鐘娜 劉巧 喬鳳 鄭文愛 王芳乾 王黎明 吳碧玉 范和發(fā)

2011—2012年海南省淋球菌耐藥性監(jiān)測及基因分型

鐘娜 劉巧 喬鳳 鄭文愛 王芳乾 王黎明 吳碧玉 范和發(fā)

目的探討海南淋球菌耐藥狀態(tài)及耐藥基因分型情況。方法用瓊脂稀釋法測定4種抗生素的最低抑菌濃度(MIC),PCR方法鑒定四環(huán)素高度耐藥菌株(TRNG)并進(jìn)行TetM基因分型;用紙片酸度法測定β內(nèi)酰胺酶(PPNG),PCR方法鑒定β內(nèi)酰胺酶質(zhì)粒并進(jìn)行TEM-1基因分型。結(jié)果2011—2012年共檢測214株淋球菌,環(huán)丙沙星中度敏感率7.94%(17/214),耐藥率為92.06%(197/214);頭孢曲松敏感率24.30%(52/214),中度敏感率為75.70%(162/214);未發(fā)現(xiàn)耐大觀霉素的菌株。多重耐藥情況：對四環(huán)素和青霉素耐藥的菌株39株(18.22%),對青霉素和環(huán)丙沙星耐藥菌株66株(30.84%),對四環(huán)素和環(huán)丙沙星耐藥的菌株91株(42.52%),對四環(huán)素、青霉素和環(huán)丙沙星耐藥的菌株37株(17.29%)。檢出TRNG 101株(47.20%),TetM基因分型結(jié)果99株(98.02%)荷蘭型,2株(1.98%)美國型。檢出PPNG 65株(30.37%),TEM-1基因分型結(jié)果55株(84.62%)亞州型,10株(15.38%)非州型,未見多倫多型、里約型。結(jié)論海南省淋球菌對大觀霉素敏感率高,應(yīng)作為治療淋病的首選藥物;多重耐藥菌株應(yīng)引起重視。PPNG以亞州型為主,非州型次之;TRNG以荷蘭型為主,偶見美國型。

奈瑟球菌,淋病;抗藥性;基因,TetM;基因,TEM-1;基因型

為了解海南省淋球菌耐藥流行狀態(tài)及耐藥基因分型情況,2011—2012年我們收集全省7個市縣皮膚病防治所的菌株共214株,用4種抗生素進(jìn)行耐藥檢測及TetM基因,TEM-1基因分型,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

資料和方法

一、材料

1.菌株來源：2011年1月至2012年10月,從海南省皮膚性病防治中心、三亞市慢性病防治中心、瓊海市皮膚性病防治中心、陵水縣皮膚性病防治所、澄邁縣皮膚性病防治所等單位性病門診患者泌尿生殖道中分離到的214株淋球菌。男性標(biāo)本取自尿道口內(nèi)3～4 cm處,女性標(biāo)本取宮頸口內(nèi)1～2 cm處,接種于選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng),所有菌株經(jīng)培養(yǎng)24～48 h經(jīng)革蘭染色、氧化酶和糖發(fā)酵試驗(yàn)確證后洗于脫脂牛奶-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.抗菌藥物：四環(huán)素、環(huán)丙沙星、頭孢曲松、大觀霉素藥粉由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所、中國疾病預(yù)防控制中心性病中心性病參比實(shí)驗(yàn)室提供。

3.培養(yǎng)基：GC基礎(chǔ)培養(yǎng)基(英國Oxoid公司生產(chǎn))加入10%脫纖維新鮮羊血。

4.標(biāo)準(zhǔn)菌株：世界衛(wèi)生組織(WHO)G、J、L 共 3 株淋球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所、中國疾病預(yù)防控制中心性病中心性病參比實(shí)驗(yàn)室提供。

