王洪斌 , 李信書 宋秀梅 吳 言 李士虎 閻斌倫

(1.淮海工學(xué)院 海洋學(xué)院, 江蘇 連云港 222005; 2.江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇連云港 222005)

在水生態(tài)系統(tǒng)中, 浮游藻類是海洋生態(tài)系統(tǒng)初級(jí)生產(chǎn)力代表, 也是海洋生態(tài)系統(tǒng)中食物鏈的重要環(huán)節(jié),其種類組成、數(shù)量變化往往也是所處環(huán)境綜合作用的結(jié)果, 浮游藻類對(duì)外部環(huán)境因子的變化非常敏感[1]。因此, 浮游藻類群落組成的改變能在一定程度上反映水環(huán)境的狀態(tài)。目前, 越來(lái)越多的研究開(kāi)始關(guān)注浮游藻類與環(huán)境因子之間的關(guān)系[2]。核酮糖1, 5-二磷酸羧化/氧化酶( RubisCO)是浮游藻類光合作用的關(guān)鍵酶,具有催化 CO2還原和 1, 5-二磷酸核酮糖氧化的雙重功能, 廣泛存在于藻類和高等植物中[3]。RubisCO 大亞基基因(rbcL) 是研究物種間系統(tǒng)學(xué)關(guān)系比較恰當(dāng)?shù)臉?biāo)志基因,rbcL基因沒(méi)有內(nèi)含子結(jié)構(gòu), 可以直接PCR, 廣泛應(yīng)用于浮游藻類系統(tǒng)學(xué)及多樣性研究[4]。

海州灣位于江蘇省北部連云港沿海, 近年來(lái),由于城市化進(jìn)程的快速發(fā)展, 大量含有高濃度氮、磷等營(yíng)養(yǎng)物的污染物排入沿海, 使得近海的富營(yíng)養(yǎng)化問(wèn)題十分嚴(yán)重, 赤潮頻繁發(fā)生[5]。以往也有不少學(xué)者,對(duì)海州灣的理化因子與浮游植物的數(shù)量變化關(guān)系進(jìn)行了研究[6], 并發(fā)現(xiàn)浮游植物的數(shù)量變化與環(huán)境因素的變化密切相關(guān)。而針對(duì)條斑紫菜養(yǎng)殖行為導(dǎo)致水質(zhì)條件改變, 從而引起浮游藻類群落結(jié)構(gòu)及組成的變化研究未見(jiàn)報(bào)道。

作者分別提取了江蘇海州灣條斑紫菜非養(yǎng)殖區(qū)及養(yǎng)殖區(qū)的浮游藻類總DNA, PCR方法擴(kuò)增浮游藻類rbcL片段, 構(gòu)建了條斑紫菜非養(yǎng)殖區(qū)及養(yǎng)殖區(qū)浮游藻類rbcL片段質(zhì)粒文庫(kù), 根據(jù)rbcL序列分析, 研究了海州灣條斑紫菜養(yǎng)殖對(duì)浮游藻類遺傳多樣性及群落結(jié)構(gòu)的研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品來(lái)源及試劑

2012年12 月, 于江蘇省海州灣近海條斑紫菜非養(yǎng)殖海區(qū)(1、3、5、7 )和養(yǎng)殖海區(qū)( 2、4、6、8 )采集表層海水, 共 8個(gè)樣點(diǎn) (圖1)。于每個(gè)樣點(diǎn)(距水面0.2~0.3 m處)取200 mL表層水, 分裝在已滅菌的PVC瓶中, 所取水樣置于保溫箱中立刻運(yùn)往實(shí)驗(yàn)室,于4℃黑暗保存, 且所有樣品都在一周內(nèi)進(jìn)行分析。

PCR引物合成、測(cè)序由上海桑尼生物科技有限公司完成; pMD18-T載體購(gòu)自寶生物(大連)工程有限公司;Escherichia coliJF1125由本實(shí)驗(yàn)室保存; 其他分子生物學(xué)試劑均為分析純。

