基于均勻設計對黃精不定芽增殖培養(yǎng)的研究

周新華 肖智勇 王麗云 陳傳松 鐘文斌 鐘秋平

摘要 [目的]篩選出最適合離體多花黃精不定芽增殖的培養(yǎng)基配方。[方法]以多花黃精帶芽根莖為外植體，在激素種類、水平數(shù)較多的情況下，采用了均勻設計及其分析方法篩選出最適合黃精不定芽增殖的培養(yǎng)基配方。[結(jié)果]最佳培養(yǎng)基配方為MS+KT 1.49 mg/L+NAA 0.29 mg/L+瓊脂0.7%+蔗糖3%（pH=5.8），平均增殖系數(shù)高達7.09以上。[結(jié)論]研究結(jié)果為多花黃精規(guī)?；⒐S化育苗提供理論和技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞 多花黃精；均勻設計；組織培養(yǎng)；芽增殖

中圖分類號 S567 文獻標識碼

A 文章編號 0517-6611（2014）31-10909-03

Research on the Rhizome Bud in Vitro Culture Of Polygonatum cyrtonema Hua Based on the Uniform Design Model

ZHOU Xinhua1，XIAO Zhiyong2，WANG Liyun1，ZHONG Qiuping1* et al （1.Experimental Center for Subtropical Forestry， Chinese Academy of Forestry， Fenyi，Jiangxi 336600；2. Yichun City Forestry Research Institute， Yichun，Jiangxi 336000）

Abstract [Objective] The research aimed to select the optimal media formulations of the rhizome bud [Method]Taking the Polygonatum cyrtonema Hua with rhizome and buds as explants，the optimal media formulations of the adventitious bud propagation in the Vitro Culture of Polygonatum cyrtonema Hua was selected by the uniform design and analysis methods under the cases of many hormone kinds and levels.[Result]The results showed that MS + KT 1.49 mg/L+ NAA 0.29 mg/L+Agar 0.7%+Sugar3%（pH=5.8） wsa the best medium for the adventitious buds induction. The average buds number induced by a bud is 7.09. [Conclusion] The research results can provide the theoretical and technical support for the cyrtonema scale and industrialized breeding of Polygonatum cyrtonema Hua.

Key words Polygonatum cyrtonema Hua；Uniform design；Tissue culture；Bud propagation

黃精是以百合科黃精屬多年生草本植物滇黃精（P.kingianum Coll.et Hemsl）、黃精（Polygonatum sibiricum Red.）或多花黃精（Polygonatum cyrtonema Hua）的干燥根莖入藥，具有補中益氣、除風濕、安五臟、久服輕身、延年、不饑、補諸虛、填精髓、平補氣血而潤的作用^[1-3]。近代研究表明，黃精主要含有糖類、甾體皂苷、強心苷、生物堿、黃酮及蒽醌類化合物、木脂素、維生素、氨基酸及微量元素等化學成分^[4-7]，具有延年益壽、抗菌消炎、抵抗衰老、抗動脈硬化、抗疲勞、提高學習記憶力、調(diào)節(jié)免疫力、抑制腫瘤細胞等功效^[8-10]。隨著研究的深入，人們對黃精的藥用價值和保健價值也給予了肯定和認可，黃精原料的市場需求量也越來越大，價格不斷上揚，黃精的野生自然資源遭到山區(qū)農(nóng)民的掠奪性采集，使得原本就很稀缺的野生黃精自然資源迅速枯竭，嚴重影響了黃精植物的可持續(xù)開發(fā)和利用。因此，為了保證高質(zhì)量的黃精原料來源，全面推廣和實行黃精的產(chǎn)業(yè)化種植顯得尤為重要。黃精的繁殖方式主要有2種，一種是通過種子繁殖的有性繁殖^[11]，一種是通過根莖繁殖的無性繁殖^[12]。在當前的人工栽培中，由于黃精種子難于收集、發(fā)芽率低下、育苗時間過長、時間和經(jīng)濟成本較高，所以在生產(chǎn)上主要是采用根莖繁殖，但根莖繁殖這一方法繁殖系數(shù)較低，大規(guī)模生產(chǎn)所要消耗種根莖量大，既不經(jīng)濟又限制了黃精產(chǎn)量的潛力，更不便于栽植管理與推廣。因此，黃精種苗問題成了推廣和實行產(chǎn)業(yè)化種植的瓶頸。