5.試劑及儀器：Taq DNA 聚合酶、dNTP、DNA相對分子量標(biāo)記物(DL1000)等PCR試劑,均購自寶生物工程(大連)有限公司;PCR引物由上海Invitrogen生物工程公司合成。PCR儀(Veriti)為美國ABI公司產(chǎn)品,電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)(ChemiDOC XRS+)均為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

二、方法

1.菌株收集：海南省皮膚性病防治中心每年定期給協(xié)作單位發(fā)放收集菌株的脫脂牛奶和T-M培養(yǎng)基,合作單位2個月內(nèi)將收集的菌種送達(dá)海南省皮膚性病防治中心,將菌株存放在-80℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.最小抑菌濃度(MIC)測定：用瓊脂稀釋法。培養(yǎng)基中抗菌藥物質(zhì)量濃度范圍為：環(huán)丙沙星(0.002～16 mg/L)、頭孢曲松(0.002～2 mg/L)、大觀霉素(2～64 mg/L);四環(huán)素(8～16 mg/L),檢測質(zhì)粒介導(dǎo)的高度耐四環(huán)素淋球菌(TRNG)。每批試驗(yàn)用已知MIC值的WHO標(biāo)準(zhǔn)株參照菌株進(jìn)行質(zhì)量控制。

3.藥敏試驗(yàn)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：以WHO西太區(qū)淋球菌耐藥監(jiān)測項(xiàng)目推薦的標(biāo)準(zhǔn)[1]判定結(jié)果,頭孢曲松MIC≤0.03 mg/L為敏感,0.06～0.50 mg/L為中度敏感,≥1 mg/L為耐藥;大觀霉素MIC≤64 mg/L為敏感,≥128 mg/L為耐藥;環(huán)丙沙星MIC≤0.03 mg/L為敏感,0.06～0.50 mg/L為中度敏感,≥1 mg/L為耐藥;四環(huán)素MIC≥16 mg/L為TRNG。

4.β內(nèi)酰胺酶測定：用紙片酸度法測定菌株的β內(nèi)酰胺酶,濾紙吸足其溶液后用接種環(huán)取10～20個菌落涂到濾紙上,涂抹直徑5 mm。產(chǎn)青霉素酶淋球菌(PPNG)菌株使濾紙顏色由紫變黃色。每次試驗(yàn)均以WHO J株作為陽性對照,L株作為陰性對照。

5.PCR模板DNA的提?。喝C培養(yǎng)基上純培養(yǎng)18 h的淋球菌菌落,用100 μl去離子水制備成菌懸液,濃度相當(dāng)于1個麥?zhǔn)蠁挝?將菌懸液置于95℃干式恒溫儀15 min,冷卻后12 000×g低溫(4℃)離心10 min,上清液即為PCR用模板DNA;分離上清液,保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

6.PPNG的TEM-1基因分型：用Palmer等[2]使用的引物和方法測定淋球菌TEM-1基因。引物有 4 條,包括 BL1：5′-TACTCAATCGGTAATTGGC T-3′,BL2：5′-CACCTATAAATCTCGCAAGC-3′,BL3：5′-CCATAGTGTTGAGTATTGCGAA-3′,BL4：5′-TCATTCGTGCGTTCTAGGA-3′。反應(yīng)總體系 25 μl,其中主要包括Taq酶0.625U,dNTP各0.2mmol/L,MgCl21.5 mmol/L,引物各 0.4 μmol/L,模板 5 μl。PCR 反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min;94℃變性15 s,64℃退火15 s,72℃延伸1 min,共30個循環(huán);最后72℃延伸7 min。每批試驗(yàn)設(shè)陰性和陽性對照,擴(kuò)增產(chǎn)物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳,用凝膠成像系統(tǒng)觀察并照相。

