陳瑜萍

摘 要 目的：研究益母草提取物對(duì)阿霉素所致的心肌受損細(xì)胞的保護(hù)作用。方法：以MTT法將H9C2心肌細(xì)胞置于（36.5±0.5）℃， 95%空氣加5%二氧化碳混合氣體中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中加益母草提取液和阿霉素；對(duì)照組加阿霉素；對(duì)照空白組兩者都不加。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率為63.4%，對(duì)照組細(xì)胞存活率為48.5%，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：益母草提取物對(duì)阿霉素所致的心肌受損細(xì)胞具有保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞 益母草 阿霉素 心肌損傷

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：1006-1533（2014）21-0052-03

The protective effect of the extracts of Leonurus artemisia

on the adriamycin-induced myocardial injury

CHEN Yuping

（Kangjian Community Health Service of Xuhui District， Shanghai 200233， China）

ABSTRACT Objective： To study the cytoprotective effect of the extracts of Leonurus artemisia on adriamycin-induced myocardial damage. Methods： Myocardial H9C2 cells were cultivated at （36.5±0.5） ℃ in an incubator with 95% air and 5% carbon dioxide based on MTT assay and the extracts of Leonurus artemisia were added into the broth of myocardial cells in the experimental group， while only adriamycin in the control group and neither the extracts of Leonurus artemisia nor adriamycin in the blank control group and then cells were incubated for 24 hours at 37 ℃. Results： The survival rate of cells was 63.4% in the experimental group while only 48.5% in the control group （P<0.05）. Conclusion： The extracts of Leonurus artemisia have a protective effect on adriamycin-induced myocardial injury cells.

KEY WORDS Leonurus artemisia；adriamycin；myocardial injury

阿霉素（ adriamycin， ADM）是抗腫瘤藥物，抗腫瘤譜廣，療效顯著，但是，阿霉素具有一定的心臟毒性。益母草（Leonurus heterophyllus， LH）有效成分為L(zhǎng)H 堿等生物堿，其功用主治為活血化瘀、利尿、調(diào)經(jīng)，臨床上主要用于婦產(chǎn)科。近期研究認(rèn)為，益母草的藥理作用是多方面的，臨床上有用于冠心病心肌缺血取得良好效果的報(bào)道。我們研究了益母草對(duì)阿霉素造成的心肌缺血及再灌注損傷的作用，結(jié)果如下。

材料與方法

材料

細(xì)胞及試劑

H9C2心肌細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液（PBS），噻唑蘭試劑（MTT），4%多聚甲醛，Hoechst 33258染色液，二甲基亞砜（DMSO），DMEM培養(yǎng)基。

儀器

熒光顯微鏡（Leica），酶標(biāo)儀（Infinire Mzoo型，TECAN公司），CO2孵箱（Thermo Electron Corporation型，JOUAN公司）。

方法

細(xì)胞培養(yǎng)

將H9C2心肌細(xì)胞置于pH為7.2～7.4，溫度為（36.5±0.5）℃，95%空氣加5%二氧化碳混合氣體的環(huán)境中培養(yǎng)。

實(shí)驗(yàn)分組

將實(shí)驗(yàn)分為3組：空白對(duì)照組為沒(méi)有加入阿霉素和益母草提取物的細(xì)胞組，對(duì)照組為加入1 μmol/L阿霉素的細(xì)胞組，實(shí)驗(yàn)組為先加入100 μg/ml的益母草提取物后再加入1 μmol/L的阿霉素的細(xì)胞組。

MTT法

將H9C2細(xì)胞加入96孔培養(yǎng)板，每孔4 000個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h，去血清，在37 ℃孵箱下繼續(xù)培養(yǎng)24 h ，加入益母草，1 h后再加入1 μmol/L的阿霉素，培養(yǎng)24 h，每孔加入10 μl含5 mg/ml 的MTT，4 h后加入150 μl的二甲基亞砜。在酶標(biāo)儀上波長(zhǎng)490 nm下測(cè)定OD值，每組通過(guò)篩選后各留下8個(gè)OD值。

