李榮霏，曹春芽，譚艷輝，劉志華

(懷化醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校藥理學(xué)教研室，湖南懷化 418000)

糖尿病腎病(diabetics nephropathy，DN)是糖尿病最常見、最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致終末腎病的主要原因之一。大豆異黃酮(soybean isoflavone，SI)是從大豆中分離出的活性成分，主要包括大豆黃素、染料木素、3種游離型苷元和9種葡萄糖苷，其結(jié)構(gòu)和功能與雌激素相似，因此又稱為植物雌激素。SI具有抗溶血、抗氧化、抗癌、降低血脂、預(yù)防骨質(zhì)疏松、改善婦女更年期綜合征等作用［1－2］。已有報(bào)道，SI可明顯降低糖耐量異常大鼠的尿微量白蛋白水平，對糖尿病大鼠腎具有保護(hù)作用［3］。本研究通過制備實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠模型，探討SI對糖尿病大鼠腎的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑和儀器

健康雄性SD大鼠購自南華大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物許可證號:SYXK(湘)2010－0006，體質(zhì)量250～350 g，10周齡。飼養(yǎng)環(huán)境為每籠5只，溫度(20～24)℃，相對濕度 53% ～57%。鏈佐星(streptozocin，STZ)購自美國 Sigma公司;SI(總異黃酮含量為96.8%，其中金雀異黃素為42%、大豆素38%)購自華北制藥股份有限公司;兔抗大鼠nephrin多克隆抗體(一抗)和羊抗兔多克隆抗體(二抗)購自武漢博士德公司;腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor－α，TNF－α)和 NF－κB 多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒購自南京建成生物工程研究所;ELISA試劑盒購自上海博耀生物科技有限公司。AU400型全自動(dòng)生化分析儀，日本Olympus公司;Lambda25型紫外分光光度計(jì)，美國Perkin Elmer公司;Coulter－L90 型超速離心機(jī)，美國Beckman公司;超聲波細(xì)胞破碎儀，寧波新芝科器研究所;垂直電泳儀及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)，美國 Bio－Rad公司。

1.2 糖尿病大鼠模型的制備

清潔級SD大鼠50只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為正常對照組(n=10)和糖尿病模型組(n=40)。糖尿病模型組禁食16 h后，按文獻(xiàn)［4］一次性 ip 給予 STZ 60 mg·kg－1(STZ 溶于 0.1 mol·L－1檸檬酸緩沖液，pH為4.5)，正常對照組注射等體積檸檬酸緩沖液。72 h后隨機(jī)測定空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)。FBG ≥ 16.6 mmol·L－1為糖尿病模型制備成功大鼠。

1.3 動(dòng)物分組和給藥

將造模成功大鼠34只隨機(jī)分為糖尿病模型對照組(n=8)及 SI 40，120 和 360 mg·kg－1組(n=8，9和9)。SI各給藥組于造模成功次日起ig給予SI(SI臨用時(shí)用0.5%羧甲纖維素鈉配成混懸液)，每天 1次。糖尿病模型對照組和正常對照組ig給予等量生理鹽水。所有大鼠在8周實(shí)驗(yàn)期間均自由飲水和攝取標(biāo)準(zhǔn)配方飼料，不使用胰島素或降糖藥，每周測1次血糖和體質(zhì)量。

1.4 腎指數(shù)測定

每只大鼠取血后，摘取腎，去除被膜，用4℃預(yù)冷的生理鹽水反復(fù)灌洗至顏色變蒼白，濾紙吸干，稱重。腎指數(shù)=腎質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)×100。

1.5 24 h尿蛋白檢測

給藥第8周末，每只大鼠分別放入代謝籠，正常飲水，禁食18 h后，收集 24 h尿液，離心保存于－70℃冰箱中，ELISA法檢測24 h尿蛋白。

1.6 生化指標(biāo)測定

給藥第8周末，大鼠禁食12 h，測體質(zhì)量。心臟采血，分離血清。全自動(dòng)生化分析儀檢測血肌酐(serum creatinine，SCr)，BUN和 MDA含量及SOD活性。

