李 霞 馬 辰 秦艷杰 李雅娟 吳 迪 白麗雯 劉 博

(1. 大連海洋大學(xué), 遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點實驗室, 大連 116023;2. 大連海洋大學(xué), 農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室, 大連 116023)

泥鰍(Misgurnus anguillicaudatus)隸屬于鯉形目(Cypriniformes)、鰍科(Cobitidae), 廣泛分布于中國大陸、朝鮮半島、日本列島、中國臺灣等地[1]。泥鰍肉鮮味美, 營養(yǎng)豐富, 素有“水中人參”之稱, 是我國重要的淡水養(yǎng)殖種類。除了二倍體, 泥鰍還存在有天然的三倍體、四倍體, 是生物學(xué)及遺傳學(xué)研究的良好材料。關(guān)于泥鰍多倍體的研究以往的報道主要在人工誘導(dǎo)方法[2,3]、倍性鑒定方法[4,5]以及生長特性研究[2]等方面。多倍體泥鰍細胞系的建立及特性研究尚未見報道。

自Wolf, et al.在1962年建立了世界上第一株魚類細胞系——虹鱒(Oncorhynchus mykiss)性腺細胞系RTG-2[6]以來, 魚類細胞培養(yǎng)的研究發(fā)展迅速。到2011年全世界共報道建立魚類細胞系275株, 包括淡水或溯河洄游性的魚類細胞系 175株, 海水魚類細胞系100 株[7]。用于體外培養(yǎng)的組織主要有鰭[8—10]、脾[9,11,12]、腎[13]等, 其中鰭組織細胞系有白鱘(Acipenser transmontanus)WSF細胞系[14], 大菱鲆(Scophthalmus maximus)鰭細胞系[15], 中華鱘(Acipenser sinensis)CSTF細胞系[16]等。本實驗以天然生長的二倍體(2n)、三倍體(3n)及四倍體(4n)泥鰍為材料, 分別建立了可以連續(xù)傳代的鰭組織細胞系并對其進行生長、細胞遺傳學(xué)分析, 旨在豐富魚類細胞系的種類, 為揭示多倍體魚類生長、遺傳等機制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗所用的泥鰍采自湖北省洪湖市, 經(jīng)流式細胞儀鑒定倍性后, 將二倍體、三倍體和四倍體泥鰍分別飼養(yǎng)在90 L水槽中, 投喂復(fù)合飼料, 日換水一次。泥鰍全長10.3—15.8 cm, 體重10.00—20.24 g。

實驗所用 DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰酶、青霉素-鏈霉素雙抗溶液為Hyclone公司產(chǎn)品;人堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、I型胰島素樣生長因子(IGF-I)為Peprotech公司產(chǎn)品; 硫酸軟骨素為Wolsen公司產(chǎn)品。其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 方法

原代培養(yǎng) 參照李霞等的方法[17]略有改動。試驗前將鮮活的泥鰍浸泡于高雙抗(1000 IU/mL青霉素, 1000 μg/mL鏈霉素)曝氣水中暫養(yǎng)24h, 用1‰苯甲醇麻醉后, 在超凈工作臺中剪取鰭組織。將鰭組織先用質(zhì)量濃度為 10%的碘伏浸泡 15min; 后用青霉素和鏈霉素的混合液(500 IU/mL青霉素,500 μg/mL鏈霉素)浸泡30min; 再分別用PBS漂洗兩遍和 5%FBS-DMEM/F12培養(yǎng)基漂洗一遍后, 剪成1 mm3左右的小塊并均勻接種于25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中, 在 25℃CO2培養(yǎng)箱中正置干貼 24h后補加培養(yǎng)液至 5 mL/瓶, 所用培養(yǎng)液為添加有硫酸軟骨素(10 μg/mL)、bFGF(10 ng/mL)和 IGF-I(20 ng/mL)的20% FBS-DMEM/F12培養(yǎng)基。啟動原代培養(yǎng)至細胞長成單層。

