穿心蓮內酯及其衍生物藥理活性研究

馬長沙,段成軍,馬靜潔

(延邊大學,吉林延吉133000)

穿心蓮內酯(andrographolide,AHL)為爵床科植物穿心蓮干燥地上部分[Andrographis paniculata(Burm.f)Nees]中提取得到的二萜內酯類化合物,是中藥穿心蓮的主要有效成分之一。穿心蓮內酯具有廣泛的藥理活性,具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、治療心腦血管疾病等多種藥理作用。但其水溶性較差,影響其制劑的發(fā)展。對其進行結構改造,增強其活性及水中溶解性,利用Michael加成、羥基上的反應、分子內環(huán)化、分子內酯環(huán)化等反應進行結構修飾得到了穿心蓮內酯衍生物。筆者對穿心蓮內酯及其衍生物的研究進展進行概述,為穿心蓮內酯今后的研究及臨床應用提供依據(jù)。

1 理化性質

穿心蓮內酯(C20H30O5)為萜內酯類化合物,結構式見圖1?；瘜W名:(3E,4S)-3-[2-[(1R,4aS,5R,6R,8aS)-decahydro-6-hydroxy-5-(hydroxymethyl)-5,8a-dimethyl-2-methylene-1-naphthalenyl]ethylidene dihydro-4-hydroxy-2(3H)-furanone。白色方棱形或片狀結晶(乙醇或甲醇),無臭,味苦。穿心蓮內酯在水相中的溶解度非常低,在油相中的溶解度較高,屬于脂溶性很強的藥物,但水中溶解度隨著外界溫度的升高而增大[1]。在沸乙醇中溶解,在甲醇或乙醇中略溶,極微溶于氯仿,在水或乙醚中幾乎不溶。熔點230～231 ℃,(α)17D-126.6 ±2°(C=1.5,冰醋酸),[α]D-112.7(C=0.53,MeOH)。

圖1 結構式

2 提取分離

從穿心蓮莖葉中提取穿心蓮內酯的方法很多,主要有水提法、醇提法、堿水法和酸水法,這些方法同時輔以超聲波,可顯著縮短浸提時間,明顯加快溶出效率,提高內酯的浸出率,保證其穩(wěn)定性。趙玉江等[2]以穿心蓮內酯為考察指標,以HPLC法測定水提法、醇提法和堿水法對穿心蓮內酯濃度及出膏率的影響,結果穿心蓮內酯濃度以醇提法及0.01%堿水提取為佳,濃度分別為4.43%和4.31%,但出膏率 0.01%堿水較高,達24.08%。周一君[3]采用乙醇等溶劑冷浸、熱浸或滲漉等方法提取穿心蓮莖葉中的穿心蓮內酯,回收乙醇,經過一系列處理得到穿心蓮總內酯,將其以三氯甲烷或二氯甲烷冷溶2～4次,過濾,得到濾液與不溶物,濾液可分離得到脫水穿心蓮內酯與去氧穿心蓮內酯純品。不溶物經溶劑分離可得到新穿心蓮內酯及和穿心蓮內酯純品。

吳俊偉等[4]根據(jù)穿心蓮內酯可以同亞硫酸氫鈉起加成反應的原理,設計了酸水法提取穿心蓮內酯的方法,并與乙醇回流法、堿水法、乙醇冷浸法、冷水浸漬法等方法比較,結果顯示此方法與乙醇回流法對穿心蓮內酯的提取效果相同,且好于其他方法。馬芝玉等[5]用正交法對微波和超聲波輔助提取穿心蓮內酯的工藝條件進行對比,篩選出微波和超聲波輔助提取法的最佳工藝,并對2種提取方法進行了比較。結果表明:與超聲波提取法相比,微波提取法提取時間較短,提取率較高。彭夢微等[6]對減壓沸騰法提取穿心蓮內酯的工藝進行研究,得出結論,此方法由于在較低溫度下快速操作完成,抑制了雜質的溶出,且收率較高。并得出了減壓沸騰法提取穿心蓮的最佳工藝:提取劑濃度32%,提取溫度59℃。此條件下穿心蓮的最大收率為0.662%。