獲得黃精優(yōu)質(zhì)種苗最為有效的途徑就是利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)建立黃精的快速繁殖體系，而快速繁殖體系的關(guān)鍵技術(shù)之一在于如何快速高效獲得較大的增殖倍數(shù)。目前，關(guān)于不同激素組合及其濃度對黃精根莖不定芽增殖的組織培養(yǎng)，徐忠傳等報道了6BA濃度對離體多花黃精不定芽增殖的影響，認為當6BA濃度為4 mg/L時對黃精根莖芽增殖最為有利^[13]；徐紅梅等研究了植物生長調(diào)節(jié)劑對多花黃精芽外植體發(fā)生過程中的性狀影響，認為在附加TDZ 1.5 mg/L和2，4D 1.0 mg/L的激素組合對黃精根莖芽增殖最為有利^[14]；劉紅美等報道了多花黃精組織培養(yǎng)快繁技術(shù)的研究，認為當6BA 4.0 mg/L和2，4D 0.2 mg/L的激素組合最好，對多花黃精不定芽的增殖最為有利^[15]。但在激素種類、激素水平較多時，如何快速高效從中選取最佳的激素組合和濃度的組織培養(yǎng)技術(shù)尚鮮見報道，為此，筆者采用由中國數(shù)學家方開泰等在1978年提出的均勻設計方法^[16]對黃精不定芽快速增值發(fā)生培養(yǎng)基中6BA濃度、KT濃度、IBA濃度以及NAA濃度進行激素種類和濃度選擇，找出最佳激素組合和濃度。

1 材料與方法

1.1 外植體材料的處理

試驗用材多花黃精帶芽根莖采集于江西省分宜縣中國林業(yè)科學研究院亞熱帶林業(yè)實驗中心年珠試驗林場大崗山山區(qū)。黃精根莖從土中挖出后，洗去泥土，切取帶芽根莖，置于洗潔精水溶液中浸泡15 min，再用自來水沖洗60 min以上，然后移至超凈工作臺上，浸入體積分數(shù)為70%的乙醇中30 s，再用質(zhì)量分數(shù)為0.2%的升汞浸泡5 min，立即用無菌水清洗3次以上，將暴露在消毒液中的根莖組織切除，接種于已消毒的各種6BA、KT、IBA、NAA濃度組合的瓊脂質(zhì)量分數(shù)為0.7%、蔗糖質(zhì)量分數(shù)為3%、pH為5.8的MS培養(yǎng)基上。

1.2 培養(yǎng)條件

黃精根莖的培養(yǎng)條件為溫度控制在（24±2）℃，光照強度控制在1 500～2 000 lx，每天光照時間12 h，培養(yǎng)室濕度保持在70%左右。

1.3 均勻設計

1.3.1 因素和水平數(shù)的選定。

選取6BA、KT、IBA、NAA的不同濃度作為參選因素，分別記為A、B、C、D 4個因素，水平數(shù)分別選取如下：A代表6BA濃度（mg/L），A1=0.3、A2=0.6、A3=0.9、A4=1.2、A5=1.5、A6=1.8、A7=2.1、A8=2.4、A9=2.7、A10=3.0；B代表KT濃度（mg/L）、B1=0.2、B2=0.4、B3=0.6、B4=0.8、B5=1.0、B6=1.2、B7=1.4、B8=1.6、B9=1.8、B10=2.0；C代表IBA濃度（mg/L）、C1=0.2、C2=0.4、C3=0.6、C4=0.8、C5=1.0、C6=1.2、C7=1.4、C8=1.6、C9=1.8、C10=2.0；D代表NAA濃度（mg/L）、D1=0.1、D2=0.2、D3=0.3、D4=0.4、D5=0.5、D6=0.6、D7=0.7、D8=0.8、D9=0.9、D10=1.0。

1.3.2 均勻設計表的確定。

試驗設計時暫不考慮因子間的交互作用，依據(jù)中國數(shù)學家方開泰等提出的均勻設計方法和均勻設計表^[16]，基于試驗設計基本要求，為了科學合理安排A、B、C、D 4個因素，選用U*10（108）均勻表的1、3、4、5列，其偏差D=0.223 6，故得設計表如表1所示。

2.2 逐步回歸分析

因為在試驗設計時將各因子當做獨立因子處理，沒有考慮到各因子間的交互作用，所以在對試驗結(jié)果進行分析時就必須考慮到各因子間的交互作用。由于因子間的交互作用主要是一級交互作用，故在進行逐步回歸分析時主要考慮A×B、A×C、A×D、B×C、B×D、C×D的交互作用，即僅考慮二次逐步回歸模型，模型的表達式為：

Y=α0+α1·A+α2·A2+α3·B+α4·B2+α5·C+α6·C2+α7·D+α8·D2+α9·AB+α10·A·C+α11·A·D+α12·B·C+α13·B·D+α14·C·D，其中α1，α2，…，α14為待估參數(shù)，α0為常數(shù)項。根據(jù)植物組織培養(yǎng)理論可知，在沒有激素的情況下是沒有再生芽產(chǎn)生的，也就是說，當A=0、B=0、C=0、D=0時，平均芽數(shù)Y=0，由此可知回歸模型的常數(shù)項α0=0。

