申起飛，張明生* ，李立青，劉貴賢

(1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院貴州 貴陽(yáng) 550025;2.貴州大學(xué)山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025)

半夏［Pinellia ternata(Thunb.)Breit.］屬天南星科多年生草本植物，是我國(guó)主要天然藥材之一，也是重要的出口產(chǎn)品［1］，在196個(gè)中藥處方中出現(xiàn)頻率居于第22位，應(yīng)用十分廣泛［2］。隨著半夏用量增加［3］，單靠采挖野生資源已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足其市場(chǎng)需求，故半夏人工種植面積在逐年擴(kuò)大。而人工種植中長(zhǎng)期使用無(wú)性繁殖，種莖用量大、成本高，且導(dǎo)致病毒積累、種質(zhì)退化，致使其產(chǎn)量品質(zhì)降低［4-8］。采用組織培養(yǎng)技術(shù)可以達(dá)到脫毒并擴(kuò)大種苗的目的，但試管苗運(yùn)輸和貯藏較為困難，加之半夏田間生產(chǎn)實(shí)行高密度種植，試管苗移栽和栽后管理工作量極大，因而通過(guò)組織培養(yǎng)生產(chǎn)試管苗的方法在半夏藥材規(guī)?；斯しN植中幾乎沒(méi)有推廣應(yīng)用的價(jià)值［4-5］。

表1 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基組合Tab.1 The medium combination of callus induction

人工種子技術(shù)在良種快繁、固定雜種優(yōu)勢(shì)、簡(jiǎn)化育種程序以及與基因工程、種苗脫毒等技術(shù)有機(jī)結(jié)合方面有著廣泛的應(yīng)用前景而得到迅速發(fā)展。由于人工種胚是人工種子的核心部分，因此研究人工種胚生產(chǎn)的有效方法就成為構(gòu)建人工種子技術(shù)的關(guān)鍵。本試驗(yàn)通過(guò)研究6-BA、2，4-D、α-NAA、IBA、KT(激動(dòng)素)對(duì)半夏人工種胚誘導(dǎo)和增殖的影響，以期為建立半夏人工種子規(guī)?；a(chǎn)技術(shù)提供適宜的培養(yǎng)基配方。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料半夏Pinellia ternata(Thunb.)Breit.由貴州赫章半夏藥材基地提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 半夏葉片愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選 將充分消毒后的半夏葉片切成1 cm2的小塊，接種于MS基本培養(yǎng)基分別與6-BA、2，4-D、NAA組合的培養(yǎng)基(表1)上，于25±1℃、12 h/d光照條件下進(jìn)行初代培養(yǎng)。30 d后觀察統(tǒng)計(jì)愈傷組織顏色、質(zhì)地、出愈率和生長(zhǎng)勢(shì)等指標(biāo)，以篩選誘導(dǎo)葉片愈傷組織的適宜培養(yǎng)基(以葉片脫分化產(chǎn)生大量薄壁細(xì)胞為標(biāo)準(zhǔn)，出愈率%=產(chǎn)生愈傷組織葉片數(shù)/接種葉片總數(shù)×100%)。同時(shí)，選用長(zhǎng)勢(shì)良好的愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)。

1.2.2 半夏人工種胚誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)基篩選 以愈傷組織適宜培養(yǎng)基誘導(dǎo)出的半夏愈傷組織為材料，分別接種在 MS與不同濃度 KT、6-BA、2，4-D、NAA及IBA分別組合的培養(yǎng)基上進(jìn)行生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)半夏人工種胚(小塊莖)的單因子實(shí)驗(yàn)，以此為基礎(chǔ)再進(jìn)行不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)組合試驗(yàn)，(以淡黃疏松愈傷組織表面產(chǎn)生致密的球形小塊莖結(jié)構(gòu)為標(biāo)準(zhǔn))，判定人工種胚誘導(dǎo)和增殖的效果，選擇適宜培養(yǎng)基。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)組合對(duì)半夏葉片愈傷組織的誘導(dǎo)效果