7.TRNG的tetM基因分型：用Turner[3]方法測定tetM基因型。引物有3條,包括1條通用正向引物(UF)：5′-CTCGAACAAGAGGAAAGC-3′,兩條反向引物分別為美國型(AR 778 bp)：5′-GCATTCCAC TTCCCAAC-3′和荷蘭型(DR 443 bp)：5′-TGCAGC AGAGGGAGG-3′。反應(yīng)總體系25 μl,包括Taq酶(5 U)0.125 μl,dNTP(2.5 μmol)2 μl,10 × PCR 緩沖液 2.5 μl,引物(10 μmol/L)各 0.5 μl,DNA 模板2 μl。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃,3 min;變性94℃,20 s;退火55℃,1 min;延伸72℃,90 s;30個循環(huán);最后延伸72℃,7 min結(jié)束。每批試驗(yàn)作陰性和陽性對照。擴(kuò)增產(chǎn)物以0.8%瓊脂糖凝膠電泳,用紫外分析儀觀察結(jié)果,最后用Bio-print凝膠成像系統(tǒng)觀察并照相。

8.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：計(jì)數(shù)資料用SPSS15.0軟件作χ2檢驗(yàn)。

結(jié) 果

1.質(zhì)粒介導(dǎo)的淋球菌耐藥性：對214株淋球菌進(jìn)行檢測,產(chǎn)青霉素酶淋球菌(PPNG)陽性65株(30.37%),TRNG 101株(47.20%)。2011年P(guān)PNG陽性率為28.71%(29/101),2012年P(guān)PNG陽性率為31.86%(36/113),兩年間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.25,P＞0.05)。2011年TRNG陽性率為53.47%,2012年TRNG陽性率為41.59%,兩年間TRNG的陽性率有所下降,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.02,P＞0.05);見表1。

2.染色體介導(dǎo)的淋球菌耐藥性：2011—2012年,染色體介導(dǎo)的耐藥性(環(huán)丙沙星、頭孢曲松和大觀霉素)淋球菌比例及抗菌藥物耐藥情況：環(huán)丙沙星的耐藥率從2011年的98.02%下降到2012年的86.73%,兩年間耐藥率明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.30,P＜0.01);頭孢曲松的中度敏感率從2011年82.18%下降到2012年的69.91%,兩年間中度敏感率有所下降。未發(fā)現(xiàn)耐大觀霉素的菌株,見表2。

3.多重耐藥情況：2011—2012年,兩重耐藥(青霉素和四環(huán)素)耐藥率從21.78%下降到15.04%,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.62,P＞0.05);兩重耐藥(四環(huán)素和環(huán)丙沙星)耐藥率從53.47%下降到32.74%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.37,P＜0.01),青霉素和環(huán)丙沙星耐藥率無顯著改變;三重耐藥率(青霉素、四環(huán)素和環(huán)丙沙星)明顯下降,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.70,P＞0.05);雖然多重耐藥率有所下降,但在治療淋病時也要考慮青霉素類、四環(huán)素類和喹諾酮類的交叉耐藥情況,應(yīng)避免使用。見表3。

表1 2011—2012年海南省214株淋球菌質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥性[例(%)]

表2 2011—2012年海南省214株淋球菌染色體介導(dǎo)的耐藥性[例(%)]

表3 2011—2012年海南省214株淋球菌多重耐藥情況[例(%)]

4.TEM-1基因質(zhì)粒分型檢測：對收集的65株P(guān)PNG進(jìn)行TEM-1基因質(zhì)粒分型,檢測出10株攜帶非洲型質(zhì)粒,占15.38%;55株攜帶亞洲型質(zhì)粒,占84.62%;未見多倫多型和里約型質(zhì)粒。2011年P(guān)PNG陽性29株,其中非洲型質(zhì)粒3株,占10.34%;亞洲型質(zhì)粒26株,占89.66%。2012年P(guān)PNG陽性36株,其中非洲型質(zhì)粒7株,占19.44%;亞洲型質(zhì)粒29株,占80.56%,攜帶非洲型質(zhì)粒的菌株明顯增多。見圖1。

