李玲輝+冉小庫(kù)+徐煜彬+李斌+竇德強(qiáng)??

摘 要 通過(guò)多種分離方法聯(lián)合應(yīng)用，將白術(shù)化學(xué)成分拆分成5個(gè)部分，各拆分組分組內(nèi)指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)表明，拆分工藝穩(wěn)定、重現(xiàn)性良好。采用差異度表征中藥化學(xué)拆分組分間的不交叉程度。利用主成分分析、聚類(lèi)分析及夾角余弦、平方歐式距離和生藥峰面積交叉分析法對(duì)白術(shù)化學(xué)拆分組分進(jìn)行不交叉的定性與定量分析，表明白術(shù)化學(xué)拆分組分組間差異度不低于85%。其中生藥峰面積差異度分析法是在中藥指紋圖譜基礎(chǔ)上建立的表征中藥拆分組分差異度的新方法。通過(guò)與不同分析方法比較，發(fā)現(xiàn)其較適合中藥藥效或藥性物質(zhì)研究中的拆分組分間不交叉程度的評(píng)價(jià)。

關(guān)鍵詞 白術(shù)； 化學(xué)組分拆分； 組間差異度分析

1 引言

中藥活性或有效組（成）分的研究，一般通過(guò)對(duì)水煎液或醇提液進(jìn)行化學(xué)拆分，以評(píng)價(jià)最強(qiáng)活性組分。但對(duì)于各拆分組分之間的成分交叉性鮮有評(píng)價(jià)，最終為有效組分的確定增加了不確定因素。若中藥各組分交叉太大，活性成分在各組分中分散，評(píng)價(jià)活性成分時(shí)會(huì)引起“丟失”。近年來(lái)，匡海學(xué)等提出“中藥性味可拆分性、可組合性的研究方法”[1]。但目前尚沒(méi)有不交叉性的定量分析方法。本研究以白術(shù)為例，通過(guò)定性和定量分析，建立其拆分組分間的不交叉性評(píng)價(jià)的新方法，為后續(xù)有效組分及性味組分的評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。

白術(shù)為菊科植物白術(shù)（Atractylodes macrocephalaKoidz.）[2]，其主要化學(xué)成分有揮發(fā)油、白術(shù)內(nèi)酯、聚炔、多糖等化合物[3，4]。白術(shù)具有多種藥理作用[5～8]。目前多采用高效液相色譜法（HPLC）對(duì)中藥化學(xué)組分進(jìn)行表征，并采用主成分分析方法進(jìn)行不交叉性的定性分析[9]?，F(xiàn)雖已有文獻(xiàn)報(bào)道了中藥組分的拆分方法，但并沒(méi)有交叉度分析的具體方法[10，11]。本研究將常見(jiàn)的化學(xué)分析法及軟件應(yīng)用于組分間交叉度分析中，對(duì)中藥拆分組分進(jìn)行了不交叉性的定性和定量分析。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Agilent1260高效液相色譜系統(tǒng)（美國(guó)Agilent科技公司），配有DAD檢測(cè)器，在線脫氣機(jī)，自動(dòng)進(jìn)樣器；HH S型水浴鍋和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義市予華儀器有限公司）；FD 1A 50冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；DZF 6050真空干燥箱（上海一恒科技有限公司）；PCJ 10超純水機(jī)（品成科技有限公司）。

D101大孔吸附樹(shù)脂（滄州寶恩科技有限公司）；白術(shù)藥材2012年11月采于浙江于潛，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室王冰教授鑒定為菊科植物白術(shù)（Atractylodes macrocephalaKoidz.） 的根莖；甲醇、乙腈（色譜純，瑞典Oceanpak Alexative Chemical公司）；超純水；其余試劑均為分析純。

2.2 HPLC色譜條件

Kromasil C18柱（250 mm ×4. 6 mm，5 μm），二極管陣列檢測(cè)器（DAD） ，以乙腈（A） 水（B）為流動(dòng)相梯度洗脫：0～5 min， 3%A； 5～10 min， 3%～10% A； 10～25 min， 10%～40% A； 25～40 min， 40%～60% A； 40～50 min， 60%～100% A； 50～60 min， 100% A； 60～70 min，100%～3% A； 流速1.0 mL/min； 柱溫25 ℃； 檢測(cè)波長(zhǎng)242 nm。

