Beinhart1000-1抗赤星病基因的QTL定位

高亭亭，蔣彩虹，羅成剛，楊愛國(guó)，程立銳，代帥帥

煙草行業(yè)煙草基因資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101

Beinhart1000-1抗赤星病基因的QTL定位

高亭亭，蔣彩虹，羅成剛，楊愛國(guó)，程立銳，代帥帥

煙草行業(yè)煙草基因資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101

為探索Beinhart1000-1的赤星病抗性遺傳規(guī)律，以抗赤星病品種Beinhart1000-1為母本，感病品種G140為父本，構(gòu)建F1及F2代群體，篩選與抗性基因緊密連鎖的SSR標(biāo)記，并進(jìn)行抗性基因的QTL定位。結(jié)果表明，Beinhart1000-1的赤星病抗性由顯性基因控制。同時(shí)利用混合群體分組分析法，從2653對(duì)SSR引物中，得到83對(duì)在抗感池間表現(xiàn)多態(tài)且擴(kuò)增條帶穩(wěn)定清晰的SSR標(biāo)記。以F2代群體115個(gè)單株為作圖群體，利用該83對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)WinQTLCart2.5分析，構(gòu)建了83個(gè)標(biāo)記的遺傳連鎖圖譜，獲得2個(gè)抗赤星病QTL位點(diǎn)，分別位于7號(hào)和15號(hào)連鎖群上。

煙草; Beinhart1000-1；赤星病; SSR; QTL定位

煙草赤星病是嚴(yán)重制約我國(guó)煙葉生產(chǎn)的一類真菌病害，該病具有潛育期短，爆發(fā)快的特點(diǎn)，在溫濕度適宜的條件下，短時(shí)間內(nèi)即可大面積流行，給煙葉生產(chǎn)造成巨大損失[1-2]。雪茄煙品種Beinhart1000-1高抗赤星病，是抗病育種的優(yōu)良抗源，對(duì)其抗性進(jìn)行深入研究具有重要意義。

近幾年來，為了快速有效的選擇優(yōu)良植株，國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用了分子標(biāo)記技術(shù)：尋找與優(yōu)良性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記，然后利用這些標(biāo)記去栽培群體中選擇優(yōu)良單株，從而提高育種效率、縮短育種年限。分子標(biāo)記中的SSR（Simple sequence repeats）標(biāo)記具有重復(fù)穩(wěn)定性好的特點(diǎn)，但是由于SSR標(biāo)記引物的開發(fā)比較緩慢，限制了其在煙草研究中的應(yīng)用。直到Bindler等公開發(fā)表了高密度的煙草遺傳連鎖圖譜，包括2300多對(duì)SSR引物[3-4]，SSR標(biāo)記在煙草上的應(yīng)用才有了長(zhǎng)足發(fā)展。

目前，國(guó)內(nèi)對(duì)Beinhart1000-1的赤星病抗性研究還非常有限，其抗性遺傳潛力很大。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的不斷發(fā)展，對(duì)該品種的研究也在不斷深入。

本研究旨在篩選與Beinhart1000-1的赤星病抗性基因緊密連鎖的SSR標(biāo)記，分析Beinhart1000-1赤星病抗性遺傳規(guī)律，將其抗性基因進(jìn)行QTL定位，研究親本來源不同時(shí)，抗性基因遺傳位點(diǎn)的差異。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料

母本為抗赤星病品種Beinhart1000-1，父本為感病品種G140，兩者都由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所遺傳育種研究中心提供，由它們雜交獲得(Beinhart1000-1×G140)F1，自交獲得F2代分離群體。

1.1.2 煙草赤星病菌

用于接種鑒定的赤星病菌由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所植物保護(hù)研究室提供。

在馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基上接種煙草赤星病菌，然后將其在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)大約兩周。當(dāng)菌絲體基本長(zhǎng)滿培養(yǎng)基時(shí)取出，在培養(yǎng)皿中倒入無菌水，浸泡約5 min后刮下菌絲體，加入蒸餾水，配成孢子濃度約為1xl06/mL的懸浮液[5]，備用。

1.1.3 SSR引物

所用SSR引物來自Bindler[6]公開發(fā)表的煙草SSR連鎖圖及其引物序列，且標(biāo)記所在連鎖群已知。由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。用超純水將引物粉末稀釋為10 μmol/L的工作濃度備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌液接種方法

試驗(yàn)采用劃傷懸滴法接種?？共?duì)照為Beinhart l000-l，感病對(duì)照為G140。在煙葉成熟期，每株煙選取兩片底部長(zhǎng)勢(shì)相近的葉片接種，在每片用于接種的葉子的主脈兩側(cè)用接種針均勻地劃6個(gè)十字劃傷，在每個(gè)傷口處懸滴一滴接種菌液，接種后將接種葉片套上透明塑料袋，以保持溫濕度。接種7 d后，劃傷周圍開始出現(xiàn)侵染癥狀，接種14 d發(fā)病癥狀明顯。接種后20 d時(shí)，調(diào)查發(fā)病情況，計(jì)算病情指數(shù)。

