高效液相色譜測(cè)定地下水、土壤及糞便中4種磺胺類抗生素

周愛(ài)霞+蘇小四+高松+張玉玲+林學(xué)鈺+張?zhí)m英+安永磊

摘 要 應(yīng)用固相微萃取盤(pán)結(jié)合高效液相色譜方法，建立了地下水、土壤及糞便中4種常用磺胺類獸藥抗生素的檢測(cè)方法?？疾炝讼疵撘?、萃取膜種類對(duì)地下水中磺胺類抗生素回收率的影響，確定了最佳富集條件：甲醇與1.0%甲酸溶液的混合液作為洗脫液，HLB（二乙烯苯 N 乙烯基吡咯烷酮聚合物）膜作為萃取膜；考察了不同前處理方法對(duì)于土壤、糞便中磺胺類抗生素回收率的影響，確定了最佳提取條件：1.0 g土壤（糞便）加10 mL提取液（0.1%甲酸 甲醇，7∶3，V/V）重復(fù)提取兩次。實(shí)驗(yàn)表明，利用甲醇與1.0%甲酸的混合液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液的基體或測(cè)試樣品的基體，4種磺胺類抗生素的響應(yīng)值是純甲醇的8～10倍。在最佳測(cè)試條件下，4種磺胺類抗生素在0.005～10.0 mg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.9999； 磺胺噻唑（ST）、磺胺甲基嘧啶（SM）、磺胺二甲基嘧啶（SM2）和磺胺甲惡唑（SMX）的檢出限分別為1.08，3.56，4.63和1.84 ng/L（S/N=3）；其中固相微萃取盤(pán)對(duì)于地下水樣的富集倍數(shù)為4000倍；7次平行測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.1%～0.4%。對(duì)實(shí)際樣品的加標(biāo)回收率為69.8%～117.6%。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜； 磺胺類抗生素； 地下水； 土壤； 糞便

1 引 言

磺胺類藥物是畜牧養(yǎng)殖中常用的獸藥之一，在日常生產(chǎn)中的用量非常大。動(dòng)物攝入磺胺類藥物后，主要經(jīng)過(guò)糞尿的途徑排出體外，進(jìn)入外界環(huán)境，并受到外界環(huán)境中的理化或生物因素的影響，發(fā)生遷移、轉(zhuǎn)化，并對(duì)水環(huán)境和土壤環(huán)境造成潛在的威脅。

磺胺類抗生素是水溶性較強(qiáng)、揮發(fā)性較差的一類化合物，使用氣相色譜 質(zhì)譜聯(lián)用進(jìn)行分析時(shí)， 必須進(jìn)行復(fù)雜的衍生化反應(yīng)，反應(yīng)過(guò)程的不可控性對(duì)分析結(jié)果的重現(xiàn)性影響較大，目前已不多用[1，2]。馬麗麗等[3]利用固相萃取 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定了土壤中磺胺類、四環(huán)素類和喹諾酮類抗生素；唐才明等[4]利用高效液相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)城市污水中的微量磺胺類等抗生素進(jìn)行了測(cè)試。雖然高效液相質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC/MS/MS）對(duì)于磺胺類抗生素的檢出限低，但是由于使用測(cè)試成本較高，不易推廣使用。因此液相色譜方法成為抗生素檢測(cè)的主流技術(shù)。其中， 液相色譜 紫外檢測(cè)法（LC UV）和液相色譜 熒光檢測(cè)法（LC FLD）在抗生素分析中使用較多。吳翠琴等[5]利用離子液體單滴微萃取 高效液相色譜對(duì)水環(huán)境中的7中磺胺類抗生素進(jìn)行了測(cè)試，雖然使用離子液體對(duì)水樣萃取的方法更加環(huán)保，但是離子液體具有吸水性強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)需在惰性環(huán)境中進(jìn)行，價(jià)格昂貴，限制了實(shí)際水樣測(cè)試的可操作性。He等[6]利用分子印跡法結(jié)合HPLC UV檢測(cè)了牛奶中的磺胺類抗生素，但是由于分子印跡的功能單體與模板形成時(shí)在高溫下不穩(wěn)定，反應(yīng)需在低溫下進(jìn)行，對(duì)環(huán)境條件要求較為苛刻，不易推廣。彭英等[7]采用固相萃取 HPLC方法測(cè)定了牛奶中4種磺胺類藥物殘留。Malintan等[8]利用3 mg的HLB固相微萃取柱對(duì)養(yǎng)豬場(chǎng)廢水中的磺胺類抗生素進(jìn)行了萃取濃縮，利用HPLC UV進(jìn)行檢測(cè)，但回收率不高且檢出限較高。HLB固相微萃取柱為應(yīng)用較多的水樣中抗生素的萃取富集方法，但是對(duì)于地下水中低濃度的抗生素的萃取濃縮需要大體積的水量，需要較長(zhǎng)的萃取時(shí)間。近幾年發(fā)展起來(lái)的固相微萃取盤(pán)以其快速、大體積、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)逐漸被應(yīng)用到環(huán)境樣品中獸藥抗生素的測(cè)試。

本實(shí)驗(yàn)是在檢測(cè)動(dòng)物組織中的獸藥殘留方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，建立了地下水、土壤和糞便樣品中抗生素的快速靈敏準(zhǔn)確的高效液相色譜檢測(cè)方法。地下水及土壤中的抗生素含量較低，因此提高檢測(cè)方法的靈敏度，降低檢出限，提高水樣的濃縮倍數(shù)是目前迫切解決的問(wèn)題。2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Agilent 1200series 高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）；pH計(jì)（德國(guó)Sartorius公司）；全自動(dòng)固相萃取系統(tǒng)（SPE DEX4790，美國(guó)