3 穿心蓮內酯及其衍生物的藥理作用

穿心蓮內酯及其衍生物除了具有清熱解毒,涼血消腫的功效外,還具有抗菌、抗炎、治療心腦血管疾病、免疫增強、抗腫瘤等多種藥理作用。

3.1 抗菌作用 Wang Zhongli[7]通過用不同的取代側鏈取代穿心蓮內酯的C-14位羥基,發(fā)生縮合反應合成穿心蓮內酯的一系列衍生物。合成的一系列新穿心蓮內酯衍生物都是信號分子AHLs(acyl homoserine lactones)類似物,并且有較強的抗菌活性。細菌通過不同信號分子相互通信,每種細菌產生少量的一種或多種信號分子,并釋放到內壞境中,當達到一定的臨界值時,就會促進細菌群體效應基因的轉錄,這種依靠細胞之間的信號傳遞發(fā)生的群體現(xiàn)象叫做群體效應(QS)。QS控制次生代謝產物,生物發(fā)光,蛋白的分泌,毒力因子的產生,質粒轉移和細菌生物膜的形成。在實驗中以革蘭氏陰性菌銅綠假單胞菌(綠膿桿菌)為例來研究細菌QS和細菌生物膜的形成。實驗證明,其中的一些化合物,如R-(a)-lipoic acid和穿心蓮內酯的結合物,顯著影響銅綠假單胞菌的QS系統(tǒng)并抑制生物膜的形成。實驗得出新化合物的活性比較結果。新化合物的SAR分析發(fā)現(xiàn):1)在天然穿心蓮內酯C-14位引入脂族側鏈(直鏈或環(huán)狀的),可增加其抑制毒力因子產生的活性;2)有些化合物顯著抑制蛋白酶的產生,但是抑制綠膿素產生方面作用較差,表明該化合物通過不同的途徑抑制這兩個毒力因子的產生;3)有些化合物同時有效抑制綠膿素和蛋白酶的產生,這些結果之間的差異有待進一步研究;4)結果表明,無論化合物是否含有二硫鍵,同樣可以有效的抑制綠膿菌素和蛋白酶產生,表明二硫鍵在發(fā)揮抗菌活性方面的作用并不顯著。而且有些化合物除了具有抗菌和抗病毒活性外,在體外和實驗動物模型中還表現(xiàn)出顯著的抗糖尿病活性。這些結果表明,二硫鍵在抗糖尿病方面起著至關重要的作用。并且AL-1的抗菌和抗糖尿病的機制是不同的。Uthaiwan Sirion[8]發(fā)現(xiàn)在穿心蓮內酯C-19位置上用乙酰基,甲硅烷基和三苯基甲基醚基團修飾,可得到抗菌活性較高的穿心蓮內酯衍生物,并比較了其抗菌活性。

3.2 解熱抗炎作用 穿心蓮內酯對肺炎雙球菌和溶血性乙型鏈球菌引起的體溫升高和傷寒、副傷寒菌苗所致的發(fā)熱有一定的解熱作用,對同時感染肺炎雙球菌和溶血性鏈球菌培養(yǎng)物的家兔有延緩體溫上升時間的作用,并且減緩了體溫上升的程度。對于2,4-二硝基酚或內毒素誘導的發(fā)熱和蛋清誘導的水腫或巴豆油誘導的炎癥模型,穿心蓮內酯、新穿心蓮內酯(NA)、脫氧穿心蓮內酯(DA)和脫氧二脫氫穿心蓮內酯(DDA)的退熱、抗炎活性強度依次為DDA、DA、NA和穿心蓮內酯。對于干酵母所致的大鼠發(fā)熱及內毒素所致的家兔發(fā)熱,脫氧穿心蓮內酯磷?；c(DAP Na)(300,150 mg/kg)有良好的解熱作用;400,200,100 mg/kg DAPNa對蛋清所致的大鼠足腫脹及二甲苯所致的小鼠耳腫脹均有良好抗炎作用[9]。史傳英等[10]研究表明亞硫酸鈉穿心蓮內酯具有解熱鎮(zhèn)痛抗炎作用,實驗表明亞硫酸鈉穿心蓮內酯對大腸桿菌誘發(fā)的家兔發(fā)熱有顯著降溫作用。在鎮(zhèn)痛作用方面,亞硫酸鈉穿心蓮內酯可顯著延長小鼠的舔足反應潛伏期,可減少冰醋酸引起的小鼠扭體反應。抗炎作用方面亞硫酸鈉穿心蓮內酯可明顯抑制二甲苯誘導的小鼠耳腫脹。O’Shea JJ[11]研究表明,炎癥的發(fā)生與巨噬細胞和T淋巴細胞的激活、TNF-α,白介素1(IL-1),白介素6(IL-6),干擾素-γ(IFN-γ),NO 和細胞黏附分子等炎性介質的釋放有關。研究表明,穿心蓮內酯能影響一氧化氮合成酶的表達,抑從而制NO的產生,抑制巨噬細胞的遷移和TNF-α,白介素12(IL-12)的產生[12-14]。炎癥反應時,黏附分子表達上調及內皮-白細胞黏附增加。體外實驗表明,脫水穿心蓮內酯琥珀酸單鉀鹽可直接破壞內毒素結構,并抑制大量炎性因子如腫瘤壞死因子-A(TNFA)、白介素-1和-6(IL-1,IL-6)的活性,從而拮抗內毒素的作用[15]。Tsai等[16]闡述了穿心蓮內酯作用于體外補體5α(C5α)誘導的巨噬細胞補充的抗炎機制,得出穿心蓮內酯抗炎作用的機理可能是通過摻入ERK 1/2和PI3K/Akt信號通路的細胞分裂抑制作用的結論。

