冷曉紅，李小萍，張 彤

(1.寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院，銀川750021;2.寧夏泰瑞制藥股份有限公司，寧夏永寧750101)

磷酸替米考星可溶性粉為替米考星磷酸化后制成的可溶性粉制劑，為國(guó)家三類新獸藥，臨床試驗(yàn)研究表明:治療雞支原體肺炎、慢性呼吸道疾病［1-2］和豬的支原體肺炎效果顯著，且具有較好的安全性［3-5］。磷酸替米考星可溶性粉制劑克服了替米考星不溶于水，生物利用度低，不方便臨床用藥等問(wèn)題，是安全有效治療家畜呼吸系統(tǒng)疾病的新獸藥，但目前尚未有磷酸替米考星可溶性粉含量測(cè)定方法的報(bào)道，本試驗(yàn)通過(guò)建立高效液相色譜法測(cè)定磷酸替米考星可溶性粉中磷酸替米考星含量的方法，為磷酸替米考星可溶性粉的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 LC-20AT高效液相色譜儀(二極管陣列檢測(cè)器，日本島津);WondaSil C18-WR色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)(日本島津)。

1.2 試劑與樣品 替米考星對(duì)照品，批號(hào):K0310711，含量91.0%，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供;磷酸替米考星可溶性粉，批號(hào):20100518、20100519、20100520，寧夏泰瑞制藥股份有限公司研制;乙腈、磷酸為色譜純，水為超純水，其它均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 參考相關(guān)文獻(xiàn)［6-7］，選用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以水-乙腈-磷酸二丁胺緩沖液〔取二丁胺16.8 mL，加磷酸溶液(1→10)70 mL，邊加邊攪拌，放置冷卻后，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.5±0.1，加水至100 mL〕-四氫呋喃(805∶115∶25∶55)為流動(dòng)相;流速為每分鐘1.0 mL;檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)結(jié)果表明，替米考星的順式和反式異構(gòu)體峰峰面積之和的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.70%，，理論板數(shù)按替米考星順式峰計(jì)算不低于3000，替米考星的順式和反式異構(gòu)體峰之間的分離度應(yīng)符合要求。替米考星反式異構(gòu)體峰的相對(duì)保留時(shí)間為0.9，替米考星順式異構(gòu)體峰的相對(duì)保留時(shí)間為1.0(圖1-圖2)。

圖1 替米考星對(duì)照品HPLC色譜

圖2 磷酸替米考星可溶性粉HPLC色譜圖

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取替米考星對(duì)照品25 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加乙腈10 mL超聲溶解，用流動(dòng)相稀釋至刻度，混勻，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取磷酸替米考星可溶性粉適量(相當(dāng)于替米考星25 mg)，精密稱定，置50 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 測(cè)定法 按2.1項(xiàng)色譜條件，分別精密量取對(duì)照品和供試品各10 μL注入液相色譜儀中，記錄色譜圖，外標(biāo)法以順式和反式異構(gòu)體峰面積之和計(jì)算磷酸替米考星含量。

2.3 專屬性試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、空白溶劑及按工藝處方制備的不含主藥的陰性溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，按照上述方法測(cè)定。結(jié)果陰性溶液及空白溶劑對(duì)試驗(yàn)無(wú)干擾。

2.4 線性關(guān)系考察 取替米考星對(duì)照品250 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加乙腈10 mL超聲溶解，用流動(dòng)相稀釋至刻度，混勻。取上述溶液0.1、0.2、0.6、1.0、1.5、2.0 mL 分別置于10 mL 量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度。取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜峰至主峰保留時(shí)間的2倍。以順式和反式異構(gòu)體峰面積之和為縱坐標(biāo)，以濃度為橫坐標(biāo)，計(jì)算線性，結(jié)果表明:替米考星在0.0516～1.032 mg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好?；貧w方程及為:

2.5 精密度試驗(yàn)

2.5.1 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)磷酸替米考星可溶性粉供試品(批號(hào)20100518)6份，按照上述測(cè)定方法測(cè)定，結(jié)果替米考星順式和反式異構(gòu)體峰面積之和的RSD為0.4%，表明重復(fù)性良好。