1.2.2 病情統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)[5]

單株調(diào)查分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)：全部劃傷無侵染；l級(jí)：有25%的劃傷形成病斑，但不擴(kuò)展；2級(jí)：有50%的劃傷形成病斑，且稍有擴(kuò)展；3級(jí)：80%的劃傷形成病斑，且有明顯擴(kuò)展；4級(jí)：100%的劃傷有侵染，且形成很大病斑，被侵染處形成壞死斑。

群體抗性劃分標(biāo)準(zhǔn)：免疫：病級(jí)數(shù)為0級(jí)；高抗：病級(jí)數(shù)為1級(jí)；中抗：病級(jí)數(shù)為2級(jí)；中感：病級(jí)數(shù)為3級(jí)；高感：病級(jí)數(shù)為4級(jí)。

其中，0級(jí)、1級(jí)和2級(jí)劃分為抗病群體，3級(jí)和4級(jí)劃分為感病群體。

病情指數(shù)=[(病級(jí)代表值x該級(jí)葉片數(shù))/(調(diào)查總?cè)~片數(shù)/最高級(jí)代表)]x100

1.2.3 DNA的提取及抗感池的建立

采用稍加改良的CTAB 法提取煙草總基因組DNA[7]，利用紫外分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)所提DNA的質(zhì)量，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

抗感池的建立：在抗性鑒定之后，從 F2代分離群體中分別選取10株感病單株和 10 株抗病單株，將其 DNA 分別等量混勻組成抗感池。

1.2.4 PCR擴(kuò)增反應(yīng)和電泳檢測(cè)

PCR 反應(yīng)體系[8]總體積為10 μL，其中30～50 ng/μL的DNA模板1 μL、5 μmol/L正反向引物各 1 μL，2×Mix 5 μL，H2O 2 μL。所用試劑購(gòu)自MBI。

PCR 反應(yīng)在 96 孔ABI Veriti型多梯度PCR儀上運(yùn)行[9]：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 15 s，57 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共 35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。其中，退火溫度根據(jù)引物序列不同略作調(diào)整。

PCR 反應(yīng)結(jié)束后，取3 μL PCR 產(chǎn)物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上恒電壓1000 v 電泳1.5 h左右。用改進(jìn)的 NaOH銀染方法[10]對(duì)電泳后的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行染色顯影。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

首先使用MAPMAKER軟件包，利用供試F2群體的SSR標(biāo)記基因型數(shù)據(jù)，構(gòu)建遺傳連鎖圖。然后結(jié)合遺傳連鎖圖譜和表型鑒定數(shù)據(jù)，應(yīng)用WinQTLCart2.5軟件進(jìn)行QTL定位，其中permutation times設(shè)為1 000，LOD閾值設(shè)定為≥2.5。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試材料赤星病抗性鑒定結(jié)果

抗性鑒定結(jié)果表明：Bcinhartl000-l的病情指數(shù)為9.7，表現(xiàn)為抗??；G140的病情指數(shù)為66，表現(xiàn)為感病；F1代病情指數(shù)為38.4，表現(xiàn)為中抗（表1）。據(jù)此推測(cè)，Beinhartl000-l對(duì)赤星病的抗病性是由顯性基因控制的。

表1 供試煙草材料接種赤星病菌后發(fā)病情況調(diào)查表Tab.1 Disease observation of tobacco materials inoculated with the brown spot

2.2 煙草赤星病抗性遺傳分析

大田條件下，對(duì)F2代分離群體進(jìn)行赤星病的抗性鑒定。根據(jù)上面試驗(yàn)方法中提到的病情劃分標(biāo)準(zhǔn)，將其病級(jí)劃分為 0～4 級(jí) 5 個(gè)級(jí)別，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖1。由圖可知，F(xiàn)2代群體的病情分布情況基本符合正態(tài)分布規(guī)律，結(jié)合往年田間試驗(yàn)觀察及Beinhart1000-1的自身抗性表現(xiàn)，預(yù)測(cè)Beinhart1000-1對(duì)赤星病的抗性由多基因控制。

圖1 F2群體單株病情分布圖Fig.1 The resistance identification of seedling in F2 generation

2.3 抗性基因的SSR標(biāo)記篩選

以抗感親本及F1的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選了分布于24條連鎖群上的2 653對(duì)SSR引物，共篩選得到184對(duì)多態(tài)性引物，多態(tài)比率為6.9%。采用Michelmore等[11]提出的分離群體分組分析(BSA)法，將篩選到的多態(tài)性SSR引物在抗感池間進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，并將PCR產(chǎn)物用聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染顯色。從184對(duì)SSR引物中挑選出了83對(duì)擴(kuò)增穩(wěn)定且多態(tài)性顯著的引物。