2.3 白術(shù)化學(xué)組分拆分方法

取白術(shù)藥材100 g，粉碎，水蒸汽蒸餾得揮發(fā)油組分。蒸餾后的水煎液濃縮至100 mL，加95%乙醇調(diào)醇濃度至75%，0～5 ℃放置過(guò)夜，傾出上清液，收集沉淀，沉淀依次用95%乙醇、丙酮洗滌3次，冷凍干燥后，得多糖組分。醇沉后得到的上清液揮至無(wú)醇味，加水至100 mL，石油醚60～90 ℃萃取，萃取至石油醚層顏色較淡，得石油醚Ⅰ。石油醚萃取后藥液揮至無(wú)石油醚味，加水至300 mL，加于已處理的D101大孔吸附樹(shù)脂柱（400 mL濕樹(shù)脂）。洗脫液依次為水、80%乙醇，洗脫量依次為10倍和4倍柱體積，收集相應(yīng)的洗脫液。水洗脫部分減壓濃縮后冷凍干燥，得樹(shù)脂水洗組分。醇洗部分濃縮至25 mL，再經(jīng)石油醚60～90 ℃萃取，萃取至石油醚無(wú)顏色，得石油醚Ⅱ。合并石油醚Ⅰ和石油醚Ⅱ，得石油醚組分。石油醚萃取后的樹(shù)脂醇洗部分，揮至無(wú)醇味后冷凍干燥，得樹(shù)脂醇洗組分。

重復(fù)10次工藝，將白術(shù)化學(xué)成分拆分至大分子多糖組分及4個(gè)小分子組分。采用HPLC法建立4個(gè)小分子組分的指紋圖譜，并分別建立其公共指紋圖譜。

采用硅膠柱、ODS開(kāi)放柱和制備液相等色譜方法，從白術(shù)拆分各組分中得到的化合物，通過(guò)NMR技術(shù)結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道確定了其化學(xué)結(jié)構(gòu)，并對(duì)指紋圖譜進(jìn)行表征。

2.4 白術(shù)拆分組分差異度評(píng)價(jià)方法的建立

由于多糖經(jīng)純化后與小分子部分交叉度很小，因此本研究?jī)H對(duì)小分子的揮發(fā)油組分、石油醚組分、樹(shù)脂醇洗組分和樹(shù)脂水洗組分進(jìn)行不交叉性分析。

2.4.1 定性分析

主要采用SPSS13.0軟件對(duì)2.3節(jié)建立的HPLC指紋圖譜的數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析[12]和聚類(lèi)分析[13]。為消除原始數(shù)據(jù)數(shù)量級(jí)的差異對(duì)主成分分析和聚類(lèi)分析結(jié)果的影響， 使每個(gè)數(shù)據(jù)對(duì)分類(lèi)有相近的貢獻(xiàn)，需對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行生藥折合和規(guī)范化處理，以得到相應(yīng)的規(guī)范值。具體方法是將每個(gè)組分的指紋圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)出并存儲(chǔ)為CSV 格式，每組分舍去小于圖譜平均峰面積5%的色譜峰，按生藥量折合及規(guī)范化處理后，再組合成為一個(gè)矩陣，每行對(duì)應(yīng)的是不同的樣品，每列對(duì)應(yīng)的是色譜圖中出現(xiàn)峰的峰面積，采用兩種方法分別進(jìn)行分析。

2.4.2 定量分析 首先定義各化學(xué)拆分組分交叉或相似的程度為組分間的相似度或交叉度（Similarity degree， SD）。在此基礎(chǔ)上，定義組分之間的不交叉程度或不對(duì)稱(chēng)性為差異度（Discrepancy degree， DD或Nonsimilarity degree， NS）。相似度用S表示，差異度用NS表示，并且S+NS=1。采用3種方法：夾角余弦法、平方歐氏距離方法和生藥峰面積交叉分析方法。生藥峰面積交叉分析方法，以樣本和每個(gè)樣本的各個(gè)峰面積列出相關(guān)數(shù)據(jù)的矩陣Y，如公式（1）所示，首次提出利用公共指紋圖譜的匹配峰面積對(duì)兩兩化學(xué)拆分組分進(jìn)行交叉度（S）和差異度（NS=1-S）的分析。

