任丹陽(yáng) 康曉靜 于世榮 時(shí)曉輝 吳秀娟 靳穎 普雄明

·研究報(bào)道·

BRAF V600E突變蛋白在皮膚黑素瘤中的表達(dá)

任丹陽(yáng) 康曉靜 于世榮 時(shí)曉輝 吳秀娟 靳穎 普雄明

目的探討皮膚黑素瘤BRAF V600E突變蛋白表達(dá)情況,分析免疫組化法檢測(cè)V600E突變的靈敏度和特異度。方法應(yīng)用抗BRAF V600E單克隆抗體的免疫組化法檢測(cè)103例皮膚黑素瘤、40例色素痣石蠟包埋組織切片中BRAF V600E突變蛋白表達(dá)水平。采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,率的比較采用χ2檢驗(yàn)。結(jié)果BRAF V600E突變蛋白陽(yáng)性表達(dá)率在皮膚黑素瘤中為20.4%(21/103),色素痣中為5.0%(2/40),兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.06,P＜0.05)。黑素瘤BRAF V600E突變蛋白的表達(dá)率在不同年齡組[＜60歲組表達(dá)率為29.8%(14/47),≥60歲組為12.5%(7/56)]、不同民族[維吾爾族組為30.2%(13/43),漢族組為13.3%(8/60)]、不同發(fā)病部位[肢端為13.6%(6/42)、黏膜為11.8%(4/29)、非肢端為45.8%(11/32)]、不同Clark分級(jí)[Ⅰ～Ⅲ級(jí)組為8.6%(4/42),Ⅳ～V級(jí)組為12.4%(17/61)]組間表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),而在不同性別、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組間表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。免疫組化檢測(cè)惡性黑素瘤中BRAF V600E突變靈敏度為100%(15/15),特異度為98.5%(65/66)。結(jié)論BRAF V600E突變蛋白在皮膚黑素瘤中高表達(dá),在維吾爾族人群表達(dá)率高于漢族人群;免疫組化法檢測(cè)BRAF V600E突變具有準(zhǔn)確、快速等特點(diǎn)。

黑色素瘤;突變;原癌基因蛋白質(zhì)B-raf

近年來(lái)我國(guó)黑素瘤發(fā)病呈遞增趨勢(shì)[1]。BRAF突變是黑素瘤最常見(jiàn)的遺傳學(xué)事件,90%以上是BRAF V600E突變,平均突變率為60%～80%[2],與黑素瘤發(fā)生、發(fā)展、靶向治療和不良預(yù)后密切相關(guān)[3]。針對(duì)BRAF V600E突變抑制劑威羅菲尼能提高黑素瘤的無(wú)進(jìn)展生存期和總生存期[4]。臨床上快速檢測(cè)黑素瘤中BRAF V600E突變是黑素瘤患者個(gè)體化靶向治療的依據(jù)。本研究應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)103例皮膚黑素瘤中BRAF V600E突變蛋白表達(dá)情況,與PCR方法檢測(cè)V600E突變比較,分析BRAF V600E突變蛋白表達(dá)與皮膚黑素瘤不同臨床病理參數(shù)的關(guān)系和免疫組化檢測(cè)BRAF V600E突變的臨床應(yīng)用價(jià)值。

一、資料

1.標(biāo)本來(lái)源:103份皮膚黑素瘤標(biāo)本,包括80份本實(shí)驗(yàn)組前期經(jīng)PCR檢測(cè)BRAF突變標(biāo)本[5]和23份新增標(biāo)本,均來(lái)自新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院皮膚科及病理科2004—2013年6月存檔石蠟組織標(biāo)本,病史完整(表1)。全部病例均未做化療、放療及抗免疫治療,經(jīng)手術(shù)切除后病理學(xué)檢查確診。另選擇40份色素痣石蠟組織作為對(duì)照組。

2.主要試劑:一抗是小鼠抗人BRAF V600E單克隆抗體(IgG,美國(guó)NewEast公司,產(chǎn)品編號(hào):26039);鼠兔通用型二抗、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑均系北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