Hoechst 33258細(xì)胞核染色

取潔凈載玻片在70%乙醇中浸泡5 min或更長(zhǎng)時(shí)間，無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)吹干或用無(wú)菌的PBS或0.9% NaCl溶液洗滌3遍，再用細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌1遍，將載玻片置于6孔板內(nèi)，種入細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)夜。刺激細(xì)胞發(fā)生凋亡后，吸盡培養(yǎng)液，加入0.5 ml固定液，固定15 min或更長(zhǎng)時(shí)間（可4 ℃過(guò)夜）。去固定液，用PBS或0.9% NaCl洗2遍，每次3 min，吸盡液體。洗滌時(shí)用搖床或手動(dòng)晃動(dòng)，加入0.5 ml Hoechst 33258染色液，染色30 min。去染色液，用PBS或0.9% NaCl洗2遍，每次3 min，吸盡液體。洗滌時(shí)用搖床或手動(dòng)晃動(dòng)，加1滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細(xì)胞的載玻片，讓細(xì)胞接觸封片液，盡量避免氣泡。熒光顯微鏡可檢測(cè)到呈藍(lán)色的細(xì)胞液，激發(fā)波長(zhǎng)350 nm左右，發(fā)射波長(zhǎng)460 nm左右。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料采用卡方檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

MTT法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組細(xì)胞的吸光值A(chǔ)570和 A490， 以 A570/A490代表細(xì)胞活力，空白對(duì)照組細(xì)胞存活率為 100%，其余各組按存活率 = （各濃度組吸光值 /空白對(duì)照組吸光值） ×100%與之比較。阿霉素對(duì)照組平均存活率=（0.278/0.573）×100%=48.5%，益母草提取物組平均存活率=（0.364/0.573）×100%=63.4%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，表1）。

Hoechst 33258細(xì)胞核染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3個(gè)組在400倍的熒光顯微鏡觀察到的結(jié)果見(jiàn)圖1。

從圖1中我們可以看見(jiàn)，A為正常細(xì)胞，有橢圓形的細(xì)胞核；B為加入阿霉素的細(xì)胞， 細(xì)胞核發(fā)生固縮，呈典型的凋亡改變； C則顯示通過(guò)益母草提取物的加入，細(xì)胞的受損程度遠(yuǎn)好于B組，說(shuō)明益母草提取物的加入對(duì)阿霉素的心肌受損細(xì)胞具有保護(hù)作用。

討論

本實(shí)驗(yàn)提示，僅加阿霉素的心肌細(xì)胞平均存活率為48.5%，而加有益母草提取物后再加阿霉素的心肌細(xì)胞平均存活率為63.4%，比前者高。從Hoechst 33258細(xì)胞核染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得到，加有益母草提取物的阿霉素心肌細(xì)胞的受損程度比不加益母草提取物的細(xì)胞要低， 這就說(shuō)明了益母草提取物的加入對(duì)心肌細(xì)胞的存活是有幫助的，能明顯降低心肌細(xì)胞的死亡率。

從文獻(xiàn)[1]來(lái)看，阿霉素的心臟毒性是由其半醒自由基介導(dǎo)的氧自由基的毒害引起的，阿霉素可致脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)增強(qiáng)，損傷細(xì)胞膜及細(xì)胞器膜，改變膜上蛋白質(zhì)的功能及酶的活性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載，核酸、蛋白質(zhì)合成受抑制，能量代謝障礙，嚴(yán)重影響心肌的收縮及舒張功能。益母草主要成分為益母草堿， 具有調(diào)經(jīng)活血、興奮子宮等作用， 主要用于婦科疾病。近年來(lái)許多研究表明，益母草的藥理作用是多方面的。益母草注射液試用于治療冠心病已有文獻(xiàn)報(bào)道[2]。臨床研究[3]及實(shí)驗(yàn)研究均表明， 心肌缺血可使機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)增強(qiáng)， 血漿丙二醛（MDA）升高。加入益母草后血漿MDA升幅低于阿霉素組， 全血谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH Px）高于阿霉素組， 說(shuō)明益母草對(duì)清除自由基系統(tǒng)酶的活性有保護(hù)作用， 可減少脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)， 減輕心肌細(xì)胞膜由氧自由基引發(fā)的損傷， 減低細(xì)胞膜的通透性， 從而減少心肌細(xì)胞內(nèi)心肌酶的漏出以及Ca2+ 流入心肌細(xì)胞內(nèi)，減輕心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+ 超載引起的細(xì)胞損傷。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果亦顯示，益母草提取物對(duì)阿霉素的心肌損傷有明顯保護(hù)作用。

參考文獻(xiàn)

夏臘梅， 伍杰雄. 川芎嗪對(duì)大鼠心肌線粒體損傷的保護(hù)作用[J]. 中國(guó)藥房， 2002， 13 （7）： 400-403.