式中，YA， YB， YC和YD分別代表?yè)]發(fā)油組分、石油醚組分、樹(shù)脂醇洗組分和樹(shù)脂水洗組分所有批次（n=10）的HPLC公共指紋圖譜中相應(yīng)保留時(shí)間下經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理（即所有批次樣品各自匹配的峰面積與各組分指紋圖譜所有峰的平均峰面積之比）后的面積。以YA和YB， 兩組分的數(shù)據(jù)為例，見(jiàn)式（2）和（3）。S1，2和S2，1分別為相應(yīng)保留時(shí)間下兩組分中較小峰面積占較大峰面積的比例總和，即較小峰面積與較大峰面積的匹配程度，來(lái)表征相應(yīng)保留時(shí)間下兩組分間的交叉度。因此，兩組分總的交叉度S=S1，2+S2，1，差異度1-S=1-（S1，2+S2，1），其它組分相關(guān)數(shù)據(jù)以規(guī)范值按上述公式計(jì)算。3 結(jié)果與討論

3.1 白術(shù)化學(xué)組分拆分

3.1.1 白術(shù)組分的拆分原則和出膏率 化學(xué)成分是中藥藥效（性）的物質(zhì)基礎(chǔ)，各類(lèi)化學(xué)成分藥理作用具有一定的相似性。因此在化學(xué)組分拆分過(guò)程中盡量將化學(xué)成分按類(lèi)劃分。白術(shù)傳統(tǒng)應(yīng)用以水煎為主，為此本研究以水作為提取溶劑，采用水蒸汽蒸餾等方法進(jìn)行全成分拆分。組分拆分原則是把揮發(fā)油和內(nèi)酯部分拆分，然后再將大分子多糖與小分子分開(kāi)，按照此原則建立白術(shù)性味組分拆分工藝，白術(shù)水煎液共拆分為5部分，即揮發(fā)油組分、石油醚組分、樹(shù)脂醇洗組分、樹(shù)脂水洗組分及多糖組分。出膏率見(jiàn)表1。

3.1.2 指紋圖譜分析 按上述方法所建立的指紋圖譜在242 nm處檢測(cè)的色譜峰相似度均在0.90以上，相互吻合程度較高，說(shuō)明工藝的穩(wěn)定性較好。

3.1.3 白術(shù)化學(xué)拆分組分的表征 上述方法分離得到的白術(shù)化學(xué)成分，經(jīng)2.2節(jié)HPLC方法測(cè)定后，采用2.3節(jié)建立的公共指紋圖譜對(duì)白術(shù)拆分的4個(gè)組分的指紋圖譜，根據(jù)保留時(shí)間和DAD檢測(cè)器顯示的紫外光譜進(jìn)行表征，共標(biāo)記了7個(gè)色譜峰（圖1）。根據(jù)樹(shù)脂洗脫規(guī)律，通過(guò)TLC檢識(shí)發(fā)現(xiàn)，樹(shù)脂水洗組分中含有大量小分子葡萄糖。揮發(fā)油組分中以蒼術(shù)酮為主，石油醚組分以白術(shù)內(nèi)酯為主，樹(shù)脂醇洗組分是一些聚炔類(lèi)化合物，樹(shù)脂水洗組分含有5 羥甲基糠醛和小分子糖等化合物。

3.2 白術(shù)拆分組分差異度評(píng)價(jià)結(jié)果

3.2.1 定性分析 各組分HPLC色譜峰按生藥折合規(guī)范化后的峰面積，通過(guò)SPSS13.0軟件進(jìn)行主成分和聚類(lèi)分析。從主成分分析中提取3個(gè)主成分，特征值累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到了66.34%，說(shuō)明其降維效果較好，僅用前3個(gè)主成分即可包含原始因子代表的眾多主要信息。由圖2可見(jiàn)，此方法提取的3個(gè)主成分將這些色譜峰明顯地分為4大類(lèi)，每類(lèi)聚在不同的空間位置，A、B為揮發(fā)油和石油醚組分位于PC1正軸附近，C為樹(shù)脂醇洗組分位于PC2正軸附近，D為樹(shù)脂水洗組分位于PC3軸零點(diǎn)附近。系統(tǒng)聚類(lèi)分析法，采用歐氏距離法計(jì)算樣品間相似度，選用最短距離法進(jìn)行聚類(lèi)。結(jié)果如圖3所示：組分1～10聚為Ⅰ類(lèi)，即為揮發(fā)油組分；組分11～20聚為Ⅱ類(lèi)，即為石油醚組分；組分21～30聚為Ⅲ類(lèi)，即為樹(shù)脂醇洗組分；組分31～40聚為Ⅳ類(lèi)， 即為樹(shù)脂水洗組分。

