不同基因型亞麻花粉小孢子離體培養(yǎng)研究

宋淑敏 夏尊民 王曉楠

摘要 [目的]研究不同基因型亞麻花粉小孢子離體培養(yǎng)，建立亞麻花粉小孢子離體培養(yǎng)再生體系，以期加快亞麻單倍體育種進(jìn)程。[方法]以5種不同基因型亞麻的花粉小孢子為外植體，研究不同基因型亞麻愈傷組織誘導(dǎo)率、綠苗的分化率的差異，篩選適宜亞麻花粉小孢子培養(yǎng)基。[結(jié)果]不同基因型的亞麻花粉愈傷組織的誘導(dǎo)率、綠苗分化率差異顯著，9601和9605愈傷組織的誘導(dǎo)率較高，分別為30.8%和28.6%；9601組合的花粉綠苗分化頻率最高為14.5%。其次為9718和9712，分化率分別為11.5%和8.0%；篩選出亞麻花粉小孢子適宜的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基HF1、綠苗分化培養(yǎng)基HF2。[結(jié)論]初步建立了亞麻花粉小孢子離體培養(yǎng)再生體系，為亞麻單倍體育種、突變體篩選、轉(zhuǎn)基因等研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 亞麻；基因型；花粉小孢子；克隆

中圖分類(lèi)號(hào) S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）31-10873-02

Study on Micro Propagation of Pollen Microspores of Different Genotypes Flax in vitro

SONG Shumin， XIA Zunmin， WANG Xiaonan （Daqing Branch of Heilongjiang Academy of Sciences， Daqing， Heilongjiang 163319）

Abstract [Objective] The aim was to accelerate breeding course of flax haploid by studying the micro propagation of pollen microspores in vitro and establishing regeneration system of different flax genotypes. [Method] In vitro culture of pollen microspores of five different flax genotypes were conducted by pollen microspores to explore the callus induction rate， seeding regeneration rate and select suitable medium of pollen microspores. [Result] The result showed that there were significant differences in callus induction rate and seeding regeneration rate. Callus induction rates of 9601 and 9605 were higher， 30.8% and 28.6% respectively. The highest seeding regeneration rate of 9601 was 14.5%， followed by 9718 and 9712， 11.5% and 8.0% respectively. HF1 that was suitable inductive medium of callus and HF2 that was medium of seeding regeneration were selected. [Conclusion] The regeneration system of flax pollen microspores was established preliminarily. It provided foundation for haploid breeding， mutant screening and transgene of flax.

Key words Flax； Genotype； Pollen microspores； Clone

亞麻是重要的纖維及油料作物，亞麻纖維具有吸汗、透氣性良好和對(duì)人體無(wú)害等顯著特點(diǎn)，越來(lái)越受到人類(lèi)重視。亞麻油含多量不飽和脂肪酸，故用來(lái)預(yù)防高血脂癥和動(dòng)脈粥樣硬化等疾病。因此亞麻具有廣闊的發(fā)展和應(yīng)用前景。

我國(guó)亞麻花藥培養(yǎng)研究始于20世紀(jì)70年代，并由我國(guó)首次從亞麻花藥培養(yǎng)中獲得花粉植株，但亞麻花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率和綠苗分化率很低，且存在大量的從花藥壁等組織發(fā)育而來(lái)的二倍體植株，給單倍體鑒定帶來(lái)很大困難，嚴(yán)重制約了亞麻單倍體育種進(jìn)程。