2.5.2 中間精密度試驗(yàn) 取同一批號(hào)供試品(批號(hào)20100518)6份，分別由A、B、C三人，在不同的時(shí)間，用不同儀器(Waters 515高效液相色譜儀、蘭博SSI LabAlliance高效液相色譜儀、日本島津LC-20AT高效液相色譜儀)，按照上述含量測(cè)定方法測(cè)定，結(jié)果精密度良好，RSD為0.27%。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，自制備后，按含量測(cè)定方法，分別在 0、1、3、6、12 h 進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果替米考星順式和反式異構(gòu)體峰面積之和的RSD為0.12%，結(jié)果表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的磷酸替米考星可溶性粉，批號(hào):20100518，含量以替米考星(C46H80N2O13)計(jì) 為 9.69% 約 100.0、130.0、150.0 mg各三份，精密稱定，分別置于50 mL量瓶中，分別加入替米考星對(duì)照品溶液(5.3040 mg/mL)2、2.5、3 mL各三份，用流動(dòng)相稀釋至刻度，混勻。取上述溶液各10 μL注入液相色譜儀中，記錄色譜圖。按外標(biāo)法以順式和反式異構(gòu)體峰面積之和計(jì)算磷酸替米考星回收率，結(jié)果見(jiàn)表1，平均回收率為98.5%，RSD為2.0%。

表1 磷酸替米考星可溶性粉回收率試驗(yàn)結(jié)果

上述方法學(xué)驗(yàn)證的試驗(yàn)結(jié)果表明，按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行磷酸替米考星可溶性粉的含量測(cè)定，方法可行。

2.8 樣品測(cè)定 取磷酸替米考星可溶性粉供試品3 批(批號(hào):20100518、20100519、20100520)，按上述含量測(cè)定方法操作，測(cè)定其含量，三批產(chǎn)品的標(biāo)示含量分別為96.9%，92.6%和93.2%。

3 討論與小結(jié)

紫外吸收?qǐng)D譜顯示:替米考星在280 nm～290 nm之間均有最大吸收波長(zhǎng)，參考相關(guān)文獻(xiàn)［4-5］，選擇280 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

在試驗(yàn)中比較了水-乙腈-四氫呋喃-磷酸丁胺緩沖液(805∶110∶60∶25)［8］;將乙腈 105 mL、四氫呋喃53 mL、磷酸二丁胺緩沖液30 mL加入700 mL水中，用水稀釋到1000 mL［9］;乙腈-四氫呋喃-1 mol/L二丁胺磷酸鹽緩沖液(130∶55∶25)［10］及水-乙腈-磷酸二丁胺緩沖液-四氫呋喃(805∶115∶25∶55)為不同流動(dòng)相體系，結(jié)果確定了本方法的流動(dòng)體系，磷酸替米考星中替米考星順式和反式異構(gòu)體峰之間及與其他成分可以得到較好的分離。

目前關(guān)于替米考星含量測(cè)定的文獻(xiàn)報(bào)道很多，但替米考星磷酸成鹽后，進(jìn)一步制成可溶性粉制劑，用HPLC法測(cè)定磷酸替米考星可溶性粉中磷酸替米考星含量的方法未見(jiàn)報(bào)道。

本研究所建立的方法專屬性強(qiáng)、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，可用于磷酸替米考星可溶性粉的質(zhì)量控制，同時(shí)為磷酸替米考星可溶性粉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了依據(jù)。

［1］宗昕如，張曉輝，辛凌翔，等.磷酸替米考星可溶性粉對(duì)人工感染雞支原體的治療試驗(yàn).畜牧與獸醫(yī)［J］，2013，8:88-92.

［2］張繼瑜，李艷春.磷酸替米考星飲水劑治療雞敗血支原體的療效試驗(yàn)，中國(guó)畜牧獸醫(yī)［J］，2004，31(12):39-40.

［3］張曉輝，宗昕茹，辛凌翔，等.磷酸替米考星對(duì)人工感染豬支原體肺炎的治療試驗(yàn).中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)［J］，3013，43(5):515-521.

［4］中國(guó)獸藥雜志編輯部.磷酸替米考星.中國(guó)獸藥雜志［J］，2003，37(8):4.

［5］宗昕如，張曉輝，辛凌翔，等.磷酸替米考星可溶性粉在靶動(dòng)物雞的安全性試驗(yàn).畜牧與獸醫(yī)［J］，2014，2:27-32.

［6］宋艷紅，孫 浩，等.HPLC法測(cè)定復(fù)方替米考星顆粒中有效成份含量.中國(guó)獸藥雜志［J］，2010，44(8):27-30.

［7］中國(guó)獸藥典委員會(huì).中國(guó)獸藥典，二○一○年版一部.［S］.

［8］張旭東，呂瑞娥.高效液相色譜法測(cè)定飼料中替米考星含量.中國(guó)飼料［J］，2010，9:27-30

［9］閆春芝，趙紅彥，秦朝英.高效液相色譜法測(cè)定替米考星含量.中國(guó)獸藥雜志［J］，2006，40(8):26-27.

［10］張寶國(guó).替米考星的高效液相分析，鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(理學(xué)版)［J］，2003:35(3):70-72