二、方法

1.免疫組化法:將4%甲醇固定、石蠟包埋的黑素瘤組織制成4～5 μm切片,常規(guī)烤片、脫蠟、水化;浸入0.01 mol/L pH6.0的枸櫞酸鹽緩沖液內(nèi),熱抗原修復(fù)3 min;3%H2O2室溫作用10 min;滴加一抗(稀釋度為1∶800)100 μl;4℃過(guò)夜后室溫復(fù)溫45 min,滴加通用型二抗100 μl,室溫孵育30 min;DAB顯色1 min左右;自來(lái)水沖洗,蘇木精復(fù)染,通透、脫水,中性樹(shù)膠封片,顯微鏡下觀察。PBS代替一抗作為空白對(duì)照,已知表達(dá)突變型V600E黑素瘤切片作為陽(yáng)性對(duì)照。

2.結(jié)果判斷及標(biāo)準(zhǔn):所有切片在做免疫組化前均現(xiàn)切,免疫組化結(jié)果由2位病理科專家雙盲閱片判讀結(jié)果,陽(yáng)性染色為大多數(shù)腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞質(zhì)棕黃色著色,陰性為不著色或單一孤立的胞核著色、零星細(xì)胞的單一淺著色、單核巨噬細(xì)胞著色。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件,率的比較采用χ2檢驗(yàn)。

圖1 皮膚黑素瘤BRAF V600E突變蛋白表達(dá)陽(yáng)性 細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒(免疫組化×400)

表1 皮膚黑素瘤患者臨床病理參數(shù)與BRAF V600E突變蛋白表達(dá)的關(guān)系

三、結(jié)果

1.BRAF V600E突變蛋白在皮膚黑素瘤和色素痣中的表達(dá):BRAF V600E突變蛋白陽(yáng)性表達(dá)表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)棕黃色著色,皮膚黑素瘤103例中陽(yáng)性21例,陽(yáng)性率為20.4%;色素痣40例中陽(yáng)性2例,陽(yáng)性率為5.0%,兩組陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.06,P＜0.05)。見(jiàn)圖1。

2.皮膚黑素瘤臨床病理參數(shù)與BRAF V600E突變蛋白表達(dá)的關(guān)系:皮膚黑素瘤BRAF V600E突變蛋白表達(dá)水平在不同年齡、民族、發(fā)病部位、Clark分級(jí)組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),而患者不同性別、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組間表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

3.免疫組化法檢測(cè)BRAF V600E突變的靈敏度和特異度:與本實(shí)驗(yàn)組前期研究[5]對(duì)比,80例黑素瘤患者DNA直接測(cè)序BRAF V600E突變15例,這15例免疫組化檢測(cè)均陽(yáng)性,另有1例出現(xiàn)假陽(yáng)性。免疫組化檢測(cè)BRAF V600E突變的靈敏度和特異度分別為100%(15/15)和98.5%(64/65)。

四、討論

研究發(fā)現(xiàn),RAS-RAF-MEK-ERK級(jí)聯(lián)信號(hào)通路是細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化和凋亡的關(guān)鍵通路,BRAF基因突變是MAPK通路異?；罨瘷C(jī)制之一,出現(xiàn)在超過(guò)60%～80%的黑素瘤中,其中90%以上突變是BRAF蛋白第600位的纈氨酸被谷氨酸取代,即V600E[2],這種突變的發(fā)生能顯著提高BRAF激酶活性,其激活MAPK信號(hào)通路的傳導(dǎo)異常,導(dǎo)致黑素細(xì)胞轉(zhuǎn)化成黑素瘤細(xì)胞[6-7]。