在花藥培養(yǎng)基礎(chǔ)上開(kāi)展的游離花粉小孢子培養(yǎng)技術(shù)近年來(lái)已有長(zhǎng)足的進(jìn)步。游離花粉小孢子培養(yǎng)是把小孢子從花藥中分離出來(lái)，進(jìn)行人工培養(yǎng)?；ǚ坌℃咦优囵B(yǎng)具有其獨(dú)特的優(yōu)越性。首先，游離花粉是單倍性細(xì)胞，游離花粉的培養(yǎng)可減少倍性鑒定的工作量，提高了生產(chǎn)單倍體的效率。其次，它可作為高效的細(xì)胞篩選系統(tǒng)，使農(nóng)藝性狀迅速穩(wěn)定，避免后代的分離。再次，它可作為轉(zhuǎn)基因的受體材料，通過(guò)染色體加倍，使外源基因快速純和。20世紀(jì)70年代初，NITSCH等首先報(bào)道了煙草的游離小孢子培養(yǎng)。KYO等建立了煙草的游離小孢子高效產(chǎn)生單倍體植株的方法。研究者首次從甘藍(lán)型油菜花藥中分離出小孢子并誘導(dǎo)獲得小孢子胚和再生植株^[1]。研究表明，經(jīng)預(yù)培養(yǎng)，直接培養(yǎng)大麥離體花粉粒，獲得了再生植株^[2]。但目前關(guān)于亞麻游離花粉小孢子培養(yǎng)的研究在國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道。

筆者通過(guò)研究不同基因型亞麻花粉小孢子愈傷組織誘導(dǎo)及分化的差異，篩選出花粉培養(yǎng)的理想材料；篩選出適宜亞麻花粉小孢子培養(yǎng)的培養(yǎng)基，建立亞麻花粉小孢子離體培養(yǎng)再生體系，以期加快亞麻單倍體育種進(jìn)程，并為細(xì)胞水平的突變體篩選、轉(zhuǎn)基因研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

在黑龍江省科學(xué)院大慶分院試驗(yàn)田于6月中下旬采集5種不同基因型的亞麻雜交后代（F1）花粉處于單核中后期的花蕾，材料代號(hào)為9601、9605、9712、9715、9718。將花蕾用濕紗布包裹，放入4 ℃左右的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 培養(yǎng)基

以自行研制的亞麻花培專(zhuān)用培養(yǎng)基HA為基本培養(yǎng)基，愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為HF1：HA+1.5 mg/L 2.4D+0.5 mg/ L6BA+脯氨酸300 mg/L+蔗糖30 g/L+7 g/L瓊脂粉，pH 5.5；亞麻游離花粉愈傷組織分化培養(yǎng)基為HF2：HA+1.5 mg/ L6BA+0.5 mg/L IAA+蔗糖30 g/L+7 g/L瓊脂粉，pH5.5；亞麻花粉植株生根培養(yǎng)基為HF3：HA+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L IAA+蔗糖30 g/L+7 g/L瓊脂粉，pH 5.5。

1.3 方法。

1.3.1 外植體表面消毒。

將亞麻花蕾放入3%的次氯酸鈉溶液中消毒15 min，再用無(wú)菌水沖洗3次，取出花藥放入盛有無(wú)菌水的培養(yǎng)皿中，用針刺釋放法將花粉粒釋放到無(wú)菌水中，再通過(guò)過(guò)濾離心收集花粉，制成花粉懸浮液，花粉密度為0.5×102個(gè)/ml。

1.3.2 愈傷組織的誘導(dǎo)。

將花粉懸浮液接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基，放在20～25 ℃暗培養(yǎng)10 d，再放在20～25 ℃、1 000 lx條件下培養(yǎng)15 d，統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率。愈傷組織誘導(dǎo)率=愈傷組織塊數(shù)/接種的花粉數(shù)×100%。

1.3.3 愈傷組織的分化培養(yǎng)。

當(dāng)愈傷組織長(zhǎng)至5 mm左右時(shí)，將其轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基上。培養(yǎng)溫度為25 ℃，光照時(shí)間為12 h/d，光強(qiáng)為2 000 lx。20 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織的分化率。愈傷組織的分化率=分化綠苗的愈傷組織塊數(shù)/轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)的愈傷組織數(shù)×100%。