傳代培養(yǎng) 吸出培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液, 加入0.25%的胰蛋白酶溶液1 mL, 30s后吸去胰蛋白酶溶液, 使得瓶底形成一層胰蛋白酶膜, 繼續(xù)消化1min,輕磕細胞培養(yǎng)瓶。將之前吸出的培養(yǎng)液加回, 用吸管吹打, 制成細胞懸液; 將細胞懸液以體積比 1︰1分到兩個新的培養(yǎng)瓶中; 并補加培養(yǎng)液至5 mL; 在25℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞長成單層后繼續(xù)用此方法傳代。從原代培養(yǎng)傳代至30代所用的培養(yǎng)液為添加有硫酸軟骨素(10 μg/mL)、bFGF(10 ng/mL)和IGF-I(20 ng/mL)的20%FBS-DMEM/F12培養(yǎng)基, 30代以后所用培養(yǎng)液為 20%FBS-DMEM/F12培養(yǎng)基,停止添加硫酸軟骨素、bFGF和IGF-I。

細胞保存方法 參照李霞等的方法[17]。首先配制含 20%FBS、60%DMEM/F12和 20%二甲基亞砜的細胞凍存液, 并放置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。?0代以后生長旺盛的細胞, 用0.25%的胰酶溶液消化, 加入培養(yǎng)液重懸后, 1500 r/min離心5min, 棄上清, 向沉淀中加入1 mL細胞凍存液, 重懸, 調(diào)整細胞濃度至 1.0×106個/mL, 并轉(zhuǎn)至凍存管中。放置冰箱中逐漸降溫: 4℃冰箱中 30min, –20℃冰箱中2h、–80℃冰箱中 24h, 最后放入液氮中(–196℃)長期保存。

取保存液氮中 60d的細胞, 在 40℃水中解凍,待細胞凍存液融化后轉(zhuǎn)入25℃水浴中3min, 然后將細胞凍存液轉(zhuǎn)入到離心管中, 并加入等量DMEM/F12培養(yǎng)基, 1500 r/min離心5min, 棄上清,用 20%FBS-DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細胞, 轉(zhuǎn)入到25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中, 并補加培養(yǎng)基至 5 mL, 在25℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h后全量換培養(yǎng)液, 繼續(xù)培養(yǎng)。同時, 取少量重懸的細胞液加入胎盤藍染色,并用血球計數(shù)板計數(shù), 計算存活率。

存活率=活細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%染色體分析 參考Wang, et al.的方法[14], 每10代取三種倍性泥鰍鰭細胞做染色體分析。向細胞液中加入終濃度為 1 μg/mL秋水仙素, 并將培養(yǎng)瓶置于25℃CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng), 3—5h后用0.25%的胰酶溶液消化, 細胞轉(zhuǎn)入離心管中, 以 1500 r/min離心5min, 收集細胞。用0.075 mol/L KCl溶液低滲40min, Carnoy固定液固定15min, 固定三次后滴片,干燥后用Giemsa染液染色, 高倍鏡下觀察拍照, 計數(shù)染色體數(shù)目, 并進行核型分析。

細胞生長曲線的測定 待三種倍性泥鰍鰭細胞分別傳代至 50代時, 用 0.25%的胰酶溶液消化,細胞重懸, 按每孔500 μL接種于24孔細胞板中, 接種密度為(3.0—5.0)×104個/mL, 置于 25℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 每24h取3孔細胞用血球計數(shù)板計數(shù), 連續(xù)進行 7d。以培養(yǎng)時間(d)為橫坐標, 細胞濃度(個/mL)為縱坐標, 繪制三種細胞的生長曲線。根據(jù)公式T=t×Lg2/Lg(Nt/N0)可計算出細胞的群體倍增時間,其中, Nt為時間t后的細胞數(shù), N0接種細胞數(shù)。

細胞及細胞核大小測定 取 53代的三種倍性泥鰍鰭細胞, 用 0.25%的胰酶溶液消化, 細胞重懸, 用移液槍取200 μL細胞液加胎盤藍1︰1混合加入到血球計數(shù)板中, 在顯微鏡下, 用校正好的目鏡測微尺測算直徑并進行統(tǒng)計。細胞傳至 53代時, 在倒置顯微鏡下觀察貼壁細胞, 計 100個圓形細胞核,用校正好的目鏡測微尺測算其直徑并進行統(tǒng)計。

數(shù)據(jù)處理 實驗數(shù)據(jù)用平均值±標準差的方式表示, 采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 原代培養(yǎng)