圖1 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)半夏葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響Fig.1 Effects of plant growth regulators on the leaf callus induction from Pinellia ternata

生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的不同組合對(duì)半夏葉片愈傷組織的誘導(dǎo)效果差異較大(表2和圖1)。接種后的第5 d，培養(yǎng)基添加6-BA和2，4-D的葉片切口處開(kāi)始出現(xiàn)愈傷細(xì)胞，中部葉脈開(kāi)始向上凸起，顏色由綠色逐漸轉(zhuǎn)為黃色;接種后第10 d，2號(hào)和3號(hào)培養(yǎng)基中首先出現(xiàn)愈傷組織，15 d后所有培養(yǎng)基上的葉片均出現(xiàn)愈傷組織。保持6-BA濃度(1.0 mg/L)不變，隨著2，4-D濃度升高，葉片愈傷組織誘導(dǎo)率有不同的變化，2，4-D濃度為1.0 mg/L時(shí)葉片產(chǎn)生大量灰白色疏松愈傷組織;2，4-D濃度為2.0 mg/L時(shí)，葉片愈傷組織產(chǎn)生量較多，質(zhì)地疏松，顏色淡黃，由薄壁細(xì)胞組成(圖1-A和1-G);2，4-D濃度達(dá)到3.0 mg/L時(shí)，葉片愈傷組織長(zhǎng)勢(shì)較差，質(zhì)地較致密，顏色呈黃色。6-BA濃度為0.5 mg/L的效果不如1.0 mg/L的好，如6號(hào)培養(yǎng)基僅在葉片切口周?chē)a(chǎn)生致密型愈傷組織(圖1-B)。因此，2 號(hào)培養(yǎng)基(MS+6-BA 1.0 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L)最適于半夏葉片愈傷組織的誘導(dǎo)和增殖。

表2 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)組合對(duì)半夏葉片愈傷組織誘導(dǎo)的效果Tab.2 Effects of plant growth regulator combination on the leaf callus induction from Pinellia ternata

保持6-BA濃度為1.0 mg/L，7號(hào)培養(yǎng)基(NAA 0.1 mg/L)僅在葉片切口處產(chǎn)生少量較疏松的愈傷組織，且愈傷組織可直接分化出芽(圖1-C);隨著NAA濃度升高，葉片愈傷組織逐漸增加;9號(hào)培養(yǎng)基上葉片愈傷組織質(zhì)地較致密，同時(shí)部分分化出綠色小塊莖并出芽長(zhǎng)出小葉片(圖1-D)，經(jīng)形態(tài)解剖和顯微觀察發(fā)現(xiàn)其愈傷組織表面明顯分化，產(chǎn)生頂端分生組織和葉原基(圖1-H)。當(dāng)6-BA濃度為0.5 mg/L時(shí)，3種濃度NAA下葉片切口處均產(chǎn)生黃色致密的愈傷組織，但均無(wú)小塊莖分化;隨著NAA濃度升高，愈傷組織表面產(chǎn)生大量毛狀根(圖1-E、1-F和1-I)。上述結(jié)果表明，6-BA與NAA組合不利于半夏葉片愈傷組織的誘導(dǎo)。

