韓潞 江勇 韓東興

上海建工醫(yī)院普外科，上海 200083

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，2008年全世界新發(fā)結(jié)直腸癌病例有120萬(wàn)例，死亡60萬(wàn)例［1］，是發(fā)生率和死亡率較高的惡性腫瘤之一。α-1-酸性糖蛋白(alpha-1-acid glycoprotein，AGP)是一種非特異性急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，相對(duì)分子質(zhì) 量為44×103，是人類(lèi)血清中含糖量最高(約45%)、酸性最強(qiáng)(PI：2.7～3.5)的糖蛋白。近年來(lái)，有報(bào)道稱(chēng)A G P 或其異型體在結(jié)直腸癌患者血清和組織中的濃度及表達(dá)水平增高，可作為診斷標(biāo)志物［2-3］。本研究通過(guò)檢測(cè)結(jié)直腸癌患者癌組織中AGP的水平，旨在闡明AGP與結(jié)直腸癌的臨床病理學(xué)參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

2005年8月—2011年9月，上海建工醫(yī)院普外科收治的結(jié)直腸癌患者40例，其中男性23例，女性17例。所有患者均經(jīng)術(shù)后病理確診，其臨床資料與病理資料完整，且術(shù)前未接受放療、化療及其他針對(duì)腫瘤的治療。40例患者具有完整的隨訪資料。其中26例患者有配對(duì)的黏膜，本研究將其作為對(duì)照。

1.2 試劑和方法

血清CEA和血清CA19-9陽(yáng)性依據(jù)檢驗(yàn)科報(bào)告判斷。AGP鼠抗人多克隆抗體(PA1-26225)購(gòu)于Thermo Scientific公司，免疫組化采用EnVision兩步法，顯色采用基因科技公司的二步法抗兔/鼠通用免疫組化檢測(cè)試劑盒(EnVision試劑盒，GK500705)。蘇木精復(fù)染后經(jīng)水洗，分化，梯度酒精和二甲苯后風(fēng)干，封片。實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，用磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照，以已知陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定

AGP的表達(dá)以細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)Croce等［2］報(bào)道的方法，稍作改進(jìn)，簡(jiǎn)述如下。染色反應(yīng)強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分為4級(jí)：陰性(?)為細(xì)胞不著色或陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜10%；弱陽(yáng)性(+)為細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)淺棕黃色顆?；蜿?yáng)性細(xì)胞數(shù)為10%～25%；陽(yáng)性(++)為細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆?；蜿?yáng)性細(xì)胞數(shù)為26%～50%；強(qiáng)陽(yáng)性(+++)為細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)深棕黃色顆?；蜿?yáng)性細(xì)胞數(shù)＞50%。每張切片選取4個(gè)視野觀察后進(jìn)行評(píng)分，并計(jì)算平均值作為評(píng)分結(jié)果。結(jié)直腸癌組織中AGP蛋白的表達(dá)(?)和(+)定義為低表達(dá)，(++)和(+++)定義為高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用χ2檢驗(yàn)和四格表的精確概率法，在統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0上對(duì)各指標(biāo)表達(dá)與臨床參數(shù)之間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 結(jié)直腸癌組織和黏膜組織中AGP的表達(dá)

AGP主要在結(jié)直腸癌組織的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，而在黏膜組織的細(xì)胞質(zhì)中基本不表達(dá)(圖1)。AGP在40例結(jié)直腸癌組織中(?)表達(dá)1例(2.5%)，(+)表達(dá)9例(22.5%)，(++)表達(dá)17例(42.5%)，(+++)表達(dá)13例(32.5%)。AGP在26例黏膜組織中(?)表達(dá)14例(53.8%)，(+)表達(dá)5例(19.2%)，(++)表達(dá)6例(23.1%)，(+++)表達(dá)1例(3.8%)。根據(jù)上述方法中的AGP表達(dá)的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，40例結(jié)直腸癌組織中AGP高表達(dá)占75.0%，低表達(dá)占25.0%，而在26例黏膜組織中AGP高表達(dá)占26.9%， 低表達(dá)占73.1%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖1 AGP在結(jié)直腸癌和黏膜組織中的表達(dá)情況Fig.1 Expression of AGP in mucosa and colorectal cancer by immunohistochemistry staining(×200)

2.2 結(jié)直腸癌組織中AGP的表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

結(jié)直腸癌組織中AGP表達(dá)與患者年齡(P=0.002)、T分期(P=0.038)相關(guān)，而與性別、血清CEA、血清CA19-9、分化程度、N分期、M分期、腫瘤大小均無(wú)關(guān)(P＞0.05，表1)。

2.3 血清CEA、CA19-9及結(jié)腸癌組織AGP表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系

Kaplan-Meier法生存分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血清CEA雖然有提示預(yù)后的趨勢(shì)，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.081，圖2A)。血清CA19-9表達(dá)陽(yáng)性患者的預(yù)后比陰性患者差，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004，圖2B)。AGP在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平與預(yù)后不相關(guān)(P=0.654，圖2C)。

