王翠 祝逸平 許愛娥

表沒食子兒茶素沒食子酸酯和補骨脂對莫諾苯宗誘導白癜風樣小鼠的影響

王翠 祝逸平 許愛娥

目的探討表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)和補骨脂對莫諾苯宗誘導的白癜風樣小鼠的影響。方法C57BL/6小鼠40只,脫去背部2 cm×2 cm區(qū)域毛,隨機分為4組,每組10只。陰性對照組涂抹凡士林乳膏;模型組涂抹40%莫諾苯宗乳膏;EGCG組先后涂抹5%EGCG、40%莫諾苯宗乳膏;補骨脂組先后涂抹7%補骨脂、40%莫諾苯宗乳膏。觀察小鼠皮膚和毛發(fā)脫色情況,組織病理檢查觀察淋巴細胞浸潤,免疫熒光檢測CD8+T細胞表達量。結果陰性對照組小鼠皮膚和毛發(fā)無脫色現(xiàn)象。模型組小鼠在用藥部位及非用藥部位均有脫色現(xiàn)象,EGCG組和補骨脂組小鼠用藥部位全部出現(xiàn)脫色,用藥部位出現(xiàn)脫色斑的平均時間分別為16.7、29.3和19.9 d,脫色面積指數(shù)分別為4.00±0.00、2.11±0.54、2.84±0.79,EGCG組、補骨脂組和模型組之間脫色面積指數(shù)差異有統(tǒng)計學意義(F=14.17,P＜0.05),EGCG組和補骨脂組分別與模型組比較,脫色面積指數(shù)差異均有統(tǒng)計學意義(均P＜0.05);同時,EGCG組和補骨脂組非用藥部位的脫色面積指數(shù)差異同樣有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。EGCG組和補骨脂組CD8+T細胞表達量均低于模型組,EGCG組和補骨脂組差異亦有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。結論EGCG和補骨脂對莫諾苯宗誘導的小鼠皮膚和毛發(fā)脫色均有干預作用,EGCG的干預作用比補骨脂的干預作用強,該動物模型與人類白癜風具有極高相似性。

白癜風;沒食子酸丙酯;補骨脂;疾病模型,動物

白癜風是一種自身免疫性疾病,以皮膚黏膜色素脫失為特征,其病因及發(fā)病機制尚未明確。本課題組已應用莫諾苯宗構建與人類白癜風相似性極高的動物模型[1]。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)特殊的多酚化學結構使其具有很強的抗氧化、抗癌、抗突變和抗病毒等多種生物學作用[2-3]。補骨脂能促使黑素的合成。本研究通過EGCG、補骨脂干預莫諾苯宗誘導的白癜風樣小鼠,進一步驗證該模型與人類白癜風的相似性。

一、材料

1.動物來源:C57BL/6小鼠,雌性,體質(zhì)量(15.5±2.0)g,來源于上海斯萊克實驗動物有限公司[生產(chǎn)許可證號SCXK(滬)2007-0005,檢疫合格證號:0005854]。

2.主要試劑和儀器:莫諾苯宗(美國Sigma公司)由杭州市第三人民醫(yī)院制劑室制備成不同濃度乳膏,5%EGCG乳膏(中國藥科大學藥物科學研究院),7%補骨脂乳膏(中國藥科大學藥物科學研究院),10%正常山羊血清、二抗、CD8單克隆抗體(北京中杉金橋公司)。皮膚共聚焦激光掃描顯微鏡(RCM,美國微維VIVASCOPE 1500型,波長830 nm,最大輸出16.0 mW);免疫熒光共聚焦激光掃描顯微鏡[CLSM,Fluo View FV1000型(日本Olympus公司),波長488 nm]。

二、方法

1.分組:C57BL/6小鼠40只,隨機分為陰性對照組、模型組、EGCG組、補骨脂組,每組10只,脫去小鼠背部2 cm×2 cm區(qū)域黑色毛,用刮勺稍用力涂藥直至吸收。陰性對照組:每天涂抹凡士林乳膏50 mg 1次;模型組:每天涂抹40%莫諾苯宗乳膏50 mg 1次;EGCG組:每天先予以5%EGCG 50 mg 1次,間隔4 h后再予以40%莫諾苯宗乳膏50 mg 1次;補骨脂組:每天先予以7%補骨脂50 mg 1次,間隔4 h后再予以40%莫諾苯宗乳膏50 mg 1次。各組小鼠連續(xù)用藥50 d,停藥后連續(xù)15 d肉眼觀察小鼠毛發(fā)顏色和脫色面積變化,通過RCM觀察皮膚脫色情況。

2.皮膚脫色評估:每日觀察皮膚脫色,并記錄積分[4],計算脫色面積指數(shù)(用藥與非用藥部位評分合計/2)。將脫色部位分為用藥部位和非用藥部位,每個部位總分為5分,每只小鼠共10分。小鼠皮膚脫色評分標準為:0分皮膚無脫色:1分皮膚脫色面積0～10%;2分皮膚脫色面積11%～25%;3分皮膚脫色面積26%～50%;4分皮膚脫色面積51%～75%:5分皮膚脫色面積76%～100%。