二倍體泥鰍鰭組織培養(yǎng) 48—60h后有細胞從組織塊中遷出(圖1A), 并呈纖維樣, 6—7d后組織塊周圍形成單層, 培養(yǎng)30—32d后細胞即可長滿培養(yǎng)瓶瓶底。三倍體泥鰍鰭組織培養(yǎng)36—48h后有細胞從組織塊中遷出(圖 1B), 呈纖維樣, 3—4d后組織塊周圍形成細胞單層, 培養(yǎng)28—30d后細胞即可長滿培養(yǎng)瓶瓶底。四倍體泥鰍組織培養(yǎng)48—60h后有細胞從組織塊中遷出(圖 1C), 并呈纖維樣, 5—6d后組織塊周圍形成單層, 培養(yǎng)26—28d后即可鋪滿整個培養(yǎng)瓶瓶底。

2.2 傳代培養(yǎng)及細胞系的建立

三種細胞傳代后 6—7d即可長滿培養(yǎng)瓶瓶底,連續(xù)傳代10代后, 細胞增殖速度加快。二倍體4—5d即可長滿單層, 三倍體 2—3d即可長滿單層, 四倍體3—4d即可長滿單層。三種細胞生長狀態(tài)良好, 細胞透明, 形態(tài)均一, 呈纖維樣。30代以后停止添加人堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、I型胰島素樣生長因子(IGF-I)和硫酸軟骨素, 細胞生長及分裂狀況都未受到影響。目前, 二倍體泥鰍鰭細胞已傳代至59代(圖2A)、三倍體和四倍體泥鰍鰭細胞均已傳代至68代(圖2B、C), 成功建立三種倍性泥鰍鰭組織細胞系。

圖1 二倍體、三倍體和四倍體泥鰍鰭組織原代培養(yǎng)細胞Fig. 1 Primary cultured diploid, triploid and tetraploid fin cells of oriental weatherfish

圖2 二倍體、三倍體和四倍體泥鰍鰭組織傳代培養(yǎng)細胞Fig. 2 Passage cultured diploid, triploid and tetraploid fin cells of oriental weatherfish

2.3 細胞保存

三種倍性的泥鰍鰭細胞凍存復(fù)蘇后, 多數(shù)細胞都可以繼續(xù)存活, 細胞形態(tài)均一為纖維樣細胞, 3—4d長滿單層, 并且可以繼續(xù)傳代。二倍體、三倍體及四倍體細胞凍存后存活率分別為: (80.88±1.38)%、(84.48±1.13)%、(81.57±1.28)%, 經(jīng)統(tǒng)計分析, 三者之間不存在顯著差異(P<0.05)。

2.4 染色體分析

每傳十代, 對三個倍性的鰭細胞進行染色體分析。在統(tǒng)計的 100個分裂相中, 二倍體細胞染色體數(shù)目分布從 33到56不等, 但分裂相染色體數(shù)目出現(xiàn)頻率最高是50條; 三倍體細胞染色體數(shù)目分布從48到 89不等, 但是分裂相染色體數(shù)目出現(xiàn)頻率最高是75條; 四倍體細胞染色體數(shù)目分布從87到103不等, 但分裂相染色體數(shù)目頻率最高是 100條?？梢? 二倍體、三倍體及四倍體的染色體數(shù)目分別為50、75和100。

對三個倍性的50代鰭細胞進行染色體分析結(jié)果如下: 二倍體細胞染色體數(shù)目分布從 33到 55不等, 而有 50條染色體的細胞數(shù)占總細胞數(shù)的68%(圖3A); 三倍體細胞染色體數(shù)目分布從54到77不等, 而有75條染色體的細胞數(shù)占總細胞數(shù)的59%(圖 3B); 四倍體細胞的染色體數(shù)目分布從 87到101不等, 而擁有100條染色體的細胞數(shù)占總細胞數(shù)的 54%(圖 3C), 說明傳代后各細胞系染色體穩(wěn)定。

對不同倍性的泥鰍鰭細胞進行核型分析, 結(jié)果表明, 二倍體、三倍體及四倍體的核型公式分別為2n=50, 10m+4sm+36t, NF=64 (圖 4A、D); 3n=75, 15m+6sm+54t, NF=96 (圖 4B、E); 4n=100, 20m+8sm+72t,NF=128 (圖4C、F)。即二倍體、三倍體及四倍體細胞有5組中部著絲粒染色體(m), 2組亞中部著絲粒染色體(sm), 18組端部著絲粒染色體(t)。

圖3 第50代二倍體、三倍體和四倍體鰭組織細胞染色體分布Fig. 3 Number distribution of chromosome in diploid, triploid and tetraploid fin cells at passage 50