雖然模型有14個待估參數(shù)，大于試驗組數(shù)（10），但由于在求解模型時采用了逐步回歸分析方法，并非所有的變量均能同時進入模型，只有達到一定顯著水平的參數(shù)才能入選。故模型可以有少于10個變量的方程入選，使得方程存在一個唯一解，否則誤解。

數(shù)據(jù)分析時使用SPSS數(shù)據(jù)處理軟件對上述模型進行逐步回歸分析（檢驗閥值F1=F2=0.15），逐步篩選變量，入選一個變量進行回歸和假設檢驗，如果顯著差異則新進入變量保留，再刪除一個變量，進行擬合和假設檢驗，如果與未刪除變量之前差異不顯著，則變量刪除，依次程序不斷增加和刪除變量，直到不能再增加和刪除變量為止?；貧w結(jié)果表達式為：

Y=6.422D+6.820B-4.405BD-1.857B2。從回歸方程及方差分析的結(jié)果（表3～4）可以看出，該方程顯著性非常明顯（F=18.788），F(xiàn)檢驗的顯著性水平P=0.002﹤0.01，相關(guān)系數(shù)較高（R2=0.962），回歸方程可信。D、B、B×D、B×B參數(shù)顯著性也均是顯著的，說明參數(shù)效果也很好。綜上所述，回歸模型能夠通過偏相關(guān)系數(shù)T檢驗、復相關(guān)系數(shù)R檢驗、F檢驗，說明上述模型合理可信。

2.3 最適培養(yǎng)基的確定

根據(jù)回歸方程，為了求出Y的最優(yōu)組合，用微分法dY/dB=6.817-4.302D-3.742B、dY/dD=6.425-4.302B，令dY/dB=0dY/dD=0，求得最優(yōu)組合為B=1.49、D=0.29，在此基礎上求得最優(yōu)解Y=7.09。由于求得的方程與6BA（A）和IBA（C）無關(guān)，說明6BA、IBA對黃精不定芽的增殖影響較小，故有上面的分析可以得到黃精不定芽增殖培養(yǎng)中最佳激素組合及其濃度為當激素組合KT=1.49 mg/L和NAA=0.29 mg/L，黃精不定芽增殖系數(shù)最優(yōu)Y=7.09個。

2.4 試驗驗證

按照上述分析得到的最佳組合MS+KT 1.49 mg/L+NAA 0.29 mg/L+瓊脂0.7%+蔗糖3%（pH=5.8），參照先前試驗程序，將黃精帶芽根莖接種到最佳組合培養(yǎng)基上，進行一次驗證試驗，每瓶接一個帶芽根莖，共接30瓶，培養(yǎng)45 d后產(chǎn)生新芽，且長勢良好，對無污染的瓶進行統(tǒng)計分析，得平均芽數(shù)=總芽數(shù)/總瓶數(shù)=7.21個，顯然，與模型預測值（7.09）相當吻合。

3 結(jié)論與討論

試驗結(jié)果可以證明，該研究對帶芽根莖進行誘導并有新芽產(chǎn)生，培養(yǎng)基MS+KT 1.49 mg/L+NAA 0.29 mg/L+瓊脂0.7%+蔗糖3%（pH=5.8）對黃精不定芽增殖培養(yǎng)效果最好，此研究同時也應用了徐忠傳等對黃精組織培養(yǎng)的研究結(jié)果中的配方^[13-15]進行對照，效果都不如此研究中的好，與報道中的存在差異，可能是因為材料不同和選材時間不同等引起的^[17]。

在植物的組織培養(yǎng)工作中，激素的種類組合及其濃度是影響植物的愈傷組織誘導和植株再生的關(guān)鍵性因素之一，在激素種類較多時，如何用最為高效快速的方法找出最佳激素組合及其濃度，單憑過往經(jīng)驗和用正交設計手段無能為力。該研究中，用正交設計至少得做100組試驗，而采用均勻設計僅要10次試驗，這節(jié)約了試驗的時間成本和經(jīng)濟成本，且從此研究采用的均勻設計得到的最佳激素組合及其濃度的驗證可以證明效果很好。

通過對多花黃精不定芽增殖組織培養(yǎng)的研究，使用均勻設計及其分析方法是組織培養(yǎng)研究領域中尋找最佳試驗方案和配方的有效工具，其不僅大大減少了試驗次數(shù)且分析準確性好，另外，在電子科技發(fā)達的今天已擁有了太多的數(shù)據(jù)分析軟件，為研究者提供了極大的便利，如果在研究工作中廣泛應用均勻設計，將會提高研究效率和準確性。該研究應用均勻設計對黃精不定芽增殖培養(yǎng)的數(shù)據(jù)進行處理和相關(guān)分析，在較短的時間內(nèi)摸索到了最佳配方，得到了較好的結(jié)果，對黃精的工廠化育苗及產(chǎn)業(yè)化推廣種植有一定的參考意義。

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