圖2 引物M653在部分F2分離群體中的擴(kuò)增效果Fig.2 Polymorphism produced by M653 primer among the partial F2 plants

2.4 赤星病抗性基因的QTL定位分析

應(yīng)用該83對(duì)引物對(duì)抗性鑒定完畢的115株F2單株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再利用基因型數(shù)據(jù)構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，如圖3所示。共得到18個(gè)連鎖群，圖譜全長(zhǎng)1014.70 cm，包含72個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)，平均每個(gè)連鎖群上有4個(gè)SSR標(biāo)記，標(biāo)記間平均遺傳距離為14.09 cm，另外有11個(gè)標(biāo)記未能連鎖到該圖譜上。

根據(jù)構(gòu)建的遺傳圖譜，利用復(fù)合區(qū)間作圖法對(duì)煙草赤星病的抗性QTL進(jìn)行定位分析，共檢測(cè)到兩個(gè)QTL位點(diǎn)：一個(gè)位于7號(hào)連鎖群上，在標(biāo)記M122與M935之間，其峰值LOD為3.3688，貢獻(xiàn)率為15.9%，加性效應(yīng)0.0571，暫將其命名為RBS-1，則RBS-1與標(biāo)記M935間的遺傳距離為7.4 cm；另外一個(gè)QTL位于15號(hào)連鎖群上，在標(biāo)記M524與M653之間，其峰值LOD為3.1358，貢獻(xiàn)率為14.4%，加性效應(yīng)-0.1302，暫將其命名為RBS-2，則RBS-2與標(biāo)記M653間的遺傳距離為9.8 cm。定位分析最終結(jié)果如表2。

圖3 基于SSR的遺傳連鎖圖譜Fig.3 Genetic linkage map based on SSR markers

表2 QTL定位分析結(jié)果Tab.2 Results of QTL analysis

3 討論

目前種植的高抗赤星病的煙草品種較少，而雪茄煙品種Beinhart1000-1是公認(rèn)的抗赤星病育種的良好抗源，對(duì)其進(jìn)行深入細(xì)致的研究對(duì)有效利用該抗源進(jìn)行抗病品種的選育具有重要意義。

有研究認(rèn)為Beinhartl000-1的赤星病抗性是由單基因控制的部分顯性遺傳[12-13]；還有研究認(rèn)為Beinhartl000-1的赤星病抗性都是由多基因控制的[14-15]；郭永峰等[16-17]則認(rèn)為Beinhartl000-1的赤星病抗性為顯性多基因控制的水平抗性。本研究推測(cè)Beinhart1000-1對(duì)赤星病的抗性由顯性多基因控制，與前人的研究有一定的差異[5-6,12-18]，這可能是由于親本材料的選擇、抗性鑒定株系、病菌接種方法和實(shí)驗(yàn)環(huán)境等的不同導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)差異。

蔣彩虹等[18]曾在2007年篩選到一個(gè)與Beinhartl000-1的赤星病抗性基因相連鎖的SRAP標(biāo)記，遺傳距離為16.0 cm。本研究應(yīng)用的是SSR引物，來自2011年Bindler[6]公開發(fā)表的高密度連鎖圖譜，覆蓋整個(gè)煙草基因組，要比蔣彩虹等人所用的SRAP引物穩(wěn)定重復(fù)性好，且數(shù)量更大，密度也更高。此外，本實(shí)驗(yàn)是利用WinQTLCart2.5軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)所得基因型數(shù)據(jù)與表型數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果更為可靠。目前針對(duì)赤星病抗性基因的QTL定位研究較少，本研究利用煙草高密度遺傳連鎖圖譜定位到兩個(gè)QTL，分別位于7號(hào)和15號(hào)連鎖群上，與目的基因間的遺傳距離分別為7.4 cm和9.8 cm，這進(jìn)一步表明Beinhartl000-1對(duì)赤星病的抗病性由多基因調(diào)控，而且這兩個(gè)QTL分別與標(biāo)記M935和M653連鎖，在分子標(biāo)記輔助育種中具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié)論

利用赤星病抗、感親本篩選得到的多態(tài)SSR引物，對(duì)F2群體單株進(jìn)行擴(kuò)增，找到兩個(gè)與赤星病抗性基因緊密連鎖的QTL：其中一個(gè)存在于7號(hào)連鎖群上，與標(biāo)記M935間的遺傳距離為7.4 cm，貢獻(xiàn)率為15.9 %；另外一個(gè)位于15號(hào)連鎖群上，與標(biāo)記M653間的遺傳距離為9.8 cm，貢獻(xiàn)率為14.4 %。并推測(cè)Beinhart1000-1對(duì)赤星病的抗病性由顯性多基因控制。

[1]Shew H D,Lucas G B.Compendium of tobacco disease [J].American Phytopathological Society (APS),1990:10-12.

