田波 尚勇良 武發(fā)菊 安芳蘭 萬玉林 劉學(xué)榮 楊進才

摘要 [目的] 探討各種懸浮培養(yǎng)條件對BHK21細胞懸浮培養(yǎng)的影響，尤其是細胞生長過程中出現(xiàn)的細胞結(jié)團現(xiàn)象對細胞生長狀態(tài)的影響，從而摸索出穩(wěn)定的培養(yǎng)條件。[方法]將BHK21細胞株進行懸浮馴化培養(yǎng)，通過對懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)液、pH、溶解氧、罐壓、攪拌等各種細胞相關(guān)生長條件進行研究。[結(jié)果] 細胞的結(jié)團嚴(yán)重影響了細胞的生長代謝。最佳培養(yǎng)條件為最佳接種濃度0.2×106個/ ml，牛血清的最佳含量為5%，BHK21細胞培養(yǎng)液理想pH為7.0～7.2，采用2孔通氣的100 r/min有利于BHK21細胞的生長。[結(jié)論] 為體外規(guī)模化細胞培養(yǎng)平臺奠定理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 BHK21細胞；細胞馴化；懸浮培養(yǎng)

中圖分類號 S188 文獻標(biāo)識碼

A 文章編號 0517-6611（2014）31-10855-03

Study on BHK21 Cell Suspension Adaptation and Culture Parameters in Suspension Condition

TIAN Bo1，2， SHANG Yongliang2，WU Faju2， LIU Xuerong2* et al （1.Gansu Agricultural University，Lanzhou，Gansu 730000；2.Zhongnong Weite Biotechndogy Co.Led.，Lanzhou，Gansu 730046）

Abstract [Objective] The aim was to discuss the effect of various cultivate condition on BHK21 cell suspension cultures，especially the effect of cell aggregation phenomenon of cell growth in the process of the cells growth state，and the stable culture condition were found out.[Method] The BHK21 cells were suspended domestication，cultivation of suspension culture by nutritive medium， pH，dissolved oxygen，tank pressure for mixing all kinds of cell growth conditions were studied.[Result] Cluster cells greatly influenced the growth of the cell metabolism.The best culture conditions were optimal inoculation concentration of 0.2×106 / ml，the best content of bovine serum 5%，the ideal BHK21 cell cultures of pH 7.0 - 7.2，the two ventilation hole 100 r/min speed of BHK21 cell growth.[Conclusion] The study laid a theoretical foundation for largescale cell culture in vitro platforms.

Key words BHK21 cells； The cellular acclimation； Cell suspension culture

隨著獸用生物制品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，近年來動物細胞培養(yǎng)成為國內(nèi)外研究的熱點。BHK21細胞作為WHO推薦的生產(chǎn)獸用疫苗細胞，現(xiàn)已在規(guī)?；a(chǎn)中用懸浮培養(yǎng)的模式在應(yīng)用。目前人們?yōu)檫m應(yīng)特定工業(yè)化的需要，通過改變細胞的生長方式和生活環(huán)境，對工程細胞進行貼壁―懸浮的馴化。貼壁培養(yǎng)細胞經(jīng)過懸浮馴化可以轉(zhuǎn)變?yōu)閼腋∩L株^[1-2]，或添加抗剪切保護劑進行規(guī)模化懸浮培養(yǎng)。懸浮馴化過程中細胞易粘附聚集及結(jié)團是目前貼壁細胞進行懸浮培養(yǎng)常見的問題^[3-4]。由于動物細胞在懸浮培養(yǎng)條件下對生長環(huán)境、培養(yǎng)基的要求十分嚴(yán)格，優(yōu)化BHK21細胞的懸浮培養(yǎng)條件，使之達到最佳生長狀態(tài)，從而為體外規(guī)模化細胞培養(yǎng)平臺奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

中農(nóng)威特生物科技服務(wù)有限公司研發(fā)部保存的BHK21細胞，購自ECACC，貨號：84111301，來源：Hamster Syrian Kidney，產(chǎn)品編號：05K029，代次：10代。培養(yǎng)基為自制的MEM+7%的胎牛血清，使用前按照產(chǎn)品說明書配制。新生牛血清購自蘭州榮曄生物技術(shù)有限責(zé)任公司。胰酶購自HyClone公司。碳酸氫鈉、氫氧化鈉、鹽酸等常用試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器

細胞計數(shù)儀，德國INNOVATIS公司；滲透壓測定儀，上海醫(yī)科大學(xué)儀器；T25、T75培養(yǎng)瓶，1 000 ml三角培養(yǎng)瓶購自Nunc公司；