1.7 Western蛋白質(zhì)印跡法檢測腎組織nephrin，TNF－α和NF－κB蛋白表達(dá)

取100 mg腎組織加1 mL裂解液，于冰浴中超聲破碎勻漿，4℃ 12 000×g離心20 min，取上清液，BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，上樣后進(jìn)行 SDSPAGE電泳，轉(zhuǎn)膜封閉后，與一抗4℃孵育過夜，再與二抗室溫孵育1 h，顯影后掃描，測定各條帶積分吸光度(integrated absorbance，IA)。蛋白表達(dá)水平用待測蛋白條帶與內(nèi)參β肌動(dòng)蛋白條帶IA比值表示。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 SI對糖尿病模型大鼠FBG和腎指數(shù)的影響

造模成功后，糖尿病模型大鼠多飲，多食，多尿，體質(zhì)量減輕，精神萎靡。給予SI 4和5周后，與模型對照組相比，SI顯著降低糖尿病模型大鼠血糖水平(P＜0.05)，尤其SI 120 和360 mg·kg－1作用更加明顯(表1)。給藥8周末，除正常對照組外，其余各組大鼠均有死亡，模型對照組和SI 40，120 及360 mg·kg－1組各死亡2，1，4和1只。SI 120 和360 mg·kg－1還可顯著降低糖尿病模型大鼠腎指數(shù)(P ＜0.01)，360 mg·kg－1作用更明顯(P＜0.05)(表2)。

Tab.2 Effect of SI on body mass and kidney indexes of diabetic model rats

2.2 SI對糖尿病模型大鼠24 h尿蛋白、血清SCr及BUN水平的影響

與正常對照組比較，糖尿病模型大鼠24 h尿蛋白明顯升高(P ＜0.05);SI干預(yù)后，360 mg·kg－1組24 h尿蛋白水平明顯降低(P＜0.01)。糖尿病模型對照組大鼠BUN和SCr水平與正常對照組比較明顯升高(P ＜0.01);給予 SI 120 和360 mg·kg－1干預(yù)后，糖尿病模型大鼠BUN和SCr顯著降低(P ＜0.01)，360 mg·kg－1作用更加明顯(P ＜0.05，P ＜0.01)(表3)。

Tab.3 Effect of SI on levels of 24 h urine protein(UP)，blood urea nitrogen(BUN)，serum creatinine(SCr)of diabetic model rats

2.3 SI對糖尿病模型大鼠SOD和MDA的影響

與正常對照組比較，糖尿病模型對照組大鼠SOD活性顯著下降，而MDA水平明顯增加(P＜0.01);經(jīng) SI 120 和 360 mg·kg－1干預(yù)后，SOD 活性增加，MDA活性明顯下降(P＜0.01)，360 mg·kg－1作用更加明顯(P ＜0.01)(表4)。

Tab.4 Effect of SI on levels of superoxide dismutase(SOD)and malondialdehyde(MDA)of diabetic model rats

2.4 SI對糖尿病模型大鼠腎組織nephrin，TNF－α及NF－κB蛋白表達(dá)的影響

模型對照組nephrin水平明顯低于正常對照組(P ＜0.01)，SI不同劑量組大鼠組織nephrin水平明顯高于模型對照組(P ＜0.01)，SI 360 mg·kg－1時(shí)作用最顯著(P＜0.01)。模型對照組TNF－α蛋白表達(dá)顯著高于正常對照組(P＜0.01)，NF－κB表達(dá)無明顯變化;經(jīng)SI干預(yù)后，TNF－α 和 NF－κB 表達(dá)較模型對照組均顯著降低(P＜0.01)，SI 360 mg·kg－1時(shí)作用更加明顯(P ＜0.01)(圖1)。

Fig.1 Effect of SI on expression of nephrin(A)，tumor necrosis factor－α(TNF－α)(B)and NF－κB(C)protein in renal tissue of diabetic model rats by Western blotting.See Tab.1 for the rat treatment.D was the semiquantitative result of A，B and C.±s，n=5－10.1:normal control group;2:model group;3－5:SI 40，120 and 360 mg·kg－1groups，respectively.＊＊P ＜0.01，compared with normal control group;##P ＜0.01，compared with model group;△△P ＜0.01，compared with SI 40 mg·kg－1group;▲▲P ＜0.01，compared with SI 120 mg·kg－1group.