圖1 采樣點(diǎn)位置示意圖Fig.1 Map of sampling sites

1.2 海水中浮游藻類總DNA的提取

養(yǎng)殖海區(qū)(2、4、6、8)各采樣點(diǎn)分別取水樣100 mL混勻, 非養(yǎng)殖海區(qū)水樣處理同養(yǎng)殖區(qū)。400 mL冷藏水樣10 000 r/min、離心10 min, 棄上清, 沉淀中加入460 μL裂解緩沖液(250 mmoL Tris-HCl pH 8.0,60 mmoL EDTA), 340 μL 10%SDS, 蛋白酶 K(終質(zhì)量濃度 0.2 mg/mL)15 μL, 37 ℃溫浴 3 h, 10 000 r/min、離心10 min, 上清轉(zhuǎn)至潔凈1.5 mL離心管, 等體積酚氯仿抽提, 12 000 r/min、離心1 min, 上清液用2倍體積的異丙醇4 ℃沉淀過(guò)夜, 12 000 r/min、離心10 min, 棄上清, 沉淀用50 μL TE緩沖液溶解, -20 ℃保存[7]。

1.3 PCR擴(kuò)增rbcL基因及rbcL質(zhì)粒文庫(kù)構(gòu)建

以海水浮游藻類總DN A為模板, PCR法擴(kuò)增獲得海洋浮游藻類rbcL片段。根據(jù)Ⅰ型 RubisCO 大亞基氨基酸保守區(qū)( KPKLGLS 和 VVGKLEG)[8]設(shè)計(jì)PCR 引物。引物序列分別為5′-AA(AG)CC(TA)AA(AG)(TC)TAGG(TG)(CT)T(AT)TC-3′和 5′-CC(TC)TC(TC)A(AG)(TC) TTACC(AT)AC(GAT)AC-3′。PCR 反應(yīng)體系: 模板DNA為50 ng(1.5 μL), dNTP為0.2 mmol ,正反向引物各為 0.2 μmol, Taq 酶 2 unit, buffer 5 μL,50 μL反應(yīng)體系[9]。 PCR反應(yīng)條件: 95 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性1 min, 48 ℃復(fù)性2 min, 72 ℃延伸1 min,72 ℃終止延伸10 min, 35循環(huán)。PCR 產(chǎn)物割膠回收,與pMD18-T載體( TaKaRa公司)連接, 轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coliJF1125, 獲得rbcL片段質(zhì)粒文庫(kù)。隨機(jī)挑選重組子, 抽提質(zhì)粒, 由上海桑尼生物科技有限公司完成測(cè)序。經(jīng)序列比對(duì)并用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 條斑紫菜養(yǎng)殖對(duì)浮游藻類群落結(jié)構(gòu)的影響