5 L生物反應(yīng)器，BELLCO生物反應(yīng)器，7.5 L生物反應(yīng)器，美國NBS公司。

1.3 方法

1.3.1 BHK21細胞的懸浮馴化。

取BHK21貼壁細胞種子，在T75培養(yǎng)瓶中加入新鮮培養(yǎng)基進行復(fù)蘇培養(yǎng)，接種比例為1∶3，待細胞長滿單層并生長良好時，胰酶消化，用移液管輕輕吹打成單細胞懸浮液，以0.75×106個/ ml密度接種至1 000 ml三角培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、100 r/min下先攪拌培養(yǎng)。并依此法連續(xù)傳代，直至40代，培養(yǎng)過程中對每代細胞取樣計數(shù)并觀察細胞形態(tài)。

1.3.2 血清含量對懸浮培養(yǎng)細胞的影響。在其他培養(yǎng)條件一致的條件下，將已馴化的懸浮細胞種子傳代擴大培養(yǎng)，并以0.5×106個/ ml的細胞密度接種至5 L生物反應(yīng)器培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中將GMEM培養(yǎng)基中的血清含量分別調(diào)整為1%、2%、5%、8%、15%和20%6個濃度進行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中對每代細胞取樣計數(shù)并觀察細胞形態(tài)。

1.3.3 培養(yǎng)液pH對懸浮培養(yǎng)細胞的影響。

在其他培養(yǎng)條件一致的條件下，將GMEM培養(yǎng)液的pH分別設(shè)置為6.8～7.0、7.0～7.2、7.3～7.5和7.6～7.8，37 ℃培養(yǎng)48 h后，取樣計數(shù)并觀察細胞形態(tài)。

1.3.4 溶解氧對懸浮培養(yǎng)細胞的影響。

培養(yǎng)條件同“1.3.3”，以不同轉(zhuǎn)速及通氣方式進行懸浮培養(yǎng)，第1種：80 r/min，1孔通氣；第2種：80 r/min，2孔通氣；第3種：120 r/min，2孔通氣。均在37 ℃培養(yǎng)48 h后，取樣計數(shù)并觀察細胞形態(tài)。

1.3.5 全自動冰點滲透壓計測定滲透壓。

①開機，待顯示溫度降至-9 ℃按“↑”鍵使測量探頭升起；

②輕輕沖洗探頭，并加入0.5 mI樣品于樣品管中，套緊于測量探頭上，按“↑”測量開始；

③約5 min測量探頭升起，得出測量結(jié)果；

④記錄結(jié)果，取下樣品管，并按“↑”鍵使探頭回落，最后關(guān)機。

1.3.6 細胞培養(yǎng)形態(tài)觀察及細胞數(shù)目和活力的測定。將取出的細胞懸浮液直接滴在載玻片上在顯微鏡下觀察；用細胞分析儀計數(shù)細胞，分析細胞活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 BHK21細胞懸浮馴化培養(yǎng)過程中細胞結(jié)團的研究

2.1.1 BHK21細胞懸浮馴化培養(yǎng)過程中細胞形態(tài)變化的比較。

BHK21細胞在GMEM培養(yǎng)基中生長形態(tài)的變化圖1。在培養(yǎng)初期（圖1a、1b），大多數(shù)細胞散在分布，單個細胞透亮，邊緣光滑，部分細胞呈花生狀分布；隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞逐漸相互粘附，2～3個細胞或更多聚集在一起（圖1c、1d），細胞結(jié)團越為明顯，更多的細胞粘連，團塊變大，但很松散，輕輕吹打細胞，結(jié)團即消失，此時結(jié)團的細胞在鏡下觀察仍很透亮，活性好；由于細胞結(jié)團給物質(zhì)的傳遞帶來極為不利的影響，在細胞培養(yǎng)11 d后（圖1e），細胞邊緣不光滑，細胞體積增大，細胞結(jié)團越來越致密，團塊內(nèi)細胞已無明顯輪廓界限，不能吹散；在培養(yǎng)后期（圖1f），大量細胞開始死亡，結(jié)團逐漸消失。

