董誠(chéng)明，喬毅琳，李明丹，李洋，冷慕嬋，曹利華

(河南中醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046)

吸濕回干法提高冬凌草種子抗旱性的研究△

董誠(chéng)明*，喬毅琳，李明丹，李洋，冷慕嬋，曹利華

(河南中醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046)

目的采用PEG-6000溶液模擬干旱條件處理經(jīng)過吸濕回干法鍛煉的冬凌草種子，篩選出提高冬凌草種子抗旱性的方法。方法用PEG-6000溶液模擬干旱條件；用吸濕回干法對(duì)種子進(jìn)行干旱鍛煉；并分別采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法、愈創(chuàng)木酚法、硫代巴比妥法測(cè)其生理指標(biāo)可溶性蛋白含量、過氧化物酶(POD)活性、丙二醛(MDA)活性。結(jié)果吸濕4 h干旱鍛煉1次處理項(xiàng)的POD含量最高，吸濕1 h干旱鍛煉2次次之，吸濕2 h干旱鍛煉4次最低，并且吸濕1 h干旱鍛煉2次、吸濕4 h干旱鍛煉1次處理項(xiàng)的MDA含量均低于對(duì)照組，說明經(jīng)過這兩項(xiàng)的處理種子的生活力增強(qiáng)，即抗旱性增強(qiáng)。結(jié)論吸濕回干法可以提高冬凌草種子的發(fā)芽率，最好的處理項(xiàng)是吸濕4 h干旱鍛煉1次。

冬凌草種子；PEG-6000溶液；抗旱性；可溶性蛋白；過氧化物酶；丙二醛；吸濕回干法

冬凌草Rabdosiarubescens(Hemsl.)Hara為唇形科Lamiaceae香茶菜屬植物，以全株入藥。冬凌草味甘苦，性微寒，具有清熱解毒，消炎止痛，健胃活血及抗腫瘤之功效[1]。藥用冬凌草主產(chǎn)于河南濟(jì)源太行山、王屋山地區(qū)[2]。冬凌草多處于野生狀態(tài)，太行山區(qū)石多土少，氣候干燥，生長(zhǎng)環(huán)境較差，因此產(chǎn)量很不穩(wěn)定[3]。1991年我國(guó)衛(wèi)生部批準(zhǔn)將其干燥葉及地上部分作為中藥材，收入部頒中藥材標(biāo)準(zhǔn)，臨床用藥量很大，但是冬凌草種子的產(chǎn)量卻不高，冬凌草種子抗旱性方面的研究也很少，然而仔細(xì)研究太行山區(qū)的氣候條件不難發(fā)現(xiàn)干旱對(duì)冬凌草種子的生長(zhǎng)及有效成分的含量高低有很大的影響。因此，通過科學(xué)的評(píng)價(jià)體系研究冬凌草種子的抗旱性是十分有必要的。

干旱鍛煉是指將植物處于一種致死量以下的干旱條件中，讓植物經(jīng)受干旱磨煉，以提高其對(duì)干旱的適應(yīng)能力，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常用的并且經(jīng)濟(jì)有效的提高作物抗旱性的方法之一[4]。植物對(duì)干旱脅迫的適應(yīng)過程和受傷害程度與干旱脅迫的強(qiáng)度以及植物自身的抗性緊密聯(lián)系，并以生化代謝、生理功能、形態(tài)適應(yīng)、生長(zhǎng)發(fā)育以及生物生產(chǎn)力等多種形式表現(xiàn)出來[5]。因此種子的抗旱性與發(fā)芽后幼苗中各種保護(hù)酶及蛋白質(zhì)的含量有一定的相關(guān)性。本課題通過測(cè)量比較各處理項(xiàng)中保護(hù)酶及蛋白質(zhì)含量的變化，總結(jié)與冬凌草種子抗旱性相關(guān)的保護(hù)酶含量的變化規(guī)律，從而選出可以有效提高其發(fā)芽率的干旱鍛煉方法。

1 儀器與試劑

光照培養(yǎng)箱(SPX-250-GB，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；紫外分光光度計(jì)(美譜達(dá)儀器 UV-3200S系列)；高速冷凍離心機(jī)(KDC-160HR，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司)。

PEG-6000(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；Tris(上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司)；愈創(chuàng)木酚(天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心)；2-硫代巴比妥酸(上海遠(yuǎn)帆助劑廠)；甘油；β-巰基乙醇(Amresco)；考馬斯亮藍(lán)G-250(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司)；牛血清白蛋白(AD0023生工生物)。

2 材料與方法

實(shí)驗(yàn)材料為2012年采收的濟(jì)源成熟冬凌草種子，經(jīng)河南中醫(yī)學(xué)院董誠(chéng)明教授鑒定為唇形科香茶菜屬植物冬凌草Rabdosiarubescens(Hemsl.)Hara的種子。