美國(guó)FDA于2011年和2013年先后批準(zhǔn)針對(duì)BRAF V600E突變的小分子靶向藥物威羅菲尼、達(dá)拉菲尼和曲美替尼上市,其總有效率達(dá)60%～80%[8]。因此在進(jìn)行系統(tǒng)性治療之前,檢測(cè)黑素瘤患者BRAF V600E突變,可以為黑素瘤患者個(gè)體化治療提供依據(jù)。目前檢測(cè)BRAF突變的方法包括基因測(cè)序、突變特異性PCR等,它們的靈敏度和特異度不同。分子檢測(cè)技術(shù)相對(duì)昂貴、費(fèi)時(shí),對(duì)DNA質(zhì)量要求高,并且4%甲醇固定石蠟包埋組織(FFPE)中的DNA存在不同程度的降解,使其臨床應(yīng)用受到限制[9]。近來(lái)一種突變特異性抗體VE1的出現(xiàn),使擁有高靈敏度和特異度的免疫組化方法能檢測(cè)FFPE腫瘤組織中BRAF V600E突變蛋白。Feller等[10]提示,免疫組化是檢測(cè)BRAF V600E突變的一種可靠、高度特異性的方法,能作為臨床實(shí)踐中篩選BRAF V600E突變的工具。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn),在甲狀腺癌、結(jié)直腸癌、肺腺癌和星形細(xì)胞瘤中免疫組化可以作為臨床檢測(cè)BRAF V600E突變的簡(jiǎn)化方式[11-14]。本研究用免疫組化檢測(cè)皮膚黑素瘤中BRAF V600E突變的靈敏度為100%,特異度為98.5%,能準(zhǔn)確、快速、低費(fèi)用檢測(cè)BRAF V600E突變,與國(guó)外報(bào)道一致。其中1例假陽(yáng)性結(jié)果為L(zhǎng)597Q(T1790A)突變,將這份標(biāo)本再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增,DNA測(cè)序結(jié)果表明仍為L(zhǎng)597Q突變。這種假陽(yáng)性結(jié)果可能是VE1抗體對(duì)BRAF 600位氨基酸前后T-A的突變比較敏感所致。

朱琰琰等[15]采用PCR擴(kuò)增、直接測(cè)序法在其研究的90例黑素瘤中發(fā)現(xiàn)BRAF突變率達(dá)27.8%,V600E突變率為22.2%。Si等[16]進(jìn)一步驗(yàn)證了上述結(jié)論,在其檢測(cè)的432例黑素瘤中,BRAF突變率達(dá)25.5%,其中V600E突變占全部突變的89.1%,V600E突變率為22.7%。我國(guó)BRAF V600E突變率相對(duì)偏低,提示該基因突變可能存在種族差異。新疆是多民族聚居地區(qū),維吾爾族人群具有獨(dú)特的民族特點(diǎn)和遺傳選擇性,提示新疆地區(qū)黑素瘤可能存在其特有的基因特點(diǎn)。本研究對(duì)新疆地區(qū)103例皮膚黑素瘤BRAF V600E突變蛋白進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示,21例患者BRAF V600E突變蛋白表達(dá)陽(yáng)性,其中維吾爾族13例,漢族8例,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示,維吾爾族BRAF V600E突變蛋白表達(dá)高于漢族人群,提示BRAF V600E突變可能存在民族差異,因樣本量較小,有待于大樣本進(jìn)一步研究證實(shí)。有研究證明,BRAF突變主要發(fā)生在間斷性日光暴露的黑素瘤患者中,更傾向發(fā)生于年輕人群[17],且與不良預(yù)后有關(guān)。本研究結(jié)果顯示,BRAF V600E突變蛋白在＜60歲組中高表達(dá),黏膜、肢端和非肢端黑素瘤中的表達(dá)率分別為11.8%、13.6%、45.8%,ClackⅣ～V級(jí)患者BRAF V600E突變蛋白表達(dá)率顯著高于ClackⅠ～Ⅲ級(jí)。這些與國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道一致,提示BRAF V600E對(duì)皮膚黑素瘤的輔助診斷和預(yù)后評(píng)估具有重要意義。本研究還發(fā)現(xiàn),BRAF V600E突變蛋白在男性與女性的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移被認(rèn)為是影響惡性黑素瘤預(yù)后的一個(gè)重要因素,但本研究結(jié)果顯示,BRAF基因突變?cè)谟袩o(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組間表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,考慮到樣本含量較少及標(biāo)本選擇的差異性,仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量證實(shí)。