2.1.2 BHK21細胞馴化培養(yǎng)過程中細胞結(jié)團對生長狀態(tài)的影響。

由表1可知，隨著培養(yǎng)時間的變化，細胞結(jié)團平均粒徑、細胞的生長活性和平均比生長速率受到一定的影響。在培養(yǎng)初期，細胞結(jié)團的平均粒徑較小，在12.81～15.78 μm，細胞活性最高，從比生長速率反映出細胞生長速度較快，細胞生長代謝旺盛；在培養(yǎng)至第8天，隨著細胞結(jié)團數(shù)量的增多，結(jié)團平均粒徑增加，細胞繼續(xù)保持指數(shù)生長期，平均比生長速率達到了最大值2.93，細胞活性在94%左右，此時結(jié)團的細胞在鏡下觀察更加透亮，活性更高；當(dāng)培養(yǎng)至第11天，結(jié)團平均粒徑不再增加，細胞活性逐漸下降，比生長速率降低，細胞生長速度減緩。主要是因為在BHK21細胞懸浮馴化生長過程中，細胞結(jié)團過大，給物質(zhì)傳遞帶來較大的阻力，使得團塊內(nèi)的細胞營養(yǎng)物耗竭和代謝副產(chǎn)物積累，細胞生長受到影響；在培養(yǎng)后期，細胞結(jié)團松散，細胞活性迅速下降，細胞逐漸崩解。

因此，細胞的結(jié)團嚴(yán)重影響了細胞的生長代謝，在細胞培養(yǎng)中應(yīng)通過不同方法如調(diào)節(jié)Ca2+濃度，添加肝素、EDTA等物質(zhì)以避免細胞結(jié)團的出現(xiàn)。

2.2 接種濃度對懸浮培養(yǎng)細胞的影響

BHK21細胞在不同接種濃度下培養(yǎng)（其他培養(yǎng)條件相同），當(dāng)接種濃度過低，即低于0.2×106個/ml時，細胞生長增值明顯減緩，細胞濃度的倍增時間由24 h延長至48 h或更多；若接種濃度過高，即1.0×106個/ml時，在培養(yǎng)期間細胞培養(yǎng)液的pH下降較快，不利于BHK21 細胞的生存，因而抑制了細胞的生長，細胞倍增速率降低。

2.3 血清含量對懸浮培養(yǎng)細胞生長的影響 BHK21細胞在不同血清濃度的培養(yǎng)液中生長（其他培養(yǎng)條件相同），含15%和20%高濃度血清的培養(yǎng)液可使細胞懸浮傳代24 h后，培養(yǎng)液的pH快速下降，可低至6.5～6.8，顯微鏡下觀察，上清液中可見較多雜質(zhì)，細胞形態(tài)一般，胞內(nèi)有顆粒狀物質(zhì)。為了避免細胞出現(xiàn)老化現(xiàn)象，應(yīng)及時換液 ；當(dāng)血清濃度較低時（1%、2%），細胞生長緩慢，細胞終密度明顯低于其他組；血清濃度為5%、8%時，懸浮培養(yǎng)過程中細胞生長較好，與對照組相比無顯著差異。因此，綜合細胞及生產(chǎn)成本考慮，牛血清的最佳含量為5%。

2.4 培養(yǎng)液pH對懸浮培養(yǎng)細胞的影響

當(dāng)pH7.0～7.2時，培養(yǎng)液的pH下降較快，細胞生長快，細胞密度比同期其他試驗組高，細胞活性也較好。當(dāng)BHK21細胞培養(yǎng)液pH在7.4或6.8時，培養(yǎng)48 h后細胞生長緩慢，細胞密度顯著低于其他試驗組。所以BHK21細胞培養(yǎng)液理想的pH為7.0～7.2。

2.5 溶解氧對懸浮培養(yǎng)細胞的影響 該試驗中所用的5 L生物反應(yīng)器有2個通氣孔，一孔可與空氣過濾器相連，另一孔不用時用螺帽封口，通氣時用滅菌的外有牛皮紙包被的多層紗布扎口即可。不同方式培養(yǎng)細胞的結(jié)果見表2，由表2可知，在2孔通氣的方式80 r/min培養(yǎng)，細胞團塊較多，細胞貼覆在罐壁和罐底的情況較多，而采用2孔通氣的100 r/min有利于BHK21細胞的生長。

