反轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的P27kip1促HepG2細胞凋亡

潘永平，龔 輝，邱夢標，樊曉慧，毛紅霞，熊水印，粟慶娟

(南昌大學第四附屬醫(yī)院感染科，江西南昌330003)

肝細胞癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，癌細胞的生物學特征是多種原癌基因的激活、抑癌基因的失活及一系列復(fù)雜的調(diào)控機制失常所致的生長失控。其主要分子機制是細胞周期紊亂和凋亡過少。P27kip1是一種細胞周期素依賴性激酶抑制劑，可將細胞阻滯于G1期，并誘導(dǎo)細胞凋亡，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)P27kip1在多種腫瘤組織中表達量降低［1］，且在腫瘤細胞中，P27kip1減少的程度與細胞DNA損傷的程度有一定的關(guān)系［2］。因此，P27kip1途徑可能成為腫瘤診斷［3］和治療的新的靶點。

為了研究肝癌細胞中的P27kip1的表達情況，并考查外源導(dǎo)入P27kip1對肝癌細胞的影響，為基于P27kip1的腫瘤治療研究提供理論依據(jù)，本實驗構(gòu)建了載有P27kip1基因的反轉(zhuǎn)錄病毒載體，篩選出了可穩(wěn)定產(chǎn)生病毒的PA317包裝細胞，構(gòu)建了過表達P27kip1的 HepG2細胞，并檢測了過表達 P27kip1對HepG2細胞的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料

pLNCX質(zhì)粒、攜帶有人 P27kip1基因的 pUC18-P27質(zhì)粒、DH5α菌種、PA317細胞、HepG2細胞由本實驗室提供。質(zhì)粒提取試劑盒(上海生工生物工程有限公司)。HindⅢ、ClaⅠ限制性內(nèi)切酶、Taq酶(Promega公司)，DMEM、FCS、胰蛋白酶、Lipofectamine-2000轉(zhuǎn)染試劑盒、G418(Gibco公司)。鼠抗人P27kip1抗體(Santa Cruz公司)。

1.2 構(gòu)建p LNCX-P27質(zhì)粒

分別用HindⅢ及ClaⅠ酶切pUC18-P27質(zhì)粒及pLNCX質(zhì)粒，用T4連接酶將兩者定向連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細菌，提取 pLNCX-p27質(zhì)粒，經(jīng)HindⅢ及ClaⅠ雙酶切鑒定。

1.3 轉(zhuǎn)染PA317細胞

采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將15μL的重組pLNCX-p27質(zhì)粒轉(zhuǎn)染反轉(zhuǎn)錄病毒包裝細胞 PA317，同時以空pLNCX載體作為對照組。轉(zhuǎn)染48 h后，胰蛋白酶消化細胞，培養(yǎng)液中加入300μg/L G418進行篩選，每3～4 d換液1次，G418濃度逐漸增加至500μg/L，3周后獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染克隆。對穩(wěn)定克隆擴大培養(yǎng)，部分凍存，部分繼續(xù)在50 mL培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，細胞鋪滿后按1∶3的比例傳代，并更換不含G418的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，收集上清液，離心、0.22μm濾膜過濾后－70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 測定病毒滴度

檢測前24 h傳代 HepG2細胞，細胞生長達60%～70%匯合度時，取保存的病毒上清液加入無血清DMEM培養(yǎng)液，并以102、103和104倍稀釋，稀釋液分別加入HepG2細胞中，2.5 h后加入含有500μg/L G418及10%FCS的 DMEM培養(yǎng)液，每3～4 d換液1次，維持G418濃度不變，3周后計數(shù)抗性克隆數(shù)。病毒滴度=平均抗性克隆數(shù)×病毒液稀釋倍數(shù)。

1.5 感染HepG2細胞

HepG2細胞以5×105個接種于250 mL培養(yǎng)瓶中，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，待細胞鋪滿瓶底約70%時，加入pLNCX-P27病毒懸液，另設(shè)對照組加入pLNCX空載體病毒液;同時加入聚凝胺至終濃度6 mg/L，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后按1∶5傳代，24 h后加入G418至終濃度500 mg/L進行篩選，3周后對陽性細胞進行克隆化培養(yǎng)，建立HepG2-P27細胞系及對照組HepG2-pLNCX細胞系。

1.6 Western blot檢測

裂解液破裂細胞，離心后取上清，檢測總蛋白濃度，取50μg蛋白進行12%SDS-PAGE電泳，電泳之后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，加一抗于37℃孵育30 min，洗滌后加入辣根過氧化物酶標記的二抗于37℃孵育30 min，化學發(fā)光法顯色拍照。

1.7 MTT

取生長狀態(tài)良好的對數(shù)增殖期的細胞，設(shè)HepG2-P27細胞組、HepG2-pLNCX對照組和HepG2細胞空白對照組，每組24個復(fù)孔，常規(guī)消化記數(shù)后，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度至3×107按200μL每孔接種于96孔板，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，每3天換1次液。每24 h各取3個復(fù)孔進行檢測，連續(xù)8 d。檢測前4 h每孔加入MTT 20μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜100μL/孔，振蕩15 min后，用酶標儀于490 nm波長下檢測A490nm值。

1.8 流式細胞術(shù)檢測細胞周期及細胞凋亡

HepG2-p27細胞及常規(guī)HepG2細胞各設(shè)置3個復(fù)孔，胰蛋白酶消化后收集細胞，用 PBS制成2×108/L的單細胞懸液，用FCM流式細胞儀進行PI單色熒光細胞流式計數(shù)，觀察G1期、S期和G2期細胞所占百分數(shù)。用Annexin V/PI雙染色法檢測細胞凋亡情況。