2.5 細胞生長曲線測定

從第 50代細胞生長曲線(圖 5)中可以看出,25℃、5%CO2、20%FBS-DMEM/F12條件下二倍體細胞在0—1d處于潛伏期, 在1—1.5d進入對數(shù)生長期, 在4—4.5d進入穩(wěn)定期, 在5d后進入衰退期; 三倍體細胞在0—1d處于潛伏期, 在1—1.5d進入對數(shù)生長期, 在 3—3.5d進入穩(wěn)定期, 在 5d后進入衰退期; 四倍體細胞在0—2d處于潛伏期, 在2—2.5d進入對數(shù)生長期, 在 4—4.5d進入穩(wěn)定期, 在 5d后進入衰退期。經(jīng)測算, 在以上培養(yǎng)條件下, 二倍體、三倍體和四倍體鰭細胞的倍增時間分別為 48.43h、36.01h和41.45h。

2.6 細胞及細胞核大小

細胞核大小 從測算的結(jié)果看, 培養(yǎng)的二倍體、三倍體、四倍體細胞核的直徑、面積、體積間都有極顯著差異(P<0.01)。二倍體、三倍體和四倍體細胞的細胞核直徑比為 1︰1.15︰1.25; 細胞核面比為 1︰1.33︰1.57; 細胞核體積比為 1︰1.53︰1.97(表 1)。

細胞大小 從測算的結(jié)果看, 培養(yǎng)的二倍體、三倍體、四倍體細胞的直徑、面積、體積之間都有極顯著差異(P<0.01)。其中二倍體、三倍體和四倍體的細胞直徑比為1︰1.11︰1.33; 細胞面積比為1︰1.23︰1.78; 細胞體積比為1︰1.37︰2.37(表2)。

3 討論

3.1 泥鰍鰭細胞系建立方法

培養(yǎng)材料無菌是細胞體外培養(yǎng)成功的關(guān)鍵之一。已有的報道大多采用雙抗或酒精侵泡處理暴露在體外的器官, 如大菱鲆鰭細胞系建立中用 70%酒精漂洗鰭組織[15]; 大瀧六線魚鰭、吻端組織培養(yǎng)前對其使用雙抗(100 IU/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素)浸泡處理[17]。本研究在對泥鰍鰭組織無菌處理中發(fā)現(xiàn), 上述方法均存在滅菌不徹底的問題。通過反復(fù)嘗試做了如下改進: 首先用質(zhì)量濃度為 10%的碘伏浸泡 15min; 然后用雙抗溶液(500 IU/mL青霉素、500 μg/mL鏈霉素)浸泡30min, 達到很好的無菌處理效果。碘伏是一種以表面活性劑為載體和增溶的不定型絡(luò)合碘, 具有性能穩(wěn)定, 使用方便, 緩慢釋放有效碘和長效殺菌的優(yōu)點, 在水產(chǎn)養(yǎng)殖中被廣泛使用。

圖4 第50代二倍體、三倍體及四倍體泥鰍鰭細胞染色體核型分析Fig. 4 Chromosome and Karyotype analysis of diploid,triploid and tetraploid fin cells at passage 50

圖5 第50代二倍體、三倍體及四倍體鰭細胞的生長曲線(該圖中縱坐標細胞數(shù)應(yīng)為104)Fig. 5 The growth curve of diploid, triploid and tetraploid fin cell at passage 50

在魚類細胞培養(yǎng)中, 常使用的培養(yǎng)基有DMEM/F12、DMEM 和 L-15等。本文參考大瀧六線魚鰭、吻端、腎[17]的培養(yǎng)方法, 在泥鰍鰭細胞培養(yǎng)過程中使用含20%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基, 與魏云波等[18]建立的褐點石斑魚三種細胞系和Imajoh, et al.[19]報道的真鯛細胞系采用的最適培養(yǎng)基相同。在其他魚類細胞培養(yǎng)過程中也有采用L-15培養(yǎng)基的, 效果也較好, 如秦啟偉等[20]建立的斜帶石斑魚脾臟細胞系、樊廷俊等[15]建立的大菱鲆鰭細胞系。

魚類細胞系的來源主要有腎、脾、吻端、心臟、鰭等[21], 在解剖獲得內(nèi)臟器官時, 必然造成魚體死亡。本實驗采用鰭組織為材料。鰭是易于再生的器官, 剪去一段后, 剩余部分仍能很快修復(fù), 而魚不會死亡, 這對珍貴材料的重復(fù)利用和保護非常有益。目前, 二倍體、三倍體和四倍體泥鰍鰭細胞已傳至59代、68代、68代, 成功建立三個倍性的泥鰍鰭細胞系。