5.TRNG tetM基因分型：101株TRNG進(jìn)行tetM基因PCR擴(kuò)增,所有菌株均擴(kuò)增出產(chǎn)物,與DNA分子量標(biāo)記物作比較,其中99株(98.02%)擴(kuò)增出443 bp產(chǎn)物,即為荷蘭型;2株(1.98%)擴(kuò)增出778 bp產(chǎn)物,即為美國型(圖2)。

圖1 產(chǎn)青霉素酶淋球菌TEM-1-β內(nèi)酰胺酶擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析 M：標(biāo)準(zhǔn)參照物;1：標(biāo)準(zhǔn)菌株WHO J株;3～4：含非洲型質(zhì)粒產(chǎn)青霉素酶淋球菌臨床分離株;2,5,6：含亞洲型質(zhì)粒產(chǎn)青霉素酶淋球菌臨床分離株;7：陰性對照

圖2 高度耐四環(huán)素淋球菌tetM基因擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析 M：標(biāo)準(zhǔn)參照物;1～6,8～9：高度耐四環(huán)素淋球菌臨床分離株;7：WHO G株

討 論

近兩年共檢測214株淋球菌,染色體耐藥的淋球菌對環(huán)丙沙星的耐藥性由2011年的98.02%下降到2012年的86.73%,總陽性率為92.06%,;與國內(nèi)其他一些地區(qū)如廣州[4]、南京[5]等報(bào)告的對環(huán)丙沙星的耐藥率也均大于90%相近。頭孢曲松的中度敏感率從2011年的82.18%下降到2012年的69.91%,顯著高于韓燕等[6]報(bào)道的47.42%。未檢出耐大觀霉素的淋球菌。本研究說明,海南省不能用環(huán)丙沙星治療淋病,頭孢曲松中度敏感率較高,臨床使用其治療淋病時應(yīng)觀察其療效,避免不規(guī)則用藥;大觀霉素可作為治療淋病的首選藥物,但也要持續(xù)監(jiān)測其耐藥性。多重耐藥(對青霉素和四環(huán)素、四環(huán)素和環(huán)丙沙星、青霉素、四環(huán)素和環(huán)丙沙星耐藥)耐藥率兩年間有所下降,對青霉素和環(huán)丙沙星耐藥率無顯著改變,比韓燕等[6]、朱邦勇等[7]報(bào)道的多重耐藥率均低,但淋球菌多重耐藥情況也應(yīng)引起臨床重視。

質(zhì)粒耐藥的淋球菌2011—2012年P(guān)PNG總陽性率為30.37%,與韓燕等[6]報(bào)道2008年中國淋球菌耐藥株P(guān)PNG陽性率34.91%相似。我們2011年從29株P(guān)PNG中檢測出3株(10.34%)含非洲型質(zhì)粒,26株(89.66%)含亞州質(zhì)粒;2012年從36株P(guān)PNG中檢測出7株(19.44%)含非洲型質(zhì)粒,29株(80.56%)含亞州型質(zhì)粒。共檢出含非洲型質(zhì)粒10株總陽性率為15.38%,明顯高于吳興中等[8]報(bào)道的廣州地區(qū)2000—2008年分離的230株P(guān)PNG進(jìn)行TEM-1基因質(zhì)粒分型,229株攜帶亞洲型質(zhì)粒,只在2008年檢測出1株含非洲型質(zhì)粒(χ2=27.52,P＜0.01)。表明海南省淋球菌PPNG流行株非州型高于廣州地區(qū)。因本地區(qū)臨床治療淋病基本不使用青霉素及近年國內(nèi)也未見青霉素耐藥檢測的報(bào)道,所以本研究未做青霉素耐藥檢測,

