時(shí)春麗，蔣 磊，肖獻(xiàn)忠*

(湖南省婦幼保健院 中南大學(xué) 1.檢驗(yàn)科； 2.湘雅醫(yī)學(xué)院 病理生理學(xué)教研室， 湖南 長(zhǎng)沙 410008)

研究論文

過表達(dá)MIPU1降低阿霉素所致人胚胎腎HEK293細(xì)胞的凋亡

時(shí)春麗1，蔣 磊2，肖獻(xiàn)忠2*

(湖南省婦幼保健院 中南大學(xué) 1.檢驗(yàn)科； 2.湘雅醫(yī)學(xué)院 病理生理學(xué)教研室， 湖南 長(zhǎng)沙 410008)

目的探討過表達(dá)MIPU1對(duì)阿霉素(Doxorubicin,DOX)所致細(xì)胞凋亡的影響及其可能的分子機(jī)制，為預(yù)防DOX抗腫瘤治療過程中的毒副作用提供新的思路。方法1)MTT實(shí)驗(yàn)觀察DOX處理下過表達(dá)MIPU1對(duì)細(xì)胞存活率的影響；2)Hoechst染色和流式細(xì)胞術(shù)分析過表達(dá)MIPU1對(duì)DOX所致細(xì)胞凋亡的影響；3)RT-PCR和Western blot分析過表達(dá)MIPU1對(duì)DOX所致Bcl- 2、P53和Bax在mRNA水平和蛋白水平上表達(dá)變化的影響。結(jié)果過表達(dá)MIPU1后，細(xì)胞存活率明顯升高(Plt;0.05vspEGFP+DOX)，凋亡率顯著下降(Plt;0.01vspEGFP+DOX)，P53和Bax的表達(dá)顯著下降(Plt;0.05vspEGFP+DOX)，而Bcl- 2的表達(dá)則明顯增多(Plt;0.05vspEGFP+DOX)。結(jié)論過表達(dá)MIPU1能降低DOX引起的HEK293細(xì)胞凋亡，可能與抑制P53和Bax的表達(dá)同時(shí)促進(jìn)Bcl- 2的表達(dá)有關(guān)。

細(xì)胞凋亡；阿霉素； MIPU1；Bax；Bcl- 2

Mipu1(myocardial ischemic preconditioning up-regulated gene 1)是在大鼠心肌缺血預(yù)適應(yīng)中發(fā)現(xiàn)的一種表達(dá)上調(diào)的新基因，其蛋白是一種KRAB型鋅指蛋白，具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用。針對(duì)大鼠的Mipu1已做了很多的功能研究[1- 3]，并發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Mipu1能分別抑制H2O2和TNF-ɑ誘導(dǎo)的Fas和Bid蛋白的表達(dá)，且這種抗凋亡作用與直接和啟動(dòng)子結(jié)合而抑制其表達(dá)有關(guān)[4]。

阿霉素是臨床常用的抗腫瘤藥物，在發(fā)揮其強(qiáng)大抗腫瘤作用[5]的同時(shí)出現(xiàn)了很多副作用，其中在阿霉素腎病模型中，腎小球硬化，腎小管萎縮，在硬化區(qū)和萎縮區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增多[6]。在阿霉素導(dǎo)致的腎臟損傷中，某些凋亡蛋白發(fā)生了明顯的變化[7]。Mipu1作為一種新發(fā)現(xiàn)的蛋白，其能否在DOX所致的細(xì)胞損傷中發(fā)揮保護(hù)作用則還不清楚。

1 材料與方法

1.1 材料

人胚胎腎細(xì)胞HEK293(American type culture collection,ATCC)；DMEM(Hyclone公司)；胎牛血清(杭州四季青生物)；阿霉素(Doxorubicin,貨號(hào)44583，Sigma公司)；pEGFP-MIPU1質(zhì)粒； Bax抗體(Epitomics公司)；Bcl- 2抗體、P53抗體(安博生物技術(shù)有限公司)；Mipu1抗體、MTT檢測(cè)試劑盒、Hoechst33258(Sigma公司)；GFP抗體(Cell Signaling公司)；流式凋亡檢測(cè)試劑盒Annexin ⅴAPC/PI(eBioscience公司)。

1.2 引物序列(表1)1.3 HEK293細(xì)胞的培養(yǎng)及處理

細(xì)胞按照1×106個(gè)/每瓶接種50 cm2培養(yǎng)瓶中，用含10%胎牛血清的DMEM培基培養(yǎng)。細(xì)胞置于37 ℃，5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞增殖狀態(tài)好匯合度達(dá)到80%以上時(shí)用來做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行相應(yīng)處理。