過去的研究表明,穿心蓮乙酸乙酯部分(AP)具有抗炎活性。CHAO Wenwan等[17]通過生物色譜法進一步分離這些活性化合物,并確定了8個純化合物。實驗表明5-羥基-7,8-二甲氧基黃酮,5-羥基-7,8-二甲氧基二氫黃酮,混合的β-谷甾醇和豆甾醇,麥角甾醇過氧化物,14-去氧-14,15-脫氫穿心蓮內酯,和一種新的化合物19-O-乙?；?14-脫氧-11,12-二脫氫穿心蓮內酯,都顯著抑制LPS/IFN-γ中的轉錄因子NF-κ B的活性,NF-κ B可激活RAW 264.7巨噬細胞(P<0.05)。2個最豐富的化合物,14-去氧-11,12-二脫氫穿心蓮內酯和穿心蓮內酯抑制活性較小,但經過還原,氧化,或乙酰化后會得到抑制活性增加的4種衍生的化合物。所得的化合物能夠顯著降低TNF-R,IL-6,巨噬細胞炎性蛋白-2(MIP-2),和LPS/IFN-γ誘導的 RAW 264.7細胞產生一氧化氮(NO)分泌物,并且比較了化合物對 RAW 264.7細胞的NF-κ B的抑制作用強弱。

3.3 心血管系統(tǒng) Chen等[18]調查了穿心蓮內酯保護人臍靜脈內皮細胞(HUVESVCs)免受生長因子(GF)缺乏誘導的凋亡的分子機理和信號通路。研究表明穿心蓮內酯在HUVESVCs中通過激活Akt-BAD通路發(fā)揮其抗凋亡作用。Burgos等[19]發(fā)現(xiàn)14-脫氧穿心蓮內酯有Ca2+離子通道阻斷活性。研究還發(fā)現(xiàn)DA還是一種牛嗜中性粒細胞PAF介導過程的有效拮抗劑。以上研究表明穿心蓮及其衍生物具有抗動脈粥樣硬化的作用。穿心蓮及其衍生物還具有降壓作用。Zhang等研究認為降低血壓的機制是DA和DDA能刺激血管內皮細胞增加NO的釋放量,從而激活可溶性鳥苷酸環(huán)化酶而起到擴張血管的作用[20]。

3.4 免疫調節(jié) 穿心蓮內酯,是一種非特異性免疫刺激劑,能夠促進免疫活性細胞增殖,增強巨噬細胞的吞噬作用和游走指數(shù),并通過影響NK、巨噬細胞及細胞因子分泌發(fā)揮免疫調節(jié)作用[21]。據(jù)Anju Puri等[22]報道,通過對比穿心蓮內酯乙醇提取物和穿心蓮內酯刺激抗原的特異性和非特異性免疫反應,得出穿心蓮乙醇提取物中存在其他的免疫物的結論。

Wang Bin[23]合成了一系列的穿心蓮內酯衍生物,并且評估潛在的體外抗-HIV活性。與穿心蓮內酯相比,一些衍生物具有更好的抗HIV-1活性。在C-3和C-19羥基引入二芳基的衍生物比在C-3或C-9引入烷基的衍生物表現(xiàn)出更高的TI值,而在C-3和C-19引入過大的芳基會影響抑制活性的CPE和TI。在CFDA和美國FDA的相關法規(guī)指導下,TI被認為是體外抗HIV活性評價的關鍵指標,TI在10以上的化合物在體外具有抗-HIV作用。