表1 二倍體、三倍體及四倍體泥鰍鰭細胞核大小Tab. 1 The size of nuclears of diploid, triploid and tetraploid fin cell in M. anguillicaudatus

表2 二倍體、三倍體及四倍體泥鰍鰭細胞大小Tab. 2 The size of passage fin cells in diploid,triploid and tetraploid M. anguillicaudatus

3.2 泥鰍鰭細胞染色體分析

染色體數(shù)目、核型是細胞遺傳學(xué)的基礎(chǔ), 是鑒定細胞系種屬以及體外培養(yǎng)條件下細胞系是否發(fā)生轉(zhuǎn)化的可靠指標。在每十代進行的染色體分析中,三種倍性的細胞系均出現(xiàn)染色體非整倍體現(xiàn)象, 但是染色體數(shù)出現(xiàn)頻率最高的都分別在50、75和100,即特征染色體數(shù)目仍分別是50條、75條和100條。對二倍體、三倍體和四倍體細胞進行核型分析發(fā)現(xiàn),三者均具有5組中部著絲粒染色體(m), 2組亞中部著絲粒染色體(sm), 18組端部著絲粒染色體(t)。與李雅娟等[1]報道的二倍體、三倍體及四倍體泥鰍染色體數(shù)目分析和核型研究一致, 證明這三種細胞系確為二倍體、三倍體及四倍體泥鰍細胞系, 并且到目前為止, 細胞系尚未發(fā)生變異。

3.3 不同倍性泥鰍鰭細胞大小及增殖情況比較

一般認為細胞核大小與染色體數(shù)目成正比, 而且為了維持恒定的核質(zhì)比率, 隨著細胞核的增大,細胞大小也按比例增加[22], 即二倍體、三倍體及四倍體的細胞核體積的理論比值應(yīng)為1︰1.5︰2。紅細胞核的大小是魚類多倍體鑒定的重要指標[22]。但以往報道的三倍體與二倍體的紅細胞核體積比和紅細胞體積比值都有不同結(jié)果。三倍體鰱紅細胞核體積為二倍體的1.63倍[23], 大黃魚三倍體紅細胞及核的體積分別是二倍體的 1.97、1.70倍[24]。Kim, et al.提出三倍體泥鰍的紅細胞及核的體積分別是二倍體的1.52和1.77倍[2], 而吳萍等的實驗結(jié)果表明三倍體泥鰍的紅細胞及核的體積分別是二倍體的1.62和1.44倍[5]。對于四倍體, Refstie提出虹鱒二倍體與四倍體紅細胞體積之比為 1︰1.91, 紅細胞核體積之比為 1︰2.05[25]; 而馬濤等的研究發(fā)現(xiàn)二倍體與四倍體虹鱒紅細胞面積之比為 1︰2.00, 紅細胞核體積之比為 1︰2.42[26]。在本實驗中測得的體外培養(yǎng)泥鰍二倍體、三倍體和四倍體的鰭細胞及核的體積比分別是 1︰1.37︰2.37和 1︰1.53︰1.97, 接近理論比值。上述研究結(jié)果的差異可能和測量方法、細胞狀態(tài)等有關(guān)。

本文通過泥鰍鰭細胞和細胞核大小的比較認為隨倍性增加, 不僅細胞核體積增大, 細胞體積也有明顯增加, 所以如果不同倍性泥鰍體內(nèi)細胞數(shù)量一致的話, 那么倍性越高, 個體應(yīng)該越大。群體倍增時間是細胞總數(shù)增加一倍所需要的時間。對三種倍性鰭細胞群體倍增時間比較可以看出二倍體最長, 三倍體最短, 可見三倍體細胞在傳代過程中能夠更快地適應(yīng)環(huán)境, 細胞活力好, 分裂快, 生長旺盛。已有研究表明三倍體泥鰍的平均體重大于二倍體, 且生長速度也比二倍體快[2], 結(jié)合本實驗的研究結(jié)果認為, 這一現(xiàn)象可能和三倍體細胞大、群體倍增時間短即生長速度快有關(guān)。從細胞學(xué)角度揭示多倍體魚類生長態(tài)勢、抗逆特性的機理將是多倍體研究的一個重要方向[27], 而本研究所建立的多倍體泥鰍細胞系無疑將為這項研究的開展提供了必要的細胞學(xué)平臺。