3 結(jié)論與討論

（1）在貼壁細胞懸浮馴化培養(yǎng)中，細胞聚集成團是影響細胞生長的最大障礙。當(dāng)細胞狀態(tài)不好時，細胞團塊直徑可達數(shù)毫米，粘附的細胞數(shù)目達103個以上。由于細胞的成團聚集給物質(zhì)傳遞帶來的巨大阻力，使得陷于細胞團中央的細胞得不到充足的營養(yǎng)，細胞由于營養(yǎng)物質(zhì)的缺乏，細胞活性和生長速率逐漸降低，細胞開始凋亡。隨著細胞粘附基質(zhì)的改變，凋亡發(fā)生率增加，從而引起細胞蛋白結(jié)構(gòu)改變等一系列問題，使得細胞表達能力下降^[5]?？梢姡毎Y(jié)團對細胞生長狀態(tài)具有嚴(yán)重的影響，其影響程度的大小取決于細胞團塊的疏松度和細胞結(jié)團的平均粒徑大小。在該試驗中， BHK21細胞培養(yǎng)初期，細胞的結(jié)團粒徑逐漸增加，而細胞活性一直較高，細胞生長速度快；隨著培養(yǎng)時間延長，結(jié)團平均粒徑達到最大值后不再增加，且越來越致密，而細胞活性下降，細胞生長速度減慢，團塊逐漸散開，最后細胞死亡。因此，在懸浮細胞培養(yǎng)研究中，通過調(diào)控細胞結(jié)團尺寸的大小或消除細胞結(jié)團可提高細胞活性和培養(yǎng)密度，能改善細胞生長狀態(tài)，最終提高目標(biāo)產(chǎn)品產(chǎn)量。

（2）懸浮培養(yǎng)馴化試驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細胞接種濃度過低時，由于細胞間的相互作用及所分泌的各種細胞生長因子降低，使得細胞生長緩慢；當(dāng)細胞接種濃度過高時，由于營養(yǎng)物質(zhì)的快速消耗及代謝副產(chǎn)物積累較多等原因，使得細胞生長緩慢，比生長速率低于正常值。

（3）血清的質(zhì)量和濃度對細胞培養(yǎng)有直接的影響^[6]。一般透明、淡黃色，加熱滅活后顏色較深，蛋白沉淀少為優(yōu)良的血清。在細胞培養(yǎng)中，所用血清應(yīng)進行無支原體和病毒污染以及無其他微生物污染的檢測，及細胞生物學(xué)方面的檢測。將所用的血清連續(xù)傳代3次以上培養(yǎng)細胞，確定它是否適宜該細胞系的長期生長^[7]。該試驗結(jié)果表明，血清濃度越高，細胞分化速度越快，細胞生長較快，隨著細胞代謝物的增多及其血清中一些抑制因子作用的加強，細胞生長減慢，同時細胞形態(tài)也受到影響。目前由于血清來源不穩(wěn)定且價格昂貴、作用機制不明確及實驗和生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化困難等一系列原因，使得開發(fā)出經(jīng)濟適用的血清替代品和無血清培養(yǎng)基成為亟待解決的難題。

（4）大規(guī)模培養(yǎng)時，影響培養(yǎng)液pH穩(wěn)定性的主要因素有：①緩沖液的緩沖能力及種類；②對流空間大小；③葡萄糖濃度。培養(yǎng)液中正常的緩沖系統(tǒng)是NaHCO3/CO2系統(tǒng)。它是一種弱緩沖系統(tǒng)，其pKa為6.1，低于生理學(xué)最佳要求。這種緩沖系統(tǒng)要求在培養(yǎng)液上面的對流空間加入CO2以防止其丟失及增加羥基離子。也有人使用磷酸緩沖液，但有資料報道磷酸對動物細胞有毒害作用。該試驗未做該方面的嘗試。另外HEPES生物緩沖劑也可加入NaHCO3/CO2系統(tǒng)，其pKa為7.0，其緩沖能力為pH 6.8～7.2。但當(dāng)HEPES濃度高于25 mmol/L時，他對大多數(shù)動物細胞也有毒害作用。在細胞懸浮培養(yǎng)過程中，由于營養(yǎng)物質(zhì)的消耗和代謝副產(chǎn)物積累使得培養(yǎng)液的pH下降較快，從而抑制了細胞的生長。通常，大多數(shù)細胞的最適生長環(huán)境pH在7.0左右，當(dāng)pH下降至6.8時，會抑制細胞的生長，因此必須對PH進行調(diào)控，使培養(yǎng)過程中pH不能下降至6.8以下。

（5）在動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)時，如何提供足夠的氧非常重要^[8]。同期攪拌的目的主要有：①提供細胞代謝所需的足夠氧氣；②使培養(yǎng)液處于均勻懸浮狀態(tài)，有利于傳質(zhì)過程。對于一定的設(shè)備而言，增大攪拌速度、攪拌功率和通氣量都能提高溶氧水平，但三者之間相互關(guān)聯(lián)。

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