(nóng)業(yè)害蟲的防治中，最開始主要使用的是化學(xué)殺蟲劑，然而，由于化學(xué)殺蟲劑的使用會導(dǎo)致壞境污染、危害人類健康等諸多問題的產(chǎn)生。選擇抗性品系，又會引起次級害蟲的爆發(fā)[2]。經(jīng)過一個世紀(jì)的發(fā)展，由于Bt殺蟲劑對環(huán)境友好，對人畜無害等優(yōu)勢，已經(jīng)成為用于害蟲防治最成功的生物殺蟲劑。主要介紹了蘇云金芽胞桿菌cry基因資源的現(xiàn)狀及應(yīng)用情況。

1 Bt Cry毒素

Cry毒素的分類取決于其主要氨基酸的不同，1981年，Schnepf首次克隆到Bt cry基因，并證實了其殺蟲活性。截至2014年1月，全球已克隆并被Bt國際命名委員會命名的殺蟲晶體蛋白已經(jīng)超過83類，共計771個，其中模式基因290個，包括Cry1～Cry73和Cyt1～Cyt3[3]，這些Cry毒素被分為4個等級系統(tǒng)發(fā)育不相關(guān)的蛋白家族。從圖1可以看出，近年來，Bt Cry毒素的分離鑒定克隆逐年增加，尤其是模式基因的發(fā)掘數(shù)量呈良好態(tài)勢。

目前，許多公司、研究機(jī)構(gòu)致力于Bt的研究以及相關(guān)的專利保護(hù)，1970年至2013年，國際上Bt的相關(guān)專利在整體呈現(xiàn)逐年增加趨勢[4]，但是，從數(shù)量與質(zhì)量上，國內(nèi)Bt基因?qū)＠幱诹觿輀5]。

Bt對不同的害蟲幼蟲具有特異活性，其中大部分的Bt庫斯塔克（kurstaki）亞種對鱗翅目害蟲具有特異活性，以色列（israelensis）亞種對雙翅目害蟲具有特異活性，莫氏（morrisoni）亞種對鞘翅目害蟲具有特異活性。還有部分對害蟲無活性，但對無脊椎動物具有活性，比如對線蟲具有活性的Bt Cry5，Cry6類毒素。

目前8個不同的Cry蛋白的三維結(jié)構(gòu)已經(jīng)別解析 出 來 ，Cry1Aa、Cry1Ac、Cry2Aa、Cry3Aa、Cry3Ba、Cry4Aa、Cry4Ba和Cry8Ea[6-12]。通過比較發(fā)現(xiàn)，它們的三維結(jié)構(gòu)都很相似。結(jié)構(gòu)域I的7個α螺旋束與膜插入、毒素寡聚化和孔洞形成相關(guān)。結(jié)構(gòu)域Ⅱ是一個由三個反向平行的β片圍繞疏水內(nèi)核的β棱柱，與受體識別相關(guān)。結(jié)構(gòu)域Ⅲ是由2個反向平行的β片構(gòu)成的β三明治結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)域Ⅱ、Ⅲ通過對不同害蟲中腸蛋白的特異識別，與殺蟲特異性相關(guān)[13]。

早期對Bt毒素殺蟲機(jī)理研究發(fā)現(xiàn)，Bt毒素發(fā)揮殺蟲作用的殺蟲蛋白存在于伴胞晶體中，當(dāng)害蟲取食后，在害蟲中腸的堿性條件下晶體溶解產(chǎn)生原毒素，由中腸內(nèi)酶系統(tǒng)的作用，釋放出活性毒素，由毒素與昆蟲中腸內(nèi)特異的受體結(jié)合而產(chǎn)生毒殺作用。這一殺蟲機(jī)理使得某一特定的Bt毒素只對某一類昆蟲有特異的毒殺作用。而哺乳動物的胃液為酸性，腸胃中也不存在與Bt毒素相結(jié)合的受體，當(dāng)Bt毒素進(jìn)入到哺乳動物腸胃中后，在胃液的作用下幾秒鐘之內(nèi)全部降解。這也解釋了為什么Bt對哺乳動物（酸性環(huán)境、缺少相應(yīng)受體）無害、具有較窄的殺蟲譜。

2 Bt殺蟲劑

1927年，瑪特斯（Mattes）在進(jìn)行田間試驗時發(fā)現(xiàn)Bt菌株對歐洲玉米螟（Ostrinia nubilalis）具有很好的防治效果[14]，這個實驗結(jié)果，最終導(dǎo)致了第一個Bt殺蟲劑Sporeine于1938年在法國研究成功并應(yīng)用。直到1961年，由美國作為商品注冊的殺蟲劑投放市場，我國第一個商業(yè)化的Bt殺蟲劑產(chǎn)品“青蟲菌”于1965年投入使用，用于防治大菜粉底、小菜蛾等蔬菜害蟲，取得了良好的效果。