3.毛發(fā)脫色評估:見文獻[5]。

4.組織病理:實驗結束后處死豚鼠,并于用藥部位中心取1 cm×1 cm皮膚,用4%甲醛固定用藥部位及其周圍的皮膚組織,石蠟包埋切片,HE染色。

5.CLSM檢測:方法見文獻[5]。

6.統(tǒng)計學方法:應用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析,數(shù)據(jù)測定結果以±s表示,組間差異比較采用方差檢驗,兩兩比較采用LSD-t檢驗,P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

三、結果

1.脫色的發(fā)生率和時間:模型組、EGCG組和補骨脂組小鼠用藥部位全部出現(xiàn)脫色(圖1a、1c、1d),非用藥部位脫色斑的發(fā)生數(shù)分別為5只、2只和5只。EGCG組、補骨脂組和模型組小鼠用藥部位最早出現(xiàn)脫色斑的時間分別為實驗第23天、第17天和第15天,平均脫色時間分別為29.3 d、19.9 d和16.7 d;非用藥部位出現(xiàn)脫色斑的開始時間分別為實驗第35天、第27天和第26天,平均脫色時間分別為36 d、27.6 d和26.6 d。

圖1 模型組、陰性對照組、表沒食子兒茶素沒食子酸酯組和補骨脂組小鼠用藥部位脫色情況 1a:模型組;1b:陰性對照組;1c:表沒食子兒茶素沒食子酸酯組;1d:補骨脂組

2.脫色面積和穩(wěn)定性:模型組、EGCG組、補骨脂組小鼠用藥部位脫色面積指數(shù)分別為4.00±0.00、2.11±0.54、2.84±0.79,非用藥部位分別為2.4±0.55、1.12±0.70、1.70±0.53,EGCG組和補骨脂組小鼠用藥部位的脫色面積指數(shù)均低于模型組,三組之間差異有統(tǒng)計學意義(F=14.17,P＜0.05),EGCG組和補骨脂組間差異也有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。三組非用藥部位的脫色面積指數(shù)差異同樣有統(tǒng)計學意義(F=9.46,P＜0.05),EGCG組較補骨脂組脫色面積指數(shù)小(P＜0.05)。停藥后15 d內(nèi),模型組中有1只小鼠出現(xiàn)少量復色,3只脫色面積有少量擴大,而EGCG組有5只小鼠出現(xiàn)不同程度復色,補骨脂組有3只小鼠出現(xiàn)復色跡象,但后兩組小鼠均沒有出現(xiàn)脫色面積擴大現(xiàn)象。

3.淋巴細胞浸潤數(shù)量的差異:組織病理HE染色顯示,EGCG組脫色斑及其周圍皮膚的真皮淺層僅有少量淋巴細胞浸潤,補骨脂組浸潤的淋巴細胞較EGCG組多。

4.CD8+T細胞表達量差異:陰性對照組免疫熒光切片只有極少量CD8+T細胞表達,其單位面積熒光強度為61.132±2.034;模型組表達CD8+T細胞明顯,為260.644±9.023;EGCG組可見極少量CD8+T細胞表達,為101.211±9.017;補骨脂組可見一些高亮CD8+T細胞表達,為192.187±10.322。后三組間CD8+T細胞表達量差異有統(tǒng)計學意義(F=13.44,P＜0.05),EGCG組較補骨脂組CD8+T細胞表達量少(P＜0.05)。

四、討論

莫諾苯宗是一種皮膚脫色劑,主要通過酪氨酸酶與活性氧簇(ROS)的相互作用[6],誘導CD8+T細胞和CD4+T細胞發(fā)生反應,從而引起自身免疫反應,最終導致色素脫失[7]。因此本研究利用莫諾苯宗誘導小鼠出現(xiàn)白癜風樣色素脫失,為探討白癜風發(fā)病機理研究及藥物開發(fā)建立合適的白癜風動物模型。

本研究觀察了EGCG和補骨脂對莫諾苯宗誘導小鼠脫色的影響,結果顯示,EGCG和補骨脂均有干預作用,且EGCG干預作用更強。干預作用主要表現(xiàn)為開始出現(xiàn)脫色斑時間延遲,面積縮小,非用藥部位脫色斑的發(fā)生率相應降低及復色現(xiàn)象明顯。停藥后15 d內(nèi),EGCG組有5只小鼠出現(xiàn)不同程度復色,補骨脂組有3只小鼠有復色現(xiàn)象,兩組均未出現(xiàn)擴大現(xiàn)象。RCM觀察復色部位的皮膚,可見樹突狀、折光明亮的黑素細胞,這一表現(xiàn)與人類白癜風患者治療后出現(xiàn)復色的皮膚表現(xiàn)一致[8]。EGCG組局部CD8+T細胞浸潤明顯減少,這可能與EGCG的抗氧化、抗炎作用,增強機體免疫功能,降低致炎因子的產(chǎn)生和分泌有關。

綜上所述,本研究結果顯示,EGCG和補骨脂對莫諾苯宗誘導的白癜風樣小鼠具有干預作用,EGCG其干預效果明顯優(yōu)于補骨脂,提示EGCG可用于藥物篩選研究。另外,本研究也進一步證明了莫諾苯宗誘導的白癜風樣小鼠模型與人類白癜風具有共性,提示該模型可用于白癜風相關研究的動物模型。

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[3]Butt MS，Sultan MT.Green tea:nature′s defense against malignancies[J].Crit Rev Food Sci Nutr，2009，49(5):463-473.