綜上所述,本研究用免疫組化法分析了BRAF V600E突變蛋白在皮膚黑素瘤中的表達(dá)情況,結(jié)果顯示,BRAF V600E突變蛋白在皮膚黑素瘤中高表達(dá),對(duì)皮膚黑素瘤輔助診斷、靶向治療和預(yù)后評(píng)估具有重要的臨床意義。免疫組化法檢測(cè)皮膚黑素瘤中BRAF V600E突變具有準(zhǔn)確、快速、價(jià)格相對(duì)低廉的優(yōu)點(diǎn),可為黑素瘤患者制定個(gè)體化治療方案提供幫助。

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2014-03-20)

(本文編輯:顏艷)

Expression of BRAF V600E mutant protein in cutaneous malignant melanoma

Ren Danyang，Kang Xiaojing*，Yu Shirong，Shi Xiaohui，Wu Xiujuan，Jin Ying，Pu Xiongming.*Department of Dermatology and Venereology，People′s Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region，Urumqi 830001，China

Kang Xiaojing，Email:drkangxj666@163.com

ObjectiveTo detect the expression of BRAF V600E mutant protein in cutaneous malignant melanoma(CMM)，and to evaluate the sensitivity and specificity of immunohistochemistry(IHC)in detecting BRAF V600E mutation.MethodsIHC with an anti-BRAF V600E monoclonal antibody was performed to detect the expression of BRAF V600E mutant protein in paraffin-embedded tissue sections from 103 patients with CMM and 40 patients with nevus.Statistical analysis was carried out with SPSS software version 17.0，and the expression rate of BRAF V600E mutant protein was compared by chi-square test.ResultsThe expression rate of BRAF V600E mutant protein in the CMM patients was 20.4%(21/103)，significantly higher than that in the nevus patients(5.0%(2/40)，χ2=5.06，P＜ 0.05).Significant differences were observed in the expression rate of BRAF V600E mutant protein between CMM patients of different age groups(29.8%(14/47)in patients aged＜60 years vs.12.5%(7/56)in those aged ≥ 60 years，P＜ 0.05)and nationality(30.2%(13/43)for Uygur nationality vs.13.3%(8/60)for Han nationality，P ＜ 0.05)，as well as among CMM lesions from different anatomical sites(13.6%(6/42)in acral sites vs.11.8%(4/29)in mucous membrane vs.45.8%(11/32)in non-acral sites，P＜ 0.05)and of different Clark levels(8.6%(4/42)for gradeⅠ-Ⅲ vs.12.4%(17/61)for gradeⅣ-V，P＜0.05)，but not between male and female CMM patients or between CMM patients with lymph node metastasis and those without(bothP＞0.05).IHC with the anti-BRAF V600E antibody showed a sensitivity of 100%(15/15)and a specificity of 98.5%(65/66)in detecting BRAF V600E mutation.Conclusions The expression of BRAF V600E mutant protein is up-regulated in CMM lesions，and CMM patients of Uygur nationality seems to have a higher expression rate than those of Han nationality.IHC appears to be an accurate and rapid method to detect V600E BRAF mutation.

Melanoma;Mutation;Proto-oncogene proteins B-raf

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.12.014

國(guó)家自然科學(xué)基金(81250023);新疆維吾爾自治區(qū)國(guó)際科技合作計(jì)劃項(xiàng)目(20146022);2012年度國(guó)家臨床重點(diǎn)?？祈?xiàng)目

830001烏魯木齊,新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院皮膚性病科[任丹陽(yáng)(現(xiàn)在新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系,832000)、康曉靜、于世榮、時(shí)曉輝、吳秀娟、靳穎、普雄明]

康曉靜,Email:drkangxj666@163.com