3.2.2 定量分析 （1）夾角余弦法 通過(guò)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版》軟件，以?shī)A角余弦為測(cè)度，對(duì)上述4個(gè)小分子部分化學(xué)拆分組分的公共指紋圖譜進(jìn)行相似度分析，由各組分的相似度或交叉度（S），可以近似得出各組分的差異度（1-S），結(jié)果見(jiàn)表2。

（2）平方歐式距離法 將3.2項(xiàng)中的圖3，通過(guò)幾何畫(huà)板獲得各化學(xué)拆分組分在樹(shù)狀圖橫軸上平方歐氏距離的具體數(shù)值，利用平方歐式距離對(duì)樹(shù)狀圖進(jìn)行數(shù)字化分析，定義第一次能夠分開(kāi)兩組分聚合在一起的歐氏距離為dmin；所有組分能聚類(lèi)在一起的最小歐氏距離為dmax=25。由圖3可知，白術(shù)拆分4組分的最大

交叉度為5/25=0.2，最小差異度為80%，即白術(shù)拆分組分間差異度最小的為石油醚組和樹(shù)脂醇洗組，其差異度為80%。（3） 生藥峰面積差異度分析法 將拆分組分的10批HPLC圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版》軟件，生成各自的公共指紋圖譜后，分別導(dǎo)出各拆分組分的保留時(shí)間對(duì)應(yīng)的峰面積，根據(jù)進(jìn)樣量和藥材量，按照實(shí)際生藥中含量對(duì)每個(gè)組分中各個(gè)色譜峰的峰面積進(jìn)行折合，并進(jìn)行規(guī)范化處理。然后按照2.4.2項(xiàng)中公式進(jìn)行交叉度分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

綜上所述，本研究建立了白術(shù)化學(xué)組分的全拆分工藝，同時(shí)對(duì)其進(jìn)行了HPLC化學(xué)表征，建立了拆分組分間系統(tǒng)的交叉度評(píng)價(jià)體系。中藥藥效（性）組分評(píng)價(jià)中，組間交叉度的定量分析是需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題。本研究采用定性和定量分析法對(duì)白術(shù)各組分間的差異性進(jìn)行研究。定性分析中的主成分分析和聚類(lèi)分析結(jié)果直觀，操作簡(jiǎn)便。兩種方法都是按照“相近者相聚”的原則將原始數(shù)據(jù)分類(lèi)，既體現(xiàn)了類(lèi)間的差異性，同時(shí)又減少了分析指標(biāo)。如圖2和3所示，采用主成分分析法和聚類(lèi)分析法均可將白術(shù)小分子部分拆分為大類(lèi)。

因目前尚無(wú)組分間不交叉性的定量分析方法，本研究探索了3種定量分析方法，利用不同的測(cè)度對(duì)白術(shù)拆分組分進(jìn)行了不交叉性分析。采用夾角余弦法，利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版》直接進(jìn)行分析，但此方法的不足之處是它與進(jìn)樣量有直接關(guān)系，不能反映各拆分組分在中藥中的實(shí)際含量。平方歐氏距離法只能得到各組分間的最小差異度，不能反映整體拆分組分間差異。生藥峰面積交叉分析法是將兩兩組分進(jìn)行交叉度分析，結(jié)果表明在前文主成分分析和聚類(lèi)分析得到4個(gè)組分沒(méi)有交叉性的基礎(chǔ)上，石油醚組分和樹(shù)脂醇洗組分交叉度最大，差異度最小。生藥峰面積差異度分析法是組分間交叉度的定量分析方法，此方法可通過(guò)簡(jiǎn)單的Excel計(jì)算，即可獲得拆分組分交叉度的分析結(jié)果，不需要更多的軟件支持，分析方便。應(yīng)用生藥峰面積差異度分析法更能反映相同藥材量下的各組分交叉度的變化，應(yīng)作為定量分析的主要方法。

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