王玉秋， 白令君， 何錫文. 復(fù)方生脈飲對(duì)羥自由基的清除作用研究[J]. 中國(guó)中藥雜志， 1998， 23 （1）： 45-50.

王旭， 邵一兵， 王正忠， 等. 天力體保對(duì)阿霉素所致大鼠心肌線粒體毒性的保護(hù)作用[J]. 中華醫(yī)學(xué)研究雜志， 2003， 3（8）： 680-681.

（收稿日期：2014-04-25）

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料采用卡方檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

MTT法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組細(xì)胞的吸光值A(chǔ)570和 A490， 以 A570/A490代表細(xì)胞活力，空白對(duì)照組細(xì)胞存活率為 100%，其余各組按存活率 = （各濃度組吸光值 /空白對(duì)照組吸光值） ×100%與之比較。阿霉素對(duì)照組平均存活率=（0.278/0.573）×100%=48.5%，益母草提取物組平均存活率=（0.364/0.573）×100%=63.4%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，表1）。

Hoechst 33258細(xì)胞核染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3個(gè)組在400倍的熒光顯微鏡觀察到的結(jié)果見(jiàn)圖1。

從圖1中我們可以看見(jiàn)，A為正常細(xì)胞，有橢圓形的細(xì)胞核；B為加入阿霉素的細(xì)胞， 細(xì)胞核發(fā)生固縮，呈典型的凋亡改變； C則顯示通過(guò)益母草提取物的加入，細(xì)胞的受損程度遠(yuǎn)好于B組，說(shuō)明益母草提取物的加入對(duì)阿霉素的心肌受損細(xì)胞具有保護(hù)作用。

討論

本實(shí)驗(yàn)提示，僅加阿霉素的心肌細(xì)胞平均存活率為48.5%，而加有益母草提取物后再加阿霉素的心肌細(xì)胞平均存活率為63.4%，比前者高。從Hoechst 33258細(xì)胞核染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得到，加有益母草提取物的阿霉素心肌細(xì)胞的受損程度比不加益母草提取物的細(xì)胞要低， 這就說(shuō)明了益母草提取物的加入對(duì)心肌細(xì)胞的存活是有幫助的，能明顯降低心肌細(xì)胞的死亡率。

從文獻(xiàn)[1]來(lái)看，阿霉素的心臟毒性是由其半醒自由基介導(dǎo)的氧自由基的毒害引起的，阿霉素可致脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)增強(qiáng)，損傷細(xì)胞膜及細(xì)胞器膜，改變膜上蛋白質(zhì)的功能及酶的活性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載，核酸、蛋白質(zhì)合成受抑制，能量代謝障礙，嚴(yán)重影響心肌的收縮及舒張功能。益母草主要成分為益母草堿， 具有調(diào)經(jīng)活血、興奮子宮等作用， 主要用于婦科疾病。近年來(lái)許多研究表明，益母草的藥理作用是多方面的。益母草注射液試用于治療冠心病已有文獻(xiàn)報(bào)道[2]。臨床研究[3]及實(shí)驗(yàn)研究均表明， 心肌缺血可使機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)增強(qiáng)， 血漿丙二醛（MDA）升高。加入益母草后血漿MDA升幅低于阿霉素組， 全血谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH Px）高于阿霉素組， 說(shuō)明益母草對(duì)清除自由基系統(tǒng)酶的活性有保護(hù)作用， 可減少脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)， 減輕心肌細(xì)胞膜由氧自由基引發(fā)的損傷， 減低細(xì)胞膜的通透性， 從而減少心肌細(xì)胞內(nèi)心肌酶的漏出以及Ca2+ 流入心肌細(xì)胞內(nèi)，減輕心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+ 超載引起的細(xì)胞損傷。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果亦顯示，益母草提取物對(duì)阿霉素的心肌損傷有明顯保護(hù)作用。

參考文獻(xiàn)

夏臘梅， 伍杰雄. 川芎嗪對(duì)大鼠心肌線粒體損傷的保護(hù)作用[J]. 中國(guó)藥房， 2002， 13 （7）： 400-403.

王玉秋， 白令君， 何錫文. 復(fù)方生脈飲對(duì)羥自由基的清除作用研究[J]. 中國(guó)中藥雜志， 1998， 23 （1）： 45-50.