[4]Harris JE，Harris TH，Weninger W，et al.A mouse model of vitiligo with focused epidermaldepigmentation requires IFN-γ for autoreactive CD8+T-cell accumulation in the skin[J].J Invest Dermatol，2012，132(7):1869-1876.

[5]祝逸平，王遂泉，李陽，等.局部針刺對莫諾苯宗誘導C57BL/6小鼠白癜風樣模型的影響[J].中華皮膚科雜志，2014，47(1):26-29.

[6]van den Boorn JG，Melief CJ，Luiten RM.Monobenzone-induced depigmentation:from enzymatic blockade to autoimmunity[J].Pigment Cell Melanoma Res，2011，24(4):673-679.

[7]van den Boorn JG，Konijnenberg D，Tjin EP，et al.Effective melanoma immunotherapy in mice by the skin-depigmenting agent monobenzone and the adjuvants imiquimod and CpG[J].PLoS One，2010，5(5):e10626.

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2014-03-24)

(本文編輯:周良佳 顏艷)

Effect of epigallocatechin gallate and fructus psoraleae on the induction of vitiligo-like depigmentation by monobenzone in mice

Wang Cui*，Zhu Yiping，Xu Ai′e.*Hangzhou Clinical College Affiliated to Anhui Medical University，Hangzhou 310009，China

Xu Ai′e，Email:xuaiehz@msn.com

ObjectiveTo study the effect of epigallocatechin gallate(EGCG)andfructus psoraleaeon the induction of vitiligo-like depigmentation by monobenzone in mice.MethodsForty C57BL/6 mice were included in this study.Hairs in an area measuring 2 cm × 2 cm in size were shaved on the back of each of these mice.Then，the mice were randomly and equally divided into four groups to be topically treated with vaseline cream(negative control group)，monobenzone 40%cream(model group)，EGCG 5%cream followed by monobenzone 40%cream(EGCG group)，fructus psoraleae7%cream followed by monobenzone 40%cream(fructus psoraleaegroup)，on the shaved area，respectively，for 50 consecutive days.Depigmentation of skin and hairs was observed daily by naked eyes for 15 days after drug withdrawal.At the end of the study，all the mice were sacrificed，and skin specimens were resected from the tested regions in them.Hematoxylin and eosin(HE)staining was performed to observe lymphocyte infiltration，and immunofluorescence assay to estimate the frequency of CD8+T cells.ResultsDepigmentation was observed in monobenzone-induced and-uninduced sites in the model group，and in monobenzone-induced sites in all the mice in the EGCG group andfructus psoraleaegroup，but in neither monobenzone-induced nor-uninduced sites ih the negative control group.The average time for the appearance of depigmentation at monobenzone-induced sites was 16.7，29.3 and 19.9 days in the model group，EGCG group andfructus psoraleaegroup respectively.The depigmentation area index at monobenzone-induced sites was 4.00±0.00 in the model group，significantly different from that in the EGCG group andfructus psoraleaegroup(2.11 ± 0.54 and 2.84±0.79，bothP＜0.05).Significant differences were also observed in depigmentation area index at monobenzone-induced sites among the model group，EGCG group andfructus psoraleaegroup(F=14.173，P＜0.05)，and at monobenzone-uninduced sites betweenfructus psoraleaegroup and EGCG group(P＜0.05).The frequency(expressed as fluorescence intensity)of CD8+T cells was significantly lower in the EGCG group andfructus psoraleaegroup than in the model group，and significantly different between EGCG group andfructus psoraleaegroup(P＜ 0.05).Conclusions Both EGCG andfructus psoraleae，especially EGCG，can interfere with the induction of vitiligo-like depigmentation of skin and hairs by monobenzone in mice.The mouse model of vitiligolike depigmentaion in this study shows higher similarity to human vitiligo.

Vitiligo;Propyl gallate;PSORALEA CORYLIFOLIA;Disease models，animal

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.12.020

國家自然科學基金面上項目(81271758);省部共建項目基金(WKJ2012-2-036);杭州科技局重大創(chuàng)新項目(20122513A02);浙江省自然科學基金(LY13H110001,Y2111310)

310009杭州,安徽醫(yī)科大學附屬杭州臨床學院(王翠);杭州市第三人民醫(yī)院皮膚科(祝逸平、許愛娥)通信作者:許愛娥,Email:xuaiehz@msn.com