3.5 抗腫瘤作用 近年來,研究發(fā)現(xiàn)穿心蓮中重要的二萜內酯類化合物穿心蓮內酯在許多體內外模型上表現(xiàn)出中等強度的抗腫瘤作用[24-26],如可抑制人急性早幼粒白血病細胞(HL-60)增殖,阻滯細胞周期于G0/G1期,并誘導細胞凋亡[27]。DA和DDA是穿心蓮中2種重要的二萜內酯類有效成分,DA在Ec9706和A549上表現(xiàn)出的增殖抑制活性均顯著強于DDA,與文獻報道在其他細胞株上的結果一致[28]。有研究表明[29]在穿心蓮內酯C-3,19引入縮醛(酮)基可顯著提高其體外抗腫瘤活性。其中引入鹵代苯基的衍生物活性提高幅度最大,DA的C-14羥基單獨乙?；cC-14,19羥基同時乙酰化產物的活性相當,且都強于DA;DA的C-3,C-14,C-19 3個羥基同時乙?；纱蠓岣咂鋵c9706的增殖抑制活性。DA的C-8,17雙鍵環(huán)氧化后活性提高,與Nanduri等[30]在卵巢癌SKOV3上的結果一致。在DDA的C-15取代衍生物中,當為脂肪族衍生物時,剛性越強越不利于活性發(fā)揮;當為芳香族衍生物時,共軛體系和剛性的引入也不利于活性的發(fā)揮,而當取代基為4-氟代苯基時,可能苯基上強電負性元素可以緩解C-15取代后導致的活性下降,另外苯環(huán)上含有羥基也可部分提高活性。

Uthaiwan Sirion[8]的研究發(fā)現(xiàn)新的C-19取代穿心蓮內酯類似物具有很強的細胞毒性。穿心蓮內酯是穿心蓮的主要二萜類內酯,對癌細胞有毒。他們研究了通過改變3個羥基組得到的一系列衍生物的構效關系。穿心蓮內酯類似物比母體化合物對癌細胞的的細胞毒活性高得多,包括對P-388,KB,COL-2,MCF-7,LU-1和ASK癌細胞對的細胞毒性。通過對穿心蓮內酯合成類似物的研究表明,在母體化合物的C-19引入甲硅烷基醚或三苯基甲基醚可增加對癌細胞的毒性。19-O-三苯甲基醚衍生物比有效的抗癌藥物玫瑰樹堿細胞毒活性高,因此,此類似物可以作為一個新的抗癌藥物的潛在發(fā)展結構。過去的研究也證明含有三笨甲基的化合物具有抗癌活性。研究得知無論在C-3還是C-14位引入乙?；?其活性均可增加,但是引入乙?；奈恢脤ζ浠钚詿o影響。但是在C-3和C-14位都引入乙?；鶗档推浠钚?。

Bimolendu Das[31]通過C-14位羥基的化學選擇性功能制備出一系列的穿心蓮內酯類似物,在體外實驗中表現(xiàn)出對人白血病細胞系的細胞毒性。實驗表明穿心蓮內酯衍生物都表現(xiàn)出很強的藥效,構效關系的初步研究發(fā)現(xiàn)穿心蓮內酯α-次甲基-γ-丁內酯在活性譜中發(fā)揮了重要作用。并通過光譜和資料分析,建立了類似物的結構。穿心蓮內酯1包含(a)兩個雙鍵的(△12及△8(17)),(b)α-次甲基-γ-丁內酯,及(c)C3,C-14,和C19位的3個羥基。由于C-14位的羥基具有選擇性功能,因此選擇了C-14位。實驗證明穿心蓮內酯轉變?yōu)檫m當?shù)难苌秕?C-14)能夠增加其溶解度以及活性,酯酶切割酯鍵后能夠在體內生理條件下釋放穿心蓮內酯,該酯類似物可作為一種前藥?；谶@個目的合成了在C-14位修飾的穿心蓮內酯酯類衍生物。衍生物構效關系(SAR)的研究表明,主要發(fā)揮作用的是α-次甲基-γ-丁內酯基團。

4 結論

近年來隨著對穿心蓮內酯及其衍生物藥理活性研究的不斷深入,進一步證明穿心蓮內酯及其衍生物具有廣泛的藥理活性,并展示出了廣闊的深入開發(fā)的應用前景。但穿心蓮內酯生物利用度低,和大部分中藥有效成分一樣,具有多種藥理作用,但活性都不明顯。因此開發(fā)新劑型并用化學方法制備穿心蓮內酯衍生物是解決生物利用度低、增強臨床療效的重要途徑。許多穿心蓮內酯衍生物被發(fā)現(xiàn)有較好的抗腫瘤、抗炎等生物活性,對進一步以穿心蓮內酯為先導的新藥研發(fā)具有一定的指導意義。

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