2 結(jié)果

2.1 反轉(zhuǎn)錄病毒載體p LNCX-P27的構(gòu)建

構(gòu)建的含有 P27kip1基因的反轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCX-P27，經(jīng)HindⅢ、ClaⅠ酶切，可出現(xiàn)594 bp的條帶(圖1)，證明目的基因插入正確，載體構(gòu)建成功。

2.2 病毒滴度檢測

收集包裝細胞產(chǎn)生的病毒液，計算pLNCX-P27病毒液滴度為2.9×104CfU/mL，對照組pLNCX空載體病毒液滴度為3.2×104CfU/mL。

2.3 Western blot結(jié)果

HepG2-P27組細胞中可高表達P27kip1蛋白，而空載體病毒及HepG2空白對照組中僅有微量P27kip1蛋白表達(圖2)，證明構(gòu)建的反轉(zhuǎn)錄病毒pLNCX-P27可將P27kip1基因?qū)爰毎⒃诩毎麅?nèi)高表達。

圖1 p LNCX-P27質(zhì)粒HindⅢ/ClaⅠ雙酶切鑒定Fig 1 pLNCX-P27 vector digested by HindⅢand ClaⅠ

圖2 P27kip1在HepG2中的表達Fig 2 Expression of P27kip1 in HepG2

2.4 P27kip1對Hep G2細胞形態(tài)的影響

正常HepG2細胞生長旺盛，鏡下可見較多分裂相，細胞倍增快;而實驗組細胞與對照組相比，增生效慢，且出現(xiàn)較多凋亡細胞:細胞體積明顯縮小，胞核固縮，胞質(zhì)中有空泡形成(圖3)。

2.5 P27kip1對Hep G2生長速度的影響

與pLNCX空質(zhì)粒組相比，pLNCX-P27組可明顯抑制HepG2細胞的增長(p＜0.01)，而pLNCX組與HepG2空白對照組無差異(圖4)。

2.6 P27kip1對Hep G2細胞周期的影響

導(dǎo)入P27kip1基因的HepG2-P27組處于G1期的細胞明顯高于對照組(p＜0.01)，而處于S期的細胞顯著減少(p＜0.01)(圖5)。

圖3 P27kip1對HepG2生長形態(tài)的影響Fig 3 Effect of P27kip1 on Hep G2 morphology(×100)

圖4 P27kip1對HepG2生長速度的影響Fig 4 Effect of P27kip1 on HepG2 growth

圖5 P27kip1對Hep G2細胞周期的影響Fig 5 Effect of P27kip1 on the cell cycle of Hep G2

圖6 P27kip1對Hep G2細胞凋亡的影響Fig 6 Effect of P27kip1 on apoptosis of Hep G2

2.7 P27kip1對HepG2細胞凋亡的影響

HepG2空白對照組、HepG2-pLNCX對照組與HepG2-P27三組細胞的凋亡比率依次為(6.32±1.16)%，(6.90±0.93)%和(27.85±4.42)%，空白對照組與空質(zhì)粒對照組之間無統(tǒng)計學差別，導(dǎo)入P27kip1基因的 HepG2-P27組則明顯高于對照組(p＜0.01)(圖6)。

3 討論

腫瘤細胞的永生化和分裂失控是腫瘤細胞惡性增生的根本原因，而細胞周期調(diào)節(jié)蛋白在正常細胞的生長和腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。真核細胞的細胞周期由一系列的細胞周期素(cyclins)和細胞周期素依賴性激酶(cyclin dependent kinases，CDKs)的有序激活和失活調(diào)控，而細胞周期素依賴性激酶抑制劑(cyclin-dependent-kinase inhibitors，CKIs)是細胞周期負性調(diào)控因子［4］。P27kip1是 CKIs的主要成分之一，主要抑制細胞周期蛋白E-CDK2和細胞周期蛋白D-CDK4等G1期激酶復(fù)合物，使細胞不能通過G1期，并誘導(dǎo)細胞凋亡。人為地減少P27蛋白的表達，可使正常細胞出現(xiàn)惡性傾向［5］，而增加其表達則可使某些腫瘤細胞惡性表現(xiàn)逆轉(zhuǎn)。

本實驗構(gòu)建了含人P27kip1的重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體，導(dǎo)入 PA317細胞，篩選出了穩(wěn)定產(chǎn)生病毒的PA317-P27細胞，并用病毒成功感染HepG2細胞，經(jīng)克隆化培養(yǎng)，成功建立了過表達P27kip1的肝癌細胞模型，并證實過表達的P27kip1將細胞阻滯于G1期，并通過誘導(dǎo)細胞凋亡等機制抑制 HepG2的生長。

［1］Rohlfing AK，Trescher K，Hahnel J，et al．Partial hepatectomy in rats results in immediate down-regulation of P27kip1in residual liver tissue by transcriptional and post-translational processes［J］．Front Physiol，2013，4:139 －148．

［2］Ranchal I，Gonzalez R，Bello RI，et al．The reduction of cell death and proliferation by p27(Kip1)minimizes DNA damage in an experimental model of genotoxicity［J］．Int JCancer，2009，125:2270－2280．

［3］Abdou A，Kandil M，El-Wahed MA，et al．The diagnostic value of p27 in comparison to p57 in differentiation between different gestational trophoblastic diseases［J］．Fetal Pediatr Pathol，2013，32:162－164．

［4］ Belletti B，Baldassarre G．New light on p27(kip1)in breast cancer［J］．Cell Cycle，2012，11:3701－3702．

［5］Maass JC，Berndt FA，Canovas J，et al．P27kip1knockdown induces proliferation in the organ of corti in culture after efficient shRNA lentiviral transduction［J］．JAssoc Res Otolaryngol，2013，14:295－299．