2.1 PEG-6000溶液模擬干旱條件處理冬凌草種子

精選成熟飽滿冬凌草種子，經(jīng)2%次氯酸鈉消毒15 min，蒸餾水反復(fù)沖洗數(shù)次直至沒有次氯酸鈉溶液的味道為止，均勻平鋪在直徑為10 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，水分脅迫條件由PEG-6000溶液產(chǎn)生，質(zhì)量濃度分別為0%、5%、10%、15%、，放在溫度(25±1) ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)五天后測(cè)其發(fā)芽率、MDA、POD及可溶性蛋白含量。

2.2 吸濕回干法模擬干旱鍛煉處理冬凌草種子

精選成熟飽滿的冬凌草種子，用吸濕回干法對(duì)冬凌草種子進(jìn)行干旱鍛煉。以蒸餾水為介質(zhì)進(jìn)行浸種，并以吸濕時(shí)間1 h、2 h、3 h、4 h設(shè)置四個(gè)處理項(xiàng)，每個(gè)處理項(xiàng)設(shè)置5組(每組100粒)，第一組種子經(jīng)一次充分吸脹后在室溫下干燥至原重量作為一次干旱鍛煉，第二組種子同法進(jìn)行兩次干旱鍛煉，第三組和第四組以此類推進(jìn)行三次、四次干旱鍛煉。第五組種子作為空白對(duì)照不進(jìn)行干旱鍛煉。將上述處理項(xiàng)在溫度(25±1) ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，五天后測(cè)其發(fā)芽率。

2.3 種子經(jīng)吸濕回干法處理后抗旱性的測(cè)試

選擇2.2項(xiàng)下中發(fā)芽率最好的三個(gè)處理項(xiàng)，即吸濕1 h干旱鍛煉2次、吸濕2 h干旱鍛煉4次、吸濕4 h干旱鍛煉1次的種子，分別用PEG-6000溶液0%、5%、10%對(duì)以上3組進(jìn)行干旱脅迫處理，對(duì)照組為不經(jīng)處理的種子。各處理項(xiàng)種子放在溫度(25±1) ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)五天。

2.3.1 用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)量冬凌草幼苗中可溶性蛋白含量[6]

2.3.2用硫代巴比妥法測(cè)量冬凌草幼苗中MDA含量[7]

2.3.3用愈創(chuàng)木酚法測(cè)量冬凌草幼苗中POD含量[8]

3 結(jié)果

3.1 PEG-6000溶液模擬干旱條件對(duì)冬凌草種子的影響

通過對(duì)冬凌草幼苗的發(fā)芽率、可溶性蛋白質(zhì)含量、MDA活性、POD活性的比較，綜合各項(xiàng)因素選擇5%及10% PEG-6000溶液作為干旱脅迫條件。見表1。

表1 不同濃度PEG-6000對(duì)冬凌草種子影響

3.2 吸濕回干法模擬干旱鍛煉對(duì)冬凌草種子發(fā)芽率的影響

綜合種子發(fā)芽率、吸濕時(shí)間、回干次數(shù)、操作可行性及簡(jiǎn)便程度等各項(xiàng)因素，選擇發(fā)芽率較高的吸濕1 h干旱鍛煉2次、吸濕2 h干旱鍛煉4次、吸濕4 h干旱鍛煉1次3個(gè)處理項(xiàng)，進(jìn)行抗旱性測(cè)試，結(jié)果見表2。

表2 吸濕回干各處理項(xiàng)種子的發(fā)芽率

3.3 種子經(jīng)吸濕回干法處理后抗旱性的測(cè)試結(jié)果

3.3.1 吸濕回干法與干旱模擬結(jié)合對(duì)冬凌草幼苗中可溶性蛋白含量的影響 吸濕回干實(shí)驗(yàn)中吸濕1 h、2 h、4 h 3個(gè)處理項(xiàng)可溶性蛋白的含量均隨著PEG-6000溶液濃度的升高而增加；0 %、5 % PEG-6000溶液培養(yǎng)的冬凌草幼苗可溶性蛋白含量均比原始樣品稍低，10 % PEG-6000溶液培養(yǎng)的冬凌草幼苗可溶性蛋白含量比原始樣品高，結(jié)果見表3。

3.3.2 吸濕回干法與干旱模擬結(jié)合對(duì)冬凌草幼苗中MDA含量的影響 吸濕回干實(shí)驗(yàn)中吸濕1 h、2 h、4 h三個(gè)處理項(xiàng)中MDA含量均隨著PEG-6000溶液濃度的升高而增加，對(duì)比PEG-6000溶液濃度可看出吸濕1 h、4 h處理項(xiàng)的冬凌草幼苗中MDA含量比吸濕2 h低，并且均比原始樣品含量低，結(jié)果見表4。

