呂昕謠，趙 穎，趙國淼，曾燕如*，宋緒忠，楊 華

（1.浙江農林大學 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江 臨安 311300；2.浙江省舟山市林業(yè)科學研究院，浙江 舟山 316000；3.浙江省林業(yè)科學研究院，浙江 杭州 310023）

普陀樟（Cinnamomum japonicumvar.chenii）系樟科樟屬常綠喬木，為舟山海島特有瀕危植物。集中分布在舟山市普陀區(qū)的普陀山、朱家尖及其毗鄰的懸水小島上，除此之外的其他區(qū)域均未見有該樹種的天然分布[1]。普陀樟木材堅實致密，紋理通直，耐腐，耐水濕，是優(yōu)良的用材樹種；且根系發(fā)達，抗風性強，且兼具耐鹽堿、耐干旱瘠薄等特性，適應性廣，非常適宜沿海地區(qū)栽種。而目前卻缺乏對野生普陀樟致瀕原因等各方面的足夠了解，難以實施有效的遺傳保育。

相關序列擴增多態(tài)性（Sequence-related amplifiedpolymorphism, SRAP）是Li和Quiros[2]開發(fā)的分子標記技術，該技術通過獨特的引物設計對開放閱讀框（Open reading frames, ORFs）進行擴增，因個體不同以及物種的內含子、啟動子與間隔區(qū)長度不等而產生多態(tài)性[3]。Ferriol等[4]在觀賞南瓜（Cucurbita moschata）中利用SRAP和AFLP兩種分子標記進行遺傳多樣性實驗，結果與AFLP標記相比，SRAP標記結果更接近其性狀變異。Budak[5]等對野牛草（Buchloe dactyloides）進行ISSR（Inter-simple Sequence Repeat）、SSR（Simple Sequence Repeat）、RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA）和SRAP等4種分子標記的遺傳多樣性研究，結果SRAP表現(xiàn)出更豐富的遺傳多樣性，是區(qū)分能力最強的標記。與其他分子標記相比，SRAP標記技術具有重復性好、多態(tài)性高、操作簡便、共顯性、易測序、引物具有通用性等優(yōu)越性，已逐漸成為種質資源研究的有效技術，近年來多應用于遺傳多樣性分析[5]、遺傳圖譜構建[6]以及重要性狀標記[7]等諸多領域。

目前，有關普陀樟分子標記方面的研究尚未見報道。本研究建立了普陀樟的SRAP-PCR反應體系，可為進一步開展普陀樟的遺傳多樣性及相關遺傳研究提供技術支撐，也可為普陀樟基因組分析、分子標記輔助育種等奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮健康的普陀樟葉片樣品7份采自舟山群島不同島嶼，帶回實驗室后清水洗凈，放置－40℃冰箱保存待用。

表1 SRAP 引物序列Table1 Sequences of SRAP primers

Taq DNA聚合酶（5U/μL）購自上海申能博彩生物科技有限公司；dNTP、DNA Marker（Fermentas）、SRAP 引物（表1）等均購自生工生物工程（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取與檢測 采用改良CTAB方法結合TNE的方法[8]提取普陀樟基因組DNA。提取的DNA用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，用紫外分光光度計（NanoDrop 1000 Spectrophotometer，美國）測定A260、A280，并計算兩者的比值，以檢驗DNA的質量，并根據測定的濃度將DNA稀釋到10 ng/μL，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SRAP-PCR反應體系的建立 基于劉浩凱等優(yōu)化的適用于榧樹的SRAP分析方法（含PCR產物電泳）[9]采用L16（45）正交試驗設計，對可能影響普陀樟SRAP-PCR反應的Mg2+濃度、dNTPS、Taq DNA聚合酶、引物（F2/R4）和模板DNA用量進行5因素4水平正交試驗（表2）。反應總體積為20 μL，實驗重復4次，以確定最佳體系組合。