2.2 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)半夏人工種胚誘導(dǎo)和增殖的影響

不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)半夏人工種胚誘導(dǎo)和增殖的作用效果有較大差異。KT不利于半夏葉片愈傷組織向人工種胚分化，而是促進(jìn)愈傷組織分化出毛狀根(圖2-A和2-B);6-BA有利于愈傷組織分化形成人工種胚，濃度為0.5 mg/L時(shí)可誘導(dǎo)葉片愈傷組織表面產(chǎn)生大量的小塊莖(人工種胚)，6-BA增加到1.0～2.0 mg/L時(shí)，葉片愈傷組織顏色變綠且質(zhì)地變致密，人工種胚數(shù)量減少而體積變大(圖2-C);2，4-D對(duì)葉片愈傷組織的誘導(dǎo)和增殖效果較好(圖2-D)，卻強(qiáng)烈抑制愈傷組織分化產(chǎn)生人工種胚;1.0 mg/L的NAA對(duì)半夏人工種胚的誘導(dǎo)和增殖效果顯著(圖2-E)，隨著NAA濃度的增加，其效果則越來(lái)越差(圖2-F);2.0 mg/L的IBA有利于人工種胚的誘導(dǎo)和增殖(圖2-G)。石蠟切片顯微觀察發(fā)現(xiàn)，與愈傷組織相比，人工種胚細(xì)胞相對(duì)較小，細(xì)胞質(zhì)濃，與其周?chē)鷤M織之間有明顯的分界線(圖2-H)，確定愈傷誘導(dǎo)產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)為人工種胚。

圖2 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)半夏人工種胚的作用效果Fig.2 Effects of plant growth regulators on artificial embryogenesis

保持6-BA 1.0 mg/L不變，添加一定濃度的IBA或NAA有利于半夏葉片愈傷組織分化形成人工種胚。當(dāng)添加1.0 mg/L的IBA時(shí)，淡黃色愈傷組織開(kāi)始產(chǎn)生綠色人工種胚(圖2-I)，IBA濃度增加到2.0 mg/L時(shí)，人工種胚數(shù)量增多，體積增大(圖2-J);添加1.0 mg/L或2.0 mg/L的NAA，20 d后葉片愈傷組織分化形成人工種胚，以2.0 mg/L的NAA產(chǎn)生人工種胚數(shù)量多而密集(圖2-K)，繼續(xù)提高NAA濃度(3.0 mg/L)時(shí)人工種胚的誘導(dǎo)和增殖均降低，體積較大(圖2-L)。結(jié)果顯示:培養(yǎng)基組成為MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 2.0 mg/L或MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 2.0 mg/L時(shí)，最適宜于半夏人工種胚的誘導(dǎo)和增殖，顯微切片觀察到人工種胚中有芽和根的分化(圖2-M和2-N)也證實(shí)了這一點(diǎn)。

3 討論

獲得大量生長(zhǎng)快速、結(jié)構(gòu)疏松的愈傷組織是誘導(dǎo)人工種胚和制作人工種子的前提條件，但誘導(dǎo)形成愈傷組織的難易程度因不同植物組織器官自身分化程度不同而異［9］。本試驗(yàn)以半夏葉片為外植體材料，發(fā)現(xiàn)葉片基部主葉脈部位比較容易誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，葉片中葉脈較少部位誘導(dǎo)愈傷組織的效果較差，這與何奕昆等的研究結(jié)果相似［10-12］，原因可能是植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的運(yùn)輸依靠維管系統(tǒng)，維管組織集中的葉片區(qū)域生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)濃度較高，易于誘導(dǎo)細(xì)胞脫分化產(chǎn)生愈傷組織。不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)半夏愈傷組織和小塊莖(人工種胚)的誘導(dǎo)差異較大［13-15］，本研究發(fā)現(xiàn)，以半夏葉片為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)和增殖有較大作用的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)主要有6-BA和2，4-D，最適培養(yǎng)基配方為 MS+2，4-D 2.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L，誘導(dǎo)可淡黃疏松的愈傷組織，可用于進(jìn)一步培養(yǎng)誘導(dǎo)人工種胚產(chǎn)生。

本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加6-BA、NAA、IBA 3種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)有利于半夏人工種胚的誘導(dǎo)，愈傷組織表面會(huì)分化出大量人工種胚。2，4-D在愈傷組織分化產(chǎn)生人工種胚階段具有抑制作用，KT則促進(jìn)愈傷組織表面直接分化產(chǎn)生不定根，不利于人工種胚的誘導(dǎo)和增殖?？晒┙窈笠后w懸浮培養(yǎng)誘導(dǎo)人工種胚和人工種子規(guī)模化生產(chǎn)借鑒采用。

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