PCR產(chǎn)物約300bp, 構(gòu)建浮游藻類rbcL片段質(zhì)粒文庫(kù)(養(yǎng)殖區(qū) DrbcL, 非養(yǎng)殖區(qū) CrbcL)。文庫(kù)中隨機(jī)選擇 50個(gè)陽(yáng)性克隆, 測(cè)定序列, 并用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖2, 圖3), 根據(jù)序列比對(duì)及進(jìn)化樹(shù)顯示的遺傳距離分析確定養(yǎng)殖及非養(yǎng)殖海區(qū)的浮游藻類的群落結(jié)構(gòu)組成。本研究使用的PCR引物是Ⅰ型rbcL基因特異的, 而甲藻rbcL基因?qū)儆冖蛐蚚9]。因此, 本研究使用的引物無(wú)法擴(kuò)增甲藻rbcL基因。結(jié)果顯示, 非養(yǎng)殖區(qū)發(fā)現(xiàn)8種海洋微藻, 分別為隱鞭藻(Cryptomonas)、異彎藻(Heterosigma)、塔胞藻(Pyramimonas mantoriae chicroplast)、全溝藻(Teleaulax amphioxeia)、筒柱藻(Cylindrotheca)、小球藻(Chlorella)、海鏈藻(Thalassiosira)、骨條藻(Skeletonema)。養(yǎng)殖區(qū)發(fā)現(xiàn) 10種海洋微藻, 分別為異絲藻(Heterothrix debilis)、杜氏藻(Dunaliella)、 隱鞭藻(Cryptomonas)、骨條藻(Skeletonema)、小球藻(Chlorella)、菱形藻(Nitzschia longissima)、嚎殼藻(Ostreobium quekettii)、鏈帶藻(Desmodesmus pseudoserratus)、小環(huán)藻(Cyclotella)、擬伊藻(Ahnfeltiopsis leptophylla)。海洋中浮游藻類種類繁多, 影響其種類及豐度的主要因素為浮游藻類自身消長(zhǎng)的特性、水體條件及浮游動(dòng)物等的捕食。浮游藻類的豐度及組成受紫菜養(yǎng)殖的影響, 如骨條藻在養(yǎng)殖區(qū)為優(yōu)勢(shì)種群, 但在非養(yǎng)殖區(qū)卻變?yōu)榱觿?shì)種群。養(yǎng)殖區(qū)和非養(yǎng)殖區(qū)雖然只隨機(jī)抽取了50個(gè)序列, 但是這些序列至少覆蓋了一個(gè)優(yōu)勢(shì)種群, 如養(yǎng)殖區(qū)的異絲藻及非養(yǎng)殖區(qū)的隱鞭藻。隱鞭藻和小球藻為兩海區(qū)所共有的優(yōu)勢(shì)類群且覆蓋克隆數(shù)比例均較高, 說(shuō)明小球藻與隱鞭藻的適應(yīng)性強(qiáng)。因紫菜養(yǎng)殖和非養(yǎng)殖區(qū)相距較近,海水隨潮汐和風(fēng)浪而流動(dòng), 所以紫菜養(yǎng)殖和非養(yǎng)殖區(qū)的物化及環(huán)境生態(tài)因子既有差異也有相同之處。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí), 紫菜養(yǎng)殖和非養(yǎng)殖區(qū)因紫菜光合作用導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)鹽存在顯著性差異[11-12], 這種差異勢(shì)必對(duì)浮游藻類群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。

2.2 條斑紫菜養(yǎng)殖對(duì)浮游藻類遺傳多樣性的影響

條斑紫菜養(yǎng)殖及非養(yǎng)殖海區(qū)浮游藻類類群覆蓋克隆數(shù)見(jiàn)表1。依據(jù)覆蓋克隆數(shù)的百分比, 非養(yǎng)殖區(qū)8種海洋微藻為隱鞭藻(22%)、異彎藻(18%)、塔胞藻(14%)、全溝藻(13%)、筒柱藻(12%), 小球藻(12%),海鏈藻(6%), 骨條藻(2%), 見(jiàn)圖2。隱鞭藻、異彎藻在非養(yǎng)殖區(qū)所占比例較大, 含量豐富; 海鏈藻, 骨條藻多占比例較小。養(yǎng)殖區(qū) 10種海洋微藻為異絲藻(22%)、杜氏藻(12%)、 隱鞭藻(12%)、骨條藻(12%)、小球藻(10%)、菱形藻(8%)、嚎殼藻(6%)、鏈帶藻(6%)、小環(huán)藻(6%)、擬伊藻(2%), 見(jiàn)圖3。異絲藻在養(yǎng)殖區(qū)所占比例較大, 優(yōu)勢(shì)度明顯; 鏈帶藻, 菱形藻等類群占比例差不多, 為6%~12%。如果將覆蓋克隆數(shù)大于5(10%) 的類群定義為優(yōu)勢(shì)類型, 那么非養(yǎng)殖區(qū)的優(yōu)勢(shì)類群有隱鞭藻(22%), 異彎藻(18%), 塔胞藻(14%)全溝藻(13%), 小球藻(12%), 筒柱藻(12%),養(yǎng)殖區(qū)的優(yōu)勢(shì)類群有異絲藻(22%), 杜氏藻(12%),骨條藻(12%), 隱鞭藻(12%), 小球藻(10%)。優(yōu)勢(shì)類群的形成不僅僅決定于營(yíng)養(yǎng)、溫度等環(huán)境條件, 還與物種生理特性相關(guān), 物種間競(jìng)爭(zhēng)也會(huì)影響到優(yōu)勢(shì)物種的形成[13]。15種浮游藻類類群中只有 3種(隱鞭藻, 骨條藻及小球藻)為兩海區(qū)共有, 其他浮游藻類類群均為不同區(qū)域所有, 證實(shí)條斑紫菜養(yǎng)殖區(qū)及非養(yǎng)殖區(qū)浮游藻類群落組成差異顯著。杜氏藻、異絲藻為養(yǎng)殖區(qū)所特有的, 異絲藻含量極高, 養(yǎng)殖區(qū)內(nèi)的其他幾類浮游藻類類群的含量接近, 異彎藻,全溝藻, 塔胞藻, 屬于非養(yǎng)殖區(qū)特有優(yōu)勢(shì)類群。兩海區(qū)共有的浮游藻類類群中骨條藻的豐度差異極大,在非養(yǎng)殖區(qū)所占比例極小; 小球藻與隱鞭藻在兩個(gè)區(qū)域中的豐富度都較高, 可能由于隱鞭藻和小球藻對(duì)溫度、營(yíng)養(yǎng)條件及其他物化因子具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力, 廣泛存在于各個(gè)區(qū)域, 并且形成優(yōu)勢(shì)類群。而非共有的 12個(gè)浮游藻類類群對(duì)環(huán)境因子需求較高,適應(yīng)力較窄, 只有在特定水體條件下才能夠大量繁殖, 如異絲藻只在紫菜養(yǎng)殖區(qū)大量存在, 非養(yǎng)殖區(qū)沒(méi)有, 表明條斑紫菜養(yǎng)殖區(qū)的水體環(huán)境等因素適宜此類浮游藻類生長(zhǎng)繁殖, 當(dāng)生長(zhǎng)條件適宜的時(shí)候, 具有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)的物種將快速繁殖, 大量的利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),抑制其他藻類的生長(zhǎng)而迅速成為優(yōu)勢(shì)種群。至于異絲藻與條斑紫菜養(yǎng)殖耦合的生態(tài)條件有待進(jìn)一步研究。