1.4 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)步驟

實(shí)驗(yàn)分為兩步進(jìn)行，具體見說明書。

表1 引物序列Table 1 Primer sequemce

反應(yīng)條件：GAPDH：95 ℃ 10 min，95 ℃ 20 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，25個(gè)循環(huán)；MIPU1：95 ℃ 10 min，95 ℃ 20 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30個(gè)循環(huán)； Bax：95 ℃ 10 min，95 ℃ 20 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，25個(gè)循環(huán)； Bcl- 2：95 ℃ 10 min，95 ℃ 20 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，32個(gè)循環(huán)；P53：95 ℃ 10 min，95 ℃ 20 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30個(gè)循環(huán)。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所擴(kuò)條帶，凝膠成像系統(tǒng)拍照后Quantity One軟件進(jìn)行灰度掃描分析。

1.5 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)目的蛋白

細(xì)胞經(jīng)過處理到達(dá)時(shí)間點(diǎn)PBS洗1～2遍后裂解細(xì)胞，超聲15 s，置于冰上繼續(xù)裂解30 min。4 ℃，12 000 r/min離心20 min。將上清液轉(zhuǎn)移到新的Eppendorf管中即得到細(xì)胞的總蛋白。將80 μg蛋白與5×SDS上樣緩沖液混勻，100 ℃煮沸10 min。樣品經(jīng)12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，50 mA穩(wěn)流濕轉(zhuǎn)過夜至PVDF膜上。室溫封閉4 h后加入相應(yīng)一抗，4 ℃反應(yīng)過夜。TBST洗膜液洗3次，每次10 min，加入相應(yīng)二抗，室溫?fù)u床慢速反應(yīng)45 min，TBST洗膜液洗3次，每次10 min，DAB顯色，吸光度掃描定量分析。

1.6Hoechst33258染核，檢測(cè)細(xì)胞核凋亡形態(tài)及凋亡百分率計(jì)算

經(jīng)過實(shí)驗(yàn)處理后4%多聚甲醛固定10 min， Hoechst33258 20 μg/mL染色后孵育15～20 min，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài)。隨機(jī)選取3個(gè)視野，每個(gè)視野200個(gè)細(xì)胞核，計(jì)算凋亡百分率，即凋亡百分率=(凋亡細(xì)胞核/200)×100%。

1.7 MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率

細(xì)胞接種于96孔板中，濃度為1×107/L，每孔200 μL，根據(jù)實(shí)驗(yàn)處理完細(xì)胞后每孔加入20 μL MTT(5 g/L)溶液， 4 h后吸去培養(yǎng)液，每孔加入150 mL DMSO，置于搖床上低速振蕩10 min，使甲瓚結(jié)晶物充分溶解，酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)量各孔的吸光度值。

1.8 流式細(xì)胞數(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

具體按照eBioscience公司的AnnexinⅤ Staining Protocols試劑盒進(jìn)行操作。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 過表達(dá)MIPU1對(duì)細(xì)胞存活率的影響

HEK293細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pEGFP或pEGFP-MIPU1 24 h后1 μmol/L DOX處理24 h，pEGFP+DOX組的細(xì)胞存活率比pEGFP組明顯下降，當(dāng)過表達(dá)MIPU1后則細(xì)胞存活率明顯增加(圖1)。

*Plt;0.05 compared with pEGFP;#Plt;0.05 compared with pEGFP+DOX圖1 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過表達(dá)MIPU1對(duì)細(xì)胞存活率的影響Fig 1 Effect of MIPU1 overexpression on DOX-inducedHEK293 cells death using MTT assay(±s,n=3)

2.2Hoechst33258染核觀察過表達(dá)MIPU1后細(xì)胞凋亡的變化

轉(zhuǎn)染pEGFP和pEGFP-MIPU1后，胞核呈均勻的藍(lán)色熒光，當(dāng)DOX處理24 h后，轉(zhuǎn)染pEGFP的胞核發(fā)生明顯的皺縮，聚集甚至碎裂，細(xì)胞發(fā)生了凋亡，而轉(zhuǎn)染pEGFP-MIPU1細(xì)胞核的凋亡明顯減少(圖2)。

A.pEGFP; B.MIPU1; C.pEGFP+DOX; D.MIPU1+DOX; *Plt;0.01 compared with pEGFP; #Plt;0.05 compared with pEGFP+DOX圖2 Hoechst33258染核檢測(cè)過表達(dá)MIPU1對(duì)DOX所致HEK293細(xì)胞凋亡的影響Fig 2 Hoechst 33258 staining showed the percentageof apoptosis cells(×200,n=3)