3.3.3 吸濕回干法與干旱模擬結(jié)合對(duì)冬凌草幼苗中POD含量的影響 吸濕回干實(shí)驗(yàn)中吸濕1 h、2 h、4 h三個(gè)處理項(xiàng)中POD含量均隨著PEG-6000溶液濃度的升高而增加，對(duì)比PEG-6000溶液濃度可看出5%、10 % PEG-6000溶液培養(yǎng)的冬凌草幼苗中吸濕1 h、4 h處理項(xiàng)下POD含量比5 %PEG-6000溶液高，結(jié)果見表5。

表3 吸濕回干法與模擬干旱結(jié)合對(duì)冬凌草幼苗中可溶性蛋白含量的影響

表4 吸濕回干法與模擬干旱結(jié)合對(duì)冬凌草幼苗中MDA含量的影響

表5 吸濕回干法與模擬干旱結(jié)合對(duì)冬凌草幼苗中POD含量的影響

4 討論

冬凌草種子活力下降的原因與其生理生化指標(biāo)的變化有關(guān)[6]，種子抗旱性的高低可以間接反映出種子活力的大小，即活力強(qiáng)的種子抗旱性高。冬凌草種子活力與可溶性蛋白含量，POD酶含量呈正相關(guān)，與MDA含量呈負(fù)相關(guān)，說明冬凌草中的抗旱性與可溶性蛋白含量，POD酶含量呈正相關(guān)，與MDA含量呈負(fù)相關(guān)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)測(cè)得的各項(xiàng)指標(biāo)的含量可知通過吸濕1 h干旱鍛煉2次、吸濕4 h干旱鍛煉1次的種子抗旱性相對(duì)較強(qiáng)。

本次實(shí)驗(yàn)在發(fā)芽率較高的3個(gè)處理項(xiàng)的各保護(hù)酶含量測(cè)定過程中，發(fā)現(xiàn)吸濕1 h干旱鍛煉2次處理所得幼苗的根長(zhǎng)，三個(gè)濃度項(xiàng)均是對(duì)照組的一倍左右，吸濕4 h干旱鍛煉1次次之，但是依然比對(duì)照組長(zhǎng)，吸濕2 h干旱鍛煉4次處理項(xiàng)較對(duì)照組短，且須根極少；3個(gè)處理項(xiàng)在相同培養(yǎng)時(shí)間里吸濕4 h干旱鍛煉1次的子葉長(zhǎng)勢(shì)明顯優(yōu)于其他兩項(xiàng)。從而更有利的說明吸濕2 h干旱鍛煉4次處理項(xiàng)對(duì)種子發(fā)芽時(shí)根系的生長(zhǎng)有抑制作用，抗旱性相對(duì)較低，而吸濕1 h干旱鍛煉2次、吸濕4 h干旱鍛煉1次處理項(xiàng)的抗旱性比對(duì)照組增強(qiáng)。

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ResearchonEnhancementofRabdosiarubescensSeedbyHydration-dyhydration

DONGChengming*，QIAOYilin，LIMingdan，LIYang，LENGMuchan，CAOLihua

(HenanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou450046,China)

Objective：Using drought conditions in PEG-6000 solution to treatmentRabdosiarubescensseed after moisture to dry the exercise，screening the method to improve the drought resistance ofRabdosiarubescens.MethodsUse PEG-6000 solution simulate drought conditions；use the method of drought exercise on seed moisture ；And respectively by Coomassie brilliant blue G 250，guaiacol method，thiobarbituric acid method to measure the content of soluble protein，physiological index of peroxidase(POD)activity，malondialdehyde(MDA)activity.ResultsThe item of hygroscopic 4 h drought exercise 1 times was the highest in POD content，the item of hygroscopic 1 h drought exercise 2 times lower，the item of hygroscopic 2 h drought exercise 4 times was the minimum.And the items of hygroscopic 1 h drought exercise 2 times，hygroscopic 4 h drought 1 times were lower than the control group in MDA content treatment，suggesting that life force of seeds was enhanced after treatment of these two items，that is drought resistance of seeds was improved.ConclusionThe method of hydration-dyhydration can improve the germination rate ofRabdosiarubescensseed，the best processing item is hygroscopic 4 h exercise 1 times treatment.

Rabdosiarubescensseed；PEG-6000 simulation；Drought resistance；Soluble protein；Peroxidase；Malondialdehyde；Hydration-dyhydration

國(guó)家自然科學(xué)基金(81173486)；國(guó)家重大科技專項(xiàng)(2012ZX09304006)

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董誠(chéng)明，教授，研究方向：中藥資源開發(fā)利用；Tel：(0371)86535313 ，E-mail：dcm663@sina.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.03.010

2013-07-18)