[2]佟道儒.煙草育種學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,1997:432-438.

[3]Bindler G,Hoeven R,van der Hoeven R,et al.A microsatellite marker based linkage map of tobacco[J].Theor Appl Genet,2007,114(2): 341-349.

[4]Mueller L A,Solow T H,Taylor N,et al.The SOL genomics network.A comparative resource for solanaceae biology and beyond[D].Plant Physiology,2005,138:1310-1317.

[5]蔣彩虹等.烤煙凈葉黃的赤星病抗性遺傳分析及SSR 標(biāo)記[J].分子植物育種,2011(9):1642-1646.

[6]Gregor Bindler,J?rg Plieske，Nicolas Bakaher.A high density genetic map of tobacco (Nicotiana tabacumL) obtained from large scale microsatellite marker development [J].Theor Appl Genet,2011,123:219-230.

[7]王珍,方宣鈞.植物DNA分離[J].分子植物育種,2003,1（2）:281-288.

[8]范靜苑.煙草黃瓜花葉病毒病抗性遺傳分析及其分子標(biāo)記[D].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2009.

[9]范靜苑,王元英,蔣彩虹，等.煙草CMV抗性鑒定及抗性基因的SSR標(biāo)記研究[J].分子植物育種,2009,7(2):355-359.

[10]任民,賈興華,蔣彩虹，等.Bassam和Sanguinetti銀染方法在SRAP 和TRAP標(biāo)記中的比較研究[J].生物技術(shù)通報(bào),2008(1):113-116.

[11]Michelmore R W，Paran I.Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregate analysis: A rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating populations[J].Process Natural Academic Science USA,1991,88: 9828-9832.

[12]Chaplin J F，Graham T W.Brown spot resistance inNicotiana tabacum[J].Tob Sci,1963,7:59-62.

[13]Chaplin J F.Registration Of PD121 tobacco germplasm[J].Crop Sci,1971,10:81-84.

[14]Stovely J R,Chaplin J F，Gwynn G R.Registration of Bel 921 Brown spot resistant flue-cured tobacco Germplasm[J].Crop Sci,1984,24:830-831.

[15]Stevely J R，et al.Brown spot resistance inNieotiana tabacumCermplasm[J].Tob Sei,1981,25:24-29.

[16]郭永峰,朱賢朝,孔凡玉,等.赤星病抗源的抗性比較[J].中國(guó)煙草科學(xué),1997(l):1-6.

[17]郭永峰,朱賢朝,石金開,等.煙草對(duì)赤星病田間抗性的遺傳研究[J].中國(guó)煙草科學(xué),1998(3):l-6.

[18]蔣彩虹.煙草赤星病抗性分子標(biāo)記篩選[D].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所2007年碩士畢業(yè)論文.

Mapping of quantitative trait loci affecting resistance to brown spot in tobacco line Beinhart1000-1

GAO Tingting,JIANG Caihong,LUO Chenggang,YANG Aiguo,CHENG Lirui,DAI Shuaishuai
Key Laboratory for Tobacco Gene Resources,Tobacco Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Qingdao 266101,Shandong，China

F1and F2populations were constructed from a cross between Beinhart1000-1 and susceptible variety G140 to study the genetic basis of resistance to brown spot in tobacco cigar line,Beinhart1000-1,and to identify genomic locations contributing to resistance.Inheritance of resistance to brown spot was analyzed in F1and F2populations.Results shown that resistance to brown spot in Beinhart1000-1 was controlled by dominance genes.A population of 115 F2was further used for QTL mapping with 83 SSR markers.Two QTLs,RBS-1 and RBS-2,were discovered on No.7 and 15 genetic linkage groups through composite interval mapping method.The major QTL,RSB-1,was flanked by marker M935 with genetic distance of 7.4 cm and accounted for 15.89% of phenotypic variance.Other major QTL,RBS-2,was flanked by marker M653 with genetic distance of 9.8 cm and accounted for 14.42% of phenotypic variance.These results could facilitate our understanding of inheritance of resistance to brown spot in tobacco by marker-assisted selection.

tobacco; Beinhart1000-1; tobacco brown spot; SSR; QTL analysis

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.02.018

S47; Q78 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1004-5708(2014)02-0104-04

國(guó)家煙草專賣局項(xiàng)目(110201002002)；四川省煙草公司科技項(xiàng)目（201101004）

高亭亭（1987—），碩士，主要從事作物遺傳育種研究，Email：gaotingting111@163.com

蔣彩虹（1972—），助理研究員，主要從事煙草遺傳育種研究，Email：jiangcaihong@caas.cn

2013-07-05