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MIPU1過表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響

pEGFP+DOX組的細(xì)胞凋亡率較pEGFP組顯著增多；轉(zhuǎn)染MIPU1后細(xì)胞凋亡率明顯下降(圖3)。

apoptosis: R3+R5; *Plt;0.01 compared with pEGFP; #Plt;0.01 compared with pEGFP+DOX圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)過表達(dá)MIPU1對(duì)DOX所致HEK293細(xì)胞凋亡的影響Fig 3 Effects of MIPU1 overexpression on DOX-induced HEK293 cells apoptosis by flowcytometry(n=3)

2.4過表達(dá)MIPU1對(duì)DOX所致P53的mRNA表達(dá)的影響

與pEGFP組相比，pEGFP+DOX組P53的mRNA表達(dá)增多；與pEGFP+DOX組相比，pEGFP-MIPU1+DOX組中P53的mRNA表達(dá)受到抑制(圖4)。

圖4 RT-PCR檢測(cè)過表達(dá)MIPU1對(duì)P53mRNA的影響Fig 4 Effect of MIPU1 over-expression on DOX-induced P53 changed levels by RT-PCR

2.5過表達(dá)MIPU1對(duì)DOX所致P53蛋白表達(dá)水平的影響

與pEGFP組相比，pEGFP+DOX組的P53蛋白表達(dá)增多；與pEGFP+DOX組相比，pEGFP-MIPU1+DOX組的P53蛋白表達(dá)受到明顯抑制(圖5)。

*Plt;0.05 compared with pEGFP;#Plt;0.05 compared with pEGFP+DOX圖5 Western blot檢測(cè)過表達(dá)MIPU1對(duì)P53蛋白表達(dá)的影響Fig 5 Effect of MIPU1 over-expression on DOX-induced P53 changed levels by Westernblot(n=3)

2.6過表達(dá)MIPU1對(duì)DOX所致Bax在mRNA水平上表達(dá)的變化

與pEGFP組相比， pEGFP+DOX組中Bax的mRNA表達(dá)明顯升高，當(dāng)過表達(dá)MIPU1后Bax的mRNA表達(dá)明顯受到抑制(圖6)。

*Plt;0.05 compared with pEGFP；#Plt;0.05 compared with pEGFP+DOX圖6 RT-PCR檢測(cè) MIPU1轉(zhuǎn)入HEK293細(xì)胞后觀察Bax的mRNA水平變化Fig 6 The effect of MIPU1 over-expression on BaxmRNA and by RT-PCR(n=3)

2.7Westernblot檢測(cè)過表達(dá)MIPU1對(duì)DOX所致Bax在蛋白水平上的表達(dá)變化

與pEGFP組相比，pEGFP+DOX組的Bax蛋白表達(dá)升高；而轉(zhuǎn)入MIPU1后Bax蛋白表達(dá)受到明顯抑制(圖7)。

*Plt;0.05 compared with pEGFP；**Plt;0.01 compared with pEGFP+DOX圖7 Western blot 檢測(cè)MIPU1過表達(dá)對(duì)Bax蛋白變化的影響Fig 7 The effect of MIPU1 over-expression on Baxprotein by Western blot(n=3)

2.8過表達(dá)MIPU1對(duì)DOX所致Bcl-2在mRNA水平上的影響

與pEGFP組相比，pEGFP+DOX組的Bcl- 2的mRNA表達(dá)略有減少，但是轉(zhuǎn)入MIPU1后即pEGFP-MIPU1+DOX組Bcl- 2的mRNA表達(dá)則明顯增多(圖8)。

*Plt;0.05 compared with pEGFP；#Plt;0.05 compared with pEGFP+DOX圖8 RT-PCR檢測(cè)過表達(dá)MIPU1對(duì)Bcl- 2mRNA的影響Fig 8 The effect of MIPU1 over-expression on Bcl- 2mRNA by RT-PCR(n=3)

2.9過表達(dá)MIPU1在蛋白水平上對(duì)Bcl-2表達(dá)的影響

與pEGFP組相比，pEGFP+DOX組的Bcl- 2蛋白表達(dá)明顯受到抑制；與pEGFP+DOX組相比，pEGFP-MIPU1+DOX組的Bcl- 2蛋白表達(dá)增多(圖9)。

#Plt;0.05 compared with pEGFP；*Plt;0.05 compared with pEGFP+DOX圖9 Western blot檢測(cè)過表達(dá)MIPU1對(duì)Bcl- 2蛋白表達(dá)變化的影響Fig 9 The effect of MIPU1 over-expression on Bcl- 2protein by Western blot(n=3)