圖2 非養(yǎng)殖區(qū)浮游藻類進(jìn)化樹(shù)Fig.2 System evolution tree of phytoplankton in natural region

圖3 養(yǎng)殖區(qū)浮游藻類進(jìn)化樹(shù)Fig.3 System evolution tree of phytoplankton in mariculture zone

表1 海州灣養(yǎng)殖和非養(yǎng)殖海區(qū)浮游藻類分布Tab.1 Distribution of Phytoplankton in mariculture zone and natural region in Haizhou bay

2.3 條斑紫菜養(yǎng)殖對(duì)浮游藻類豐度的影響

物種多樣性指的是群落中物種數(shù)目的多少, 它是衡量群落的規(guī)模和重要性的基礎(chǔ), 而以往研究多側(cè)重于營(yíng)養(yǎng)鹽濃度對(duì)浮游植物的上行效應(yīng), 近年來(lái),隨著研究深入, 浮游植物多樣性對(duì)營(yíng)養(yǎng)鹽結(jié)構(gòu)變化的響應(yīng)也引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[14-15]。表2顯示, 非養(yǎng)殖區(qū)的香農(nóng)指數(shù)小于 3的浮游藻類類群,占了總類群的 50%, 而養(yǎng)殖區(qū)的香農(nóng)指數(shù)小于 3的只占1個(gè), 占了總類群的10%, 養(yǎng)殖及非養(yǎng)殖海區(qū)的香農(nóng)指數(shù)均值為 3.654/3.273, 養(yǎng)殖區(qū)的浮游藻類香農(nóng)指數(shù)普遍高于非養(yǎng)殖區(qū), 養(yǎng)殖區(qū)生物多樣性豐富,與上述結(jié)論一致。其原因可能是條斑紫菜養(yǎng)殖行為導(dǎo)致本海區(qū)的物化及其他環(huán)境生態(tài)改變, 特別是N/P的變化, 營(yíng)養(yǎng)鹽結(jié)構(gòu)改變會(huì)導(dǎo)致浮游植物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化, 影響到海洋生態(tài)系統(tǒng)的多樣性和穩(wěn)定性[16]。非養(yǎng)殖區(qū)的均勻度指數(shù)差異較大, 養(yǎng)殖區(qū)的均勻度指數(shù)差異較小, 養(yǎng)殖區(qū)平均均勻度為 1.040,非養(yǎng)殖區(qū)的平均均勻度為 1.090, 養(yǎng)殖區(qū)的平均均勻度指數(shù)小于非養(yǎng)殖區(qū), 可見(jiàn)非養(yǎng)殖區(qū)的浮游藻類的物種分布較為均勻, 群落的成熟度與穩(wěn)定性比養(yǎng)殖區(qū)高。說(shuō)明不同種類浮游植物的營(yíng)養(yǎng)鹽利用方式及生長(zhǎng)勢(shì)的差異是影響其群落競(jìng)爭(zhēng)格局的關(guān)鍵因素[17],非養(yǎng)殖區(qū)因無(wú)條斑紫菜存在, 海區(qū)物化及各種環(huán)境因子較穩(wěn)定, 浮游藻類群落的穩(wěn)定性較高。