在過去50年里，世界范圍內(nèi)的農(nóng)民都把Bt作為一種殺蟲劑使用，尤其是那些有機(jī)耕田的農(nóng)民從中獲益不淺，因為Bt是為數(shù)不多的符合有機(jī)標(biāo)準(zhǔn)的殺蟲劑。隨著國際上對Bt相關(guān)的理論基礎(chǔ)和應(yīng)用基礎(chǔ)的研究不斷深入，為Bt殺蟲劑的實用化發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。20世紀(jì)60年代，菌株的改良導(dǎo)致了大量新的Bt菌株替換早期的產(chǎn)品，殺蟲效果提升達(dá)到10倍，而如今人們繼續(xù)在尋找新的，更好的菌株。大多數(shù)產(chǎn)品都是基于芽胞-晶體制劑，來源于一些野生型的Bt菌株，比如表達(dá)Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry2Aa蛋白的Bt var.kurstaki（Btk）HD1菌株，主要用于控制很多重要作物食葉性鱗翅目害蟲及森林食葉蟲[14]；或者含Cry1Ac蛋白的HD73菌株；含有Cry1Aa、Cry1Ba、Cry1Ca、Cry1Da的Bt var.aizawai HD137菌株，特異性的對食存儲糧食的鱗翅目幼蟲具有殺蟲活性；含有Cry3Aa的Bt var.san diego和Bt var.tenebrionis，主要用于防治農(nóng)業(yè)上的甲蟲；含有Cry4A、Cry4B、Cry11A、Cyt1Aa的Bti，主要用來控制傳播登革熱和瘧疾等人類疾病的蚊子[15]。部分Bt制劑產(chǎn)品在表1中列出[16]。

表1 基于野生型菌株的部分Bt制劑產(chǎn)品Table1 The topical products of Bt based on natural strains

隨著Bt殺蟲劑應(yīng)用范圍的不斷擴(kuò)大，基于單一野生型Bt菌株的殺蟲劑已經(jīng)不能滿足人們的需要，這就要求繼續(xù)開發(fā)殺蟲譜廣的Bt殺蟲劑。目前，部分產(chǎn)品通過連接、定向轉(zhuǎn)化等對已知毒素基因進(jìn)行重組，形成新的菌株[17-19]（Table 2），用以作為研發(fā)廣譜殺蟲劑的材料。

表2 基于轉(zhuǎn)化結(jié)合和重組菌株的部分Bt產(chǎn)品Table2 The topical products of Bt based on transconjugantand recombinant strains

3 轉(zhuǎn)Bt抗蟲基因作物

2014年是轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化的第19年，據(jù)國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，截至2013年，全球轉(zhuǎn)基因作物的種植面積達(dá)到1.752 hm2，比2012年上升500萬hm2，連續(xù)17年呈增長趨勢。轉(zhuǎn)基因作物涉及煙草、棉花、玉米、大米、大豆、油菜、甜菜、甜椒、番茄、木瓜、南瓜、苜蓿、白楊等，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，以達(dá)到抗蟲、抗旱、耐除草劑等目的[20]。

由于Bt對不同的害蟲幼蟲具有特異活性，但是對陽光照射敏感以及對鉆孔的害蟲殺蟲活性的局限性等因素限制了Bt制劑在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用。在轉(zhuǎn)基因植物中，能夠保護(hù)Cry毒蛋白殺蟲活性避免在紫外線的照射下降解，并且特異性的針對鉆孔咀嚼的害蟲，所以轉(zhuǎn)基因Bt作物的研究越來越廣泛。

第一個成功的例子是由比利時的植物遺傳系統(tǒng)公司在1987年6月報道的[21]。他們用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功地將完整的cryA（b）基因和3'、5'端缺失后只保留5'端編碼毒蛋白核心區(qū)的不同長度的cryA（b）基因?qū)霟煵莴@得了抗煙草天蛾的轉(zhuǎn)基因煙草植株。