3 討論

DOX進(jìn)入體內(nèi)后能代謝為半醌類化合物，與核酸結(jié)合而導(dǎo)致DNA等發(fā)生損傷，從而起到殺傷腫瘤細(xì)胞的做用[3]。在整體動(dòng)物水平上的阿霉素腎病模型中發(fā)現(xiàn)，DOX導(dǎo)致的腎臟毒性中細(xì)胞凋亡占了很大一部分的比例。凋亡是細(xì)胞的一種程序性死亡方式，對(duì)于自身的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、發(fā)展和抵御病原微生物具有重要的作用[8]。Bcl- 2蛋白家族在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用，這一家族根據(jù)功能的不同分成兩大類：1)促進(jìn)細(xì)胞凋亡的蛋白，包括Bax、Bak、Bid、Diva、Bim[9]、Bok和Bcl- XS[10]等。2)抗細(xì)胞凋亡的蛋白,包括Bcl- 2[11]、Bcl- XL、Bcl- W和Mcl- 1等。這兩種蛋白的平衡被打破則參與到多種疾病的發(fā)病機(jī)制中。 P53的抑癌作用很強(qiáng)，當(dāng)小鼠敲除P53基因后，發(fā)生癌癥的概率達(dá)到百分之百[12]。DOX導(dǎo)致的氧化應(yīng)激能激活細(xì)胞凋亡信號(hào)通路而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡[13- 14]。

大鼠Mipu1是一個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制因子，具有抗H2O2和TNF-α所致的細(xì)胞損傷的作用，其機(jī)制與抑制某些促凋亡基因的表達(dá)有關(guān)。人的MIPU1和大鼠的同源性很高，高達(dá)76%，但MIPU1是否在DOX所致的細(xì)胞損傷中也具有抗凋亡作用尚不清楚。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DOX能誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞發(fā)生凋亡，當(dāng)過表達(dá)MIPU1后，細(xì)胞的存活率明顯升高，凋亡率下降。進(jìn)一步探討其可能的分子機(jī)制發(fā)現(xiàn)， MIPU1能阻止DOX引起的Bcl- 2的下調(diào)，同時(shí)也能抑制DOX誘導(dǎo)的Bax的上調(diào)，使得Bax/Bcl- 2下降。因此MIPU1抗凋亡與促進(jìn)Bax/Bcl- 2的下調(diào)有關(guān)。另外發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)MIPU1還能抑制DOX處理下的P53在mRNA水平和蛋白水平上的表達(dá)，說明MIPU1在DOX誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡模型中發(fā)揮抗凋亡作用的途徑不是單一的，而是多方面的，這為探究MIPU1的抗凋亡作用提供了新的理論依據(jù)。

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Overexpression of MIPU1 reducesdoxorubicin-induced apoptosis in human embryonic kidney 293 cells

SHI Chun-li1, JIANG Lei2, XIAO Xian-zhong2*

(1.Dept. of Clinical Laboratory, Hunan Maternal and Child Health Hospital;2.Dept. of Pathophysiology, Xiangya School of Medicine, Central South University, Changsha 410008, China)

ObjectiveTo explore the affection of overexpression MIPU1 on DOX-mediated apoptosis and the mechanisms, so to provide novel insight into the biological functions of Mipu1, and a new clue for preventing the side-effects of DOX during anticancer implication.MethodsApoptosis was induced by Doxorubicin in this experiment. The eukaryotic expression plasmid pEGFP-MIPU1 was constructed previously and delivered into the cells to increase the expression of MIPU1. Firstly, MTT assay was used to estimate the cells viability. Then apoptosis was assessed by Hoechst staining and flow cytometry (FCM). Thirdly, Western blot and RT-PCR were performed to detect the expression of Bax, P53 and Bcl- 2 at the mRNA and protein levels respectively.ResultsAfter transfected with pEGFP-MIPU1, the overexpression of MIPU1 significantly attenuated the mortality rate induced by DOX (Plt;0.05vspEGFP+DOX), and markedly decreased the cellular apoptosis treated with DOX (Plt;0.01vspEGFP+DOX); The overexpression MIPU1 inhibited the increase of P53 and Bax induced by DOX (Plt;0.05vspEGFP+DOX), while reversed the decrease of Bcl- 2 expression in DOX-induced HEK293 cells (Plt;0.05vspEGFP+DOX).ConclusionsOverexpression MIPU1 inhibites apoptosis in HEK293 cells

induced by DOX, and MIPU1 may decrease the expression of P53 and Bax, and promote the expression of Bcl- 2 in DOX-induced HEK293 cells.

apoptosis; Doxorubicin; MIPU1; Bax; Bcl- 2

2014- 03- 06

2014- 05- 27

國(guó)家自然科學(xué)基金(30971205)；國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(2007CB512007)

*通信作者(correspondingauthor)：xiaoxianzhong@csu.edu.cn

1001-6325(2014)10-1352-06

R 363

A