3 結(jié)論

作者運(yùn)用PCR法擴(kuò)增浮游藻類核酮糖1, 5-二磷酸羧化/氧化酶大亞基(rbcL) 基因片段, 構(gòu)建了條斑紫菜養(yǎng)殖及非養(yǎng)殖海區(qū)浮游藻類的rbcL片段質(zhì)粒文庫(kù)。隨機(jī)選擇文庫(kù)50個(gè)克隆并測(cè)序, 經(jīng)比對(duì)分析,條斑紫菜非養(yǎng)殖區(qū)發(fā)現(xiàn) 8種海洋微藻, 分別為隱鞭藻、異彎藻、塔胞藻、全溝藻、筒柱藻, 小球藻, 海鏈藻, 骨條藻。養(yǎng)殖區(qū)共發(fā)現(xiàn) 10種海洋微藻, 分別為: 異絲藻、杜氏藻、 隱鞭藻、骨條藻、小球藻、菱形藻、嚎殼藻、鏈帶藻、小環(huán)藻、擬伊藻。

浮游藻類類群中只有 3種(隱鞭藻, 骨條藻及小球藻)為兩個(gè)海區(qū)共有, 其他浮游藻類類群均為不同海區(qū)所有, 證實(shí)條斑紫菜養(yǎng)殖及非養(yǎng)殖海區(qū)浮游藻類群落組成差異顯著。杜氏藻、異絲藻為養(yǎng)殖區(qū)所特有的, 異絲藻優(yōu)勢(shì)極高, 養(yǎng)殖區(qū)內(nèi)的其他幾類浮游藻類類群的含量接近; 異彎藻, 全溝藻, 塔胞藻,屬于非養(yǎng)殖區(qū)特有優(yōu)勢(shì)類群。

表2 海州灣養(yǎng)殖和非養(yǎng)殖區(qū)浮游藻類多樣性Tab.2 Genetic diversity of Phytoplankton in mariculture zone and natural region in Haizhou bay

實(shí)驗(yàn)證實(shí), 條斑紫菜養(yǎng)殖海區(qū)浮游藻類遺傳多樣性豐富, 而群落的成熟度與穩(wěn)定性以非養(yǎng)殖區(qū)為高。說(shuō)明表層海水浮游藻類群落結(jié)構(gòu)及組成是動(dòng)態(tài)的, 條斑紫菜的養(yǎng)殖改變了浮游藻類群落結(jié)構(gòu)及遺傳多樣性。養(yǎng)殖海區(qū)浮游藻類的多樣性及豐富度高于非養(yǎng)殖海區(qū), 而且養(yǎng)殖海區(qū)出現(xiàn)的優(yōu)勢(shì)藻類均為海州灣非赤潮優(yōu)勢(shì)藻[18], 多樣性豐富降低了單一海洋微藻因富營(yíng)養(yǎng)化而導(dǎo)致的爆發(fā)性增長(zhǎng)的可能, 減少赤潮發(fā)生的頻率。浮游藻類群落結(jié)構(gòu)及遺傳多樣性改變對(duì)于條斑紫菜養(yǎng)殖行為使海域生態(tài)環(huán)境的修復(fù)具有重要意義。

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