目前最重要的Bt作物是棉花，玉米，大豆。表達(dá)Cry1Ac蛋白的商業(yè)化Bt棉花用來控制棉鈴蟲等鱗翅目害蟲。第二代的Bt棉花，除了Cry1Ac外，表達(dá)Cry2Ab作為抗性管理機(jī)制。表達(dá)Cry1Ac蛋白的Bt玉米能有效的控制例如煙蚜夜蛾和歐洲玉米螟這樣的鱗翅目害蟲。下一代的商業(yè)化Bt玉米表達(dá)Cry34Ab/Cry35Ab雙毒素、Cry3Bb，控制鞘翅目害蟲，例如玉米根葉甲；表達(dá)Cry1A，Cry2Ab and Cry1F控制鱗翅目害蟲，例如草地夜蛾[22]。2013年孟加拉國首次批準(zhǔn)種植轉(zhuǎn)基因Bt茄子。

在2013年，全球超過2 500萬hm2的Bt作物，直接導(dǎo)致化學(xué)殺蟲劑的使用明顯減少[20]。表3列出了目前商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)Bt植物。

表3 商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)Bt基因植物Table3 The commercial planting of Btgene plants

續(xù)表3商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)Bt基因植物Continued Table3 The commercial planting of Btgene plants

隨著Bt應(yīng)用的深入，抗性的問題也隨之而來。80年代，是在實驗室選擇壓力下，部分野生型害蟲種群產(chǎn)生了抗性[23]。在野生條件下，三種鱗翅目害蟲對Bt產(chǎn)品產(chǎn)生抗性，如：印度谷螟、小菜蛾、粉紋夜蛾[24-26]。近些年，最少4種抗Bt作物的害蟲已經(jīng)被證明，在美國，美洲棉鈴蟲對轉(zhuǎn)Cry1Ac棉花產(chǎn)生抗性[27]；在波多黎各，草地貪夜蛾對轉(zhuǎn)Cry1F的Bt玉米產(chǎn)生抗性[28]。在南非，玉米楷夜蛾對轉(zhuǎn)Cry1Ab的Bt玉米產(chǎn)生抗性[29]。在印度，棉紅鈴蟲對轉(zhuǎn)Cry1Ac的Bt棉花產(chǎn)生抗性[30]。

4 展望

Bt作為目前世界上應(yīng)用最廣泛的微生物殺蟲劑，由于避免了化學(xué)農(nóng)藥所帶來的環(huán)境污染和抗性問題，在害蟲防治制劑以及轉(zhuǎn)基因材料研究中一直備受關(guān)注。盡管目前國內(nèi)外已經(jīng)分離克隆到了700多個Bt殺蟲蛋白基因，其殺蟲譜基本覆蓋了所有的鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、膜翅目等害蟲，但是，在Bt的研究過程中還存在著許多問題，如：每一種的Bt殺蟲蛋白基因的殺蟲譜卻十分有限、cry基因產(chǎn)物表達(dá)水平有限、轉(zhuǎn)基因植物中出現(xiàn)基因沉默以及抗性的產(chǎn)生等問題。因此還需通過新的試驗技術(shù)手段進(jìn)行分離篩選出更廣譜高效的菌株、構(gòu)建新的工程菌、改良現(xiàn)有的Cry毒蛋白、研究確定適當(dāng)?shù)腃ry毒素表達(dá)水平、在同一作物中共同表達(dá)多個Cry毒蛋白、研究明白這些毒素的作用模式以及害蟲對于與Cry蛋白結(jié)合的反應(yīng)等方法以使這些問題得到有效的解決。

[1]Sanahuja G，Banakar R，Twyman R M，et al.Bacillus thuringiensis：a century of research，development and commercial applications[J].Plant Biotechnol J，2011，9（3）：283-300.

[2]Devine G J，F(xiàn)urlong M J.Insecticide use：contexts and ecological conse-quences[J].Agr.Hum.Values，24（3）：281-306.

[3]Crickmore N.Bacillus thuringiensis Toxin Nomenclature[EB/OL].（2013-03-07）[2014-03-31].http：//www.lifesci.Sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/.

[4]Swamy H M M，Asokan R.New Innovations in Bacillus Thuringiensis Research-A Review[J].International Journal of Agriculture，2013，6（4）：545-550.

[5]張杰，束長龍，張春鴿.Bt殺蟲基因?qū)＠Ｗo(hù)現(xiàn)狀與趨勢[J].植物保護(hù)，2011，37（3）：1-6.

[6]Li JD，Carrol J，Ellar D J.Crystal structure of insecticidal d-endotoxin from Bacillus thuringiensis at 2.5 A resolution[J].Nature，1991，353（6347）：815-821.

[7]Grochulski P，Masson L，Borisova S，et al.Bacillus thuringiensis CryIA（a）insecticidal toxin：crystal structure and channel formation[J].JMol Biol，1995，254（3）：447-464.