3 討論

DN是糖尿病全身微血管病變的腎表現(xiàn)，早期臨床表現(xiàn)為尿微量白蛋白增加，隨著DN的發(fā)展，蛋白尿的大量漏出可進(jìn)一步促進(jìn)腎小球硬化。導(dǎo)致蛋白尿發(fā)生的根本原因是足細(xì)胞裂孔膜蛋白損傷或表達(dá)下降引起足細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能障礙。nephrin蛋白特異性表達(dá)于足細(xì)胞裂孔膜，是組成裂孔膜的主要成分。Toyoda等［5］利用原位雜交的方法檢測到糖尿病腎病患者足細(xì)胞nephrin mRNA表達(dá)明顯減少，且與糖尿病腎病蛋白尿的進(jìn)展呈負(fù)相關(guān)。已有研究證實(shí)，經(jīng)STZ誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性糖尿病小鼠腎組織nephrin mRNA表達(dá)減少，而上調(diào)nephrin蛋白表達(dá)及nephrin mRNA水平，可減輕腎足細(xì)胞足突和基底膜損傷，24 h尿蛋白排泄量也明顯減少，腎功能得到改善［6］。

本研究通過給予STZ建立糖尿病大鼠模型，經(jīng)SI干預(yù)，結(jié)果顯示，SI為 120 mg·kg－1時(shí)糖尿病模型大鼠24 h尿蛋白水平顯著降低;給予SI 4～5周后，糖尿病模型大鼠血糖降低，部分大鼠死亡，可能是由于低血糖所致。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，SI可使nephrin蛋白表達(dá)上調(diào)，且360 mg·kg－1時(shí)作用最顯著，提示SI可能部分通過恢復(fù)nephrin蛋白表達(dá)，維持足細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，減少糖尿病模型大鼠尿蛋白排泄，發(fā)揮腎保護(hù)作用。

多種因素可引起糖尿病腎足細(xì)胞損傷，導(dǎo)致nephrin表達(dá)降低。體外研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞及其分泌的炎癥因子可降低nephrin基因啟動(dòng)子的活性及蛋白表達(dá)［7］。也有研究證實(shí)，氧化應(yīng)激與nephrin表達(dá)下降呈明顯相關(guān)［8］。而炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧族等均可以激活 NF－κB。NF－κB是介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子，在機(jī)體的免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用。NF－κB可啟動(dòng)其下游基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致包括TNF－α在內(nèi)的一系列炎癥因子的過度表達(dá)［9］。同時(shí)TNF－α又是NF－κB的重要誘導(dǎo)因子，參與構(gòu)成NF－κB 的正反饋環(huán)，兩者在腎小球疾病向纖維化方向發(fā)展產(chǎn)生協(xié)同作用。本研究結(jié)果表明，糖尿病模型大鼠出現(xiàn)高血糖，體質(zhì)量減輕，尿蛋白增加，同時(shí)nephrin蛋白表達(dá)降低，SOD活性降低，MDA含量增高，提示糖尿病模型早期出現(xiàn)足細(xì)胞損傷，腎組織抗氧化能力下降。SI干預(yù)后，尿蛋白減少，nephrin表達(dá)增多，提示SI對糖尿病模型大鼠腎損傷有一定的保護(hù)作用。同時(shí)SI減少M(fèi)DA生成，抑制SOD損失，抑制TNF－α及NF－κB的表達(dá)，提示SI對糖尿病模型大鼠腎的保護(hù)作用可能與降低NF－κB和TNF－α表達(dá)、發(fā)揮抗炎和抗氧化應(yīng)激作用有關(guān)。

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