1.3.4 生根培養(yǎng)及移栽。

當(dāng)幼苗長(zhǎng)至3～5 cm時(shí)轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件同“1.3.3”。20 d后統(tǒng)計(jì)生根率。當(dāng)根長(zhǎng)為2 cm時(shí)，打開(kāi)瓶膜煉苗3 d，用鑷子將幼苗從培養(yǎng)基中取出，再用清水洗去根部的培養(yǎng)基，然后栽入花盆中，覆蓋塑料膜保濕，5 d后揭去膜。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基因型對(duì)亞麻花粉愈傷組織誘導(dǎo)的影響

以不同基因型亞麻的花粉小孢子為外植體，共接種5個(gè)雜交組合的亞麻花粉懸浮液。每個(gè)組合取2 ml花粉懸浮液（花粉密度為5.0×102個(gè)/ml）接種至HF1培養(yǎng)基上，進(jìn)行花粉愈傷組織的誘導(dǎo)，在20～25 ℃、光照強(qiáng)度2 000 lx、光照時(shí)間8 h下培養(yǎng)25 d，統(tǒng)計(jì)花粉愈傷組織的誘導(dǎo)率。10 d左右花粉愈傷組織陸續(xù)出現(xiàn)，結(jié)果表明，不同組合亞麻花粉愈傷組織的誘導(dǎo)率差異顯著，其中9601、9605組合花粉愈傷組織的誘導(dǎo)率最高，花粉愈傷組織的誘導(dǎo)率分別為30.8%、28.6%。9715的愈傷組織的誘導(dǎo)率相對(duì)較低（20.6%）（圖1）。

2.4 壯苗及生根

當(dāng)分化芽長(zhǎng)至1～2 cm時(shí)，應(yīng)及時(shí)切取并轉(zhuǎn)至壯苗培養(yǎng)基（HA+0.5 mg/L IAA+0.1 mg/L 6BA）中培養(yǎng)，當(dāng)花粉綠苗長(zhǎng)至5 cm左右時(shí)，將其轉(zhuǎn)至HF3生根培養(yǎng)基中，在20～25 ℃、光照強(qiáng)度1 000 lx、光照時(shí)間8 h下培養(yǎng)，亞麻花粉綠苗的生根率達(dá)95.2%以上。

3 小結(jié)與討論

（1）亞麻不同基因型影響其再生能力。不同基因型亞麻花粉愈傷組織的誘導(dǎo)率和綠苗再生頻率差異較大。該研究共用了5種基因型的亞麻進(jìn)行花粉培養(yǎng)，其中9601組合的花粉愈傷組織的誘導(dǎo)率、花粉綠苗再生頻率最高，9601可作為亞麻花粉培養(yǎng)的理想供試材料。

（2）誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入2，4D對(duì)誘導(dǎo)花粉愈傷組織十分必要，但2，4D的用量超過(guò)2 mg/L時(shí)，獲得愈傷組織的綠苗分化能力降低。

（3）

培養(yǎng)溫度是影響亞麻花粉愈傷組織質(zhì)量的主要因素，誘導(dǎo)愈傷組織階段培養(yǎng)溫度不宜超過(guò)30 ℃。培養(yǎng)溫度超過(guò)30 ℃，易產(chǎn)生松脆、水漬狀的愈傷組織，這種愈傷組織極不宜分化，即使分化，分化出的玻璃苗較多。

（4）該研究初步建立了亞麻花粉小孢子培養(yǎng)再生體系。花粉小孢子培養(yǎng)體系的建立為在細(xì)胞水平上進(jìn)一步進(jìn)行亞麻單倍體育種奠定了基礎(chǔ)。今后還要對(duì)亞麻花粉小孢子培養(yǎng)體系進(jìn)行不斷完善，使亞麻花粉小孢子培養(yǎng)在細(xì)胞突變體篩選、轉(zhuǎn)基因等領(lǐng)域得到更廣泛的應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)

[1]

肖尊安.植物生物技術(shù)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：106-107.

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