[8]Morse R J，Yamamoto T，Stroud R M.Structure of Cry2Aa suggests an unexpected receptor binding epitope[J].Structure，2001，9（5）：409-417.

[9]Galitsky N，Cody V，Wojtczak A，et al.Structure of the insecticidal bacterial d-endotoxin Cry3Bb1 of Bacillus thuringiensis[J].Acta Crystallogr D，2001，57（8）：1101-1109.

[10]Boonserm P，Davis P，Ellar D J，et al.Crystal Structure of the Mosquito-larvicidal Toxin Cry4Ba and Its biological implications[J].JMol Biol，2005，348（2）：363-382.

[11]Boonserm P，Mo M，Angsuthanasombat C，et al.Structure of the functional form of the mosquito larvicidal Cry4Aa toxin from Bacillus thur-ingiensis at a 2.8-angstrom resolution[J].JBacteriol，2006，188（9）：3391-3401.

[12]Guo S，Ye S，Liu Y，et al.Crystal structure of Bacillus thuringiensis Cry8Ea1：An insecticidal toxin toxic to underground pests，the larvae of Holotrichia parallela[J].JStruct Biol，2009，168（2）：259-266.

[13]Bravo A，Gill SS，Soberón M.Mode of action of Bacillus thuringiensis Cry and Cyt toxins and their potential for insect control[J].Toxicon，2007，49（4）：423-435.

[14]Husz B.Field experiments on the application of Bacillus thuringiensis against the corn borer Int Corn Borer Invest[J].SciRep，1930，3：91-98.

[15]Soberón M，Gill SS，Bravo A.Signaling versus punching hole：how do Bacillus thuringiensis toxins kill insect midgut cells[J].Cell Mol Life Sci，2009，66（8）：1337-1349.

[16]Kaur S.Molecular approaches towards development of novel Bacillus thuringiensis biopesticides[J].World J Microbiol Biotechnol，2000，16（13）：781-793.

[17]González JM Jr，Brown B J，Carlton B C.Transfer of Bacillus thuringiensis plasmids coding for deltaendotoxin among strains of B.thuringiensis and B.cereus[J].Proc Natl Acad SciUSA，1982，79（22）：6951-6955.

[18]Kronstad JW，Schnepf H E，Whiteley H R.Diversity of locations for Bacillus thuringiensis crystal protein genes[J].JBacteriol，1983，154（1）：419-428.

[19]Baum J A，Johnson T B，Carlton B C.Bacillus thuringiensis：Natural and recombinant bioinsecticide products[J].Methods Biotechnol，1995，5：189-209.

[20]James C.Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops：2013[R].Metro Manila：ISAAA Brief，2014.

[21]Vaeck M，Reynaerts A，Hofte H，et al.Transgenic plants protected from insect attack[J].Nature，1987，328（2）：33-37.

[22]Christou P，Capell T，Kohli A，et al.Recent developments and future prospects in insect pest control in transgenic crops[J].Trends Plant Sci，2006，11（2）：302-308.

[23]Veloorvalappil N J，Robinson B S，Sailas B.An Overview on the Crystal Toxins from Bacillus thuringiensis[J].Advances in Microbiology，2013，3（5），462-472.

[24]McGaughey W H.Insect resistance to the biological insecticide Bacillus thuringiensis[J].Science，1985，229（4709）：193-195.

[25]Tabashnik B E.Evolution of resistance to Bacillus thuringiensis[J].Annu Rev Entomol，1994，39，47-49.

[26]Janmaat A F，Myers JH.Rapid evolution and the cost of resistance to Bacillus thuringiensis in greenhouse populations of cabbage loopers，Tricoplusia ni.[J].Proc Biol Sci，2003，270（1530），2263-2270.

[27]Tabashnik B E，Gassman A J，Crowdwer D W，et al.Insect resistance to Bt crops：evidence versus theory[J].Nat Biotechnol，2008，26（2）：199-202.

[28]Storer N P，Babcock JM，Schlenz M，et al.Discovery and characterization of field resistance to Bt Maize：Spodoptera frugiperda（Lepidoptera：Noctuidae）in Puerto Rico[J].JEcon Entomol，2010，103（4）：1031-1038.

[29]Van Rensburg J B J.First report of field resistance by stem borer Busseola fusca（Fuller）to Bt-transgenic maize[J].SAfr JPlant Soil，2007，24：147-151.

[30]Bagla P.Hardy cotton-munching pests are latest blow to GM crops[J].Science，2010，327：1439.