表1 AGP在結(jié)直腸癌中的表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab.1 The correlation of expression of AGP with clinicopathologic characteristic of colorectal cancer patients

圖2 血清CEA、CA19-9及結(jié)直腸癌組織中AGP表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系Fig.2 Relationship between the serum CA19-9, serum CEA, expression of AGP and overall survival

3 討 論

AGP是一種非特異性急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，其血漿濃度可能會(huì)在急性炎性反應(yīng)或慢性疾病時(shí)增加數(shù)倍［4］。AGP主要有兩個(gè)截然不同的生物學(xué)功能，一個(gè)是具有結(jié)合內(nèi)源性物質(zhì)和藥物的功能，另一個(gè)是具有強(qiáng)力的免疫調(diào)節(jié)功能［5］。近年來(lái)，對(duì)AGP及異型體的結(jié)構(gòu)、生物學(xué)功能的研究日益增多［6-7］。另外，AGP可作為腫瘤標(biāo)志物的報(bào)道也日益增多［8-10］。結(jié)直腸癌是嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的常見(jiàn)惡性腫瘤之一，全世界每年新增約100萬(wàn)例，僅中國(guó)就有15萬(wàn)例。Brock等［11］報(bào)道AGP可作為診斷結(jié)直腸癌的血清標(biāo)志物組合的一員。而既往對(duì)AGP在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平與臨床病例參數(shù)的相關(guān)性分析的報(bào)道較少。

本研究探討了結(jié)直腸癌組織和正常黏膜中AGP和臨床病理參數(shù)和預(yù)后的相關(guān)性。結(jié)果顯示，AGP在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，在黏膜中低表達(dá)，與Croce等［2］的報(bào)道相符。AGP在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平與患者年齡、T分期相關(guān)，而與性別、分化程度、腫瘤大小、 N分期、M分期、TNM、血清CEA、血清CA19-9無(wú)關(guān)，提示其可作為獨(dú)立的診斷因子。AGP在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)與總生存期不相關(guān)。

綜上所述，結(jié)直腸癌組織中AGP高表達(dá)，可作為結(jié)直腸癌的免疫組化標(biāo)志物，而結(jié)直腸癌組織中AGP表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的相關(guān)性，有待于進(jìn)一步大樣本量的研究。

［1］JEMAL A, BRAY F, CENTER M M, et al.Global cancer statistics ［J］.CA Cancer J Clin, 2011, 61(2): 69-90.

［2］CROCE M V, SáLICE VC, LACUNZA E, et al.Alpha 1-acid glycoprotein (AGP): a possible carrier of sialyl lewis X (slewis X) antigen in colorectal carcinoma ［J］.Histol Histopathol, 2005, 20(1): 91-97.

［3］ZHANG X, XIAO Z, LIU X, et al.The potential role of ORM2 in the development of colorectal cancer ［J］.PLoS One, 2012, 7(2): e31868.doi: 10.1371/journal.pone.0031868.

［4］CECILIANI F, POCACQUA V.The acute phase protein alpha1-acid glycoprotein: a model for altered glycosylation during diseases ［J］.Curr Protein Pept Sci, 2007, 8(1): 91-108.

［5］JOHNSON J A, LIVINGSTON T N.Differences between blacks and whites in plasma protein binding of drugs ［J］.Eur J Clin Pharmacol, 1997, 51(6): 485-488.

［6］IMRE T, SCHLOSSER G, POCSFALVI G, et al.Glycosylation site analysis of human alpha-1-acid glycoprotein (AGP) by capillary liquid chromatography-electrospray mass spectrometry ［J］.J Mass Spectrom, 2005, 40(11): 1472-1483.

［7］BUDAI L, OZOHANICS O, LUDáNYI K, et al.Investigation of genetic variants of alpha-1 acid glycoprotein by ultraperformance liquid chromatography-mass spectrometry ［J］.Anal Bioanal Chem, 2009, 393(3): 991-998.

［8］BISCHOFF R, LUIDER T M.Methodological advances in the discovery of protein and peptide disease markers ［J］.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 2004, 803(1): 27-40.

［9］DAVIS M T, AUGER P, SPAHR C, et al.Cancer biomarker discovery via low molecular weight serum proteome profiling-Where is the tumor? ［J］.Proteomics Clin Appl, 2007, 1(12): 1545-1558.

［10］PATAI K, DEVENYI L, HUBAY M, et al.Phosphor/sulphur ratio: an indicator of malignant uterus change ［J］.Oncol Res, 2005, 15(4): 215-217.

［11］BROCK R, XIONG B, LI L, et al.A multiplex serum protein assay for determining the probability of colorectal cancer ［J］.Am J Cancer Res, 2012, 2(5): 598-605.