表2 SRAP-PCR正交設計試驗L16（45）Table2 L16（45）orthogonal design for SRAP-PCR reaction

反應程序為94℃預變性5 min；共5個循環(huán)，每個循環(huán)94℃變性45s，35℃退火45s，72℃延伸1 min；隨后35個循環(huán)，每個循環(huán)94℃變性45 s，50℃退火45s，72℃延伸1 min；最后72℃延伸5 min，4℃保存。擴增產物加入3 μL Loading dye混合均勻，以3 000 bp DNA Ladder為參照標準，采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，160V電泳85 min。電泳結束后采用銀染法進行染色，顯色后將凝膠置于可見光燈箱上觀察電泳結果，并拍照保存。

隨機選取F6/R7和F6/R8兩個引物組合，利用篩選出的普陀樟最優(yōu)體系，對30份普陀樟DNA材料進行PCR擴增，檢測反應體系的穩(wěn)定性。

利用優(yōu)化設計確定的SRAP-PCR的最佳反應體系，用表1所示的10個正向引物和10個反向引物組合的100對引物，對4個不同普陀樟樣品進行引物組合篩選。

2 結果與分析

2.1 普陀樟基因組DNA的提取

經紫外分光光度計測定，8份普陀樟DNA樣品OD260/OD280值均在1.8 ～ 2.0；1%瓊脂糖電泳檢測結果（圖1）顯示，DNA條帶完整清晰，無拖尾現(xiàn)象，符合分子標記擴增對DNA的要求。

圖1 普陀樟DNA的瓊脂糖電泳檢測圖Figure1 Argarose electrophoretogram of genomic DNAs extracted in C.japonicum var.chenii

2.2 SRAP-PCR反應體系的優(yōu)化

從正交實驗結果可以看出，不同的PCR組份組合擴增效果具有明顯的差異，其中1 ～ 4、7、8號擴增效果不好，11、12、15、16號位點較清楚，但位點數(shù)少，均予以淘汰（圖2）。仔細觀察發(fā)現(xiàn)，9、10號比13、14號擴增的位點數(shù)多，而且更加清晰。直觀分析10號組合為佳，9號組合次之，二者間無明顯差異。慮到9號組合中 Taq 酶的用量為 2 U，因此本著經濟有效的原則，最終確定10號組合為最理想的SRAP-PCR反應體系，即20 μL PCR體系包括 2.5 mmol/L Mg2+、0.2 mmol/L dNTPs、1.5 U Taq DNA聚合酶、0.4 μmol/L引物、10 ng模板DNA、2 μL 10×PCR buffer。

圖2 正交實驗產物電泳圖Figure2 Electrophoretogram of PCR products based on the orthogonal design

2.3 SRAP-PCR體系的穩(wěn)定性檢測及引物篩選

SRAP-PCR體系的穩(wěn)定性檢測表明，擴增譜帶清晰而穩(wěn)定，位點數(shù)多，且多態(tài)性豐富（圖3），說明建立的反應體系具有良好的穩(wěn)定性，適合于普陀樟的SRAP-PCR分析。利用該反應體系，從100對引物組合（表1）中篩選出20對擴增產物清晰、多態(tài)性較好的引物（F2R7、F3R7、F4R7、F5R7、F6R7、F8R7、F9R7、F5R1、F5R8、F6R8、F9R6、F2R1、F4R2、F5R1、F5R2、F3R3、F4R3、F6R4、F10R4、F5R5），用于普陀樟后續(xù)遺傳多樣性分析。

圖3 SRAP反應體系穩(wěn)定性檢測（引物對：上：F6R7；下：F6R8）Figure3 Testing of the SRAP reaction (Primer pairs: F6R7 (up) and F6R8(down))

3 結論與討論

SRAP分子標記是基于PCR反應的一種標記技術，它的結果受到體系中各個因素的影響，且各因素之間還存在相互作用，因此各因素之間的配比只有達到最佳狀態(tài)時，才能得到穩(wěn)定、可重復的擴增結果。不同植物適合的SRAP 反應體系不同，所以需要根據物種的不同對反應體系進行優(yōu)化。

本實驗采用了一次性正交實驗設計篩選反應體系，并對該體系穩(wěn)定性進行了檢測及初步應用，結果顯示擴增位點清晰穩(wěn)定，多態(tài)性好，重復性強，說明本研究建立的普陀樟SRAP-PCR體系穩(wěn)定可靠、擴增效率高，為日后普陀樟基因組分析、分子標記輔助育種、遺傳多樣性研究等奠定了基礎。

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