王旭， 邵一兵， 王正忠， 等. 天力體保對(duì)阿霉素所致大鼠心肌線粒體毒性的保護(hù)作用[J]. 中華醫(yī)學(xué)研究雜志， 2003， 3（8）： 680-681.

（收稿日期：2014-04-25）

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料采用卡方檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

MTT法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組細(xì)胞的吸光值A(chǔ)570和 A490， 以 A570/A490代表細(xì)胞活力，空白對(duì)照組細(xì)胞存活率為 100%，其余各組按存活率 = （各濃度組吸光值 /空白對(duì)照組吸光值） ×100%與之比較。阿霉素對(duì)照組平均存活率=（0.278/0.573）×100%=48.5%，益母草提取物組平均存活率=（0.364/0.573）×100%=63.4%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，表1）。

Hoechst 33258細(xì)胞核染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3個(gè)組在400倍的熒光顯微鏡觀察到的結(jié)果見(jiàn)圖1。

從圖1中我們可以看見(jiàn)，A為正常細(xì)胞，有橢圓形的細(xì)胞核；B為加入阿霉素的細(xì)胞， 細(xì)胞核發(fā)生固縮，呈典型的凋亡改變； C則顯示通過(guò)益母草提取物的加入，細(xì)胞的受損程度遠(yuǎn)好于B組，說(shuō)明益母草提取物的加入對(duì)阿霉素的心肌受損細(xì)胞具有保護(hù)作用。

討論

本實(shí)驗(yàn)提示，僅加阿霉素的心肌細(xì)胞平均存活率為48.5%，而加有益母草提取物后再加阿霉素的心肌細(xì)胞平均存活率為63.4%，比前者高。從Hoechst 33258細(xì)胞核染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得到，加有益母草提取物的阿霉素心肌細(xì)胞的受損程度比不加益母草提取物的細(xì)胞要低， 這就說(shuō)明了益母草提取物的加入對(duì)心肌細(xì)胞的存活是有幫助的，能明顯降低心肌細(xì)胞的死亡率。

從文獻(xiàn)[1]來(lái)看，阿霉素的心臟毒性是由其半醒自由基介導(dǎo)的氧自由基的毒害引起的，阿霉素可致脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)增強(qiáng)，損傷細(xì)胞膜及細(xì)胞器膜，改變膜上蛋白質(zhì)的功能及酶的活性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載，核酸、蛋白質(zhì)合成受抑制，能量代謝障礙，嚴(yán)重影響心肌的收縮及舒張功能。益母草主要成分為益母草堿， 具有調(diào)經(jīng)活血、興奮子宮等作用， 主要用于婦科疾病。近年來(lái)許多研究表明，益母草的藥理作用是多方面的。益母草注射液試用于治療冠心病已有文獻(xiàn)報(bào)道[2]。臨床研究[3]及實(shí)驗(yàn)研究均表明， 心肌缺血可使機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)增強(qiáng)， 血漿丙二醛（MDA）升高。加入益母草后血漿MDA升幅低于阿霉素組， 全血谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH Px）高于阿霉素組， 說(shuō)明益母草對(duì)清除自由基系統(tǒng)酶的活性有保護(hù)作用， 可減少脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)， 減輕心肌細(xì)胞膜由氧自由基引發(fā)的損傷， 減低細(xì)胞膜的通透性， 從而減少心肌細(xì)胞內(nèi)心肌酶的漏出以及Ca2+ 流入心肌細(xì)胞內(nèi)，減輕心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+ 超載引起的細(xì)胞損傷。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果亦顯示，益母草提取物對(duì)阿霉素的心肌損傷有明顯保護(hù)作用。

參考文獻(xiàn)

夏臘梅， 伍杰雄. 川芎嗪對(duì)大鼠心肌線粒體損傷的保護(hù)作用[J]. 中國(guó)藥房， 2002， 13 （7）： 400-403.

王玉秋， 白令君， 何錫文. 復(fù)方生脈飲對(duì)羥自由基的清除作用研究[J]. 中國(guó)中藥雜志， 1998， 23 （1）： 45-50.

王旭， 邵一兵， 王正忠， 等. 天力體保對(duì)阿霉素所致大鼠心肌線粒體毒性的保護(hù)作用[J]. 中華醫(yī)學(xué)研究雜志， 2003， 3（8）： 680-681.

（收稿日期：2014-04-25）