淋球菌對四環(huán)素的高度耐藥是由tetM基因介導(dǎo),tetM基因可分為美國型和荷蘭型2種變型。我們對101株TRNG進(jìn)行tetM基因檢測,結(jié)果99株(98.02%)為荷蘭型,2株(1.98%)為美國型。表明海南省近年流行的TRNG菌株以荷蘭型tetM基因?yàn)橹?偶發(fā)美國型,與南京[9](98.82%)的報(bào)道相似。海南省首次分離出TRNG美國型tetM基因和PPNG非洲型質(zhì)粒,且1株同時攜帶美國型tetM基因和PPNG非洲型質(zhì)粒,為雙重耐藥質(zhì)粒。TRNG tetM基因美國型可能來源于非洲大陸近赤道地區(qū),國際旅行使兩種基因型傳播到其他地區(qū)。表明本地區(qū)有TRNG tetM基因美國型和PPNG TEM-1非洲型流行,繼續(xù)對PPNG、四環(huán)素進(jìn)行耐藥監(jiān)測和分子流行病學(xué)研究,了解當(dāng)?shù)豍PNG、TRNG流行株的基因型,及時給政府有關(guān)部門提供科學(xué)防治依據(jù)很有必要。

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2013-07-05)

(本文編輯：吳曉初)

Antibiotic resistance surveillance in and genotyping ofNeisseria gonorrhoeaeisolates from Hainan province during 2011-2012

Zhong Na*，Liu Qiao，Qiao Feng，Zheng Wenai，Wang Fangqian，Wang Liming，Wu Biyu，

Fan Hefa.*Hainan Provincial Center for Skin Disease and STD Control，Haikou 570206，China

Liu Qiao，Email:drliuqiao@163.com

ObjectiveTo evaluate the antibiotic resistance inNeisseria gonorrhoeae(NG)isolates from Hainan province，and to assess their genotypes according to antibiotic resistance-associated genes.MethodsTotally，214 NG strains isolated from Hainan province during 2011-2012 were included in this study.An agar dilution method was used to determine the minimum inhibitory concentrations(MICs)of ciprofloxacin，ceftriaxone，spectinomycin and tetracycline in these strains.The production of β-lactamase was tested by a paper acidometric method.PCR was performed to amplify the tetM gene in TRNG strains and TEM-1 gene in penicillinase-producing NG(PPNG)strains for their genotyping.ResultsAmong these NG strains，7.94%(17/214)were moderately sensitive to ciprofloxacin with a resistance rate of 92.06%(197/214)，24.30%(52/214)were sensitive to ceftriaxone with a moderate sensitivity rate of 75.70%(162/214)，and none was resistant to spectinomycin.Additionally，39 isolates(18.22%)were concurrently resistant to both tetracycline and penicillin，66 isolates(30.84%)to penicillin and ciprofloxacin，91 isolates(42.52.%)to tetracycline and ciprofloxacin，and 37 isolates(17.29%)to tetracycline，penicillin and ciprofloxacin.Totally，101 TRNG strains were identified from all the isolates，of which，99(98.02%)harbored the Dutch variant of the tetM gene，and 2(1.98%)harbored the American variant.There were 65(31.31%)PPNG strains in these isolates，among which，55(84.62%)carried the Asian type plasmids，10(15.38%)carried the Africa type plasmids，and none carried the Toronto or Rio type plasmids.ConclusionsThe NG isolates from Hainan province is highly sensitive to spectinomycin，which should serve as the first treatment choice for gonorrhea.More attention should be paid to multi-drug resistance in NG.In this region，most PPNG strains carry the Asian type plasmids，followed by the Africa type plasmids，and the Dutch variant of the tetM gene is the most common variant among TRNG strains with the American variant as the occasional form.

Neisseria gonorrhoeae;Drug resistance;Genes，TetM;Genes，TEM-1;Genotype

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.05.004

海南省自然科學(xué)基金(811171)

570206海口,海南省皮膚性病防治中心(鐘娜、劉巧、喬鳳、鄭文愛、王芳乾);海南省瓊海市皮膚性病防治中心(王黎明);海南省澄邁縣皮膚性病防治所(吳碧玉);海南省三亞市慢性病防治中心(范和發(fā))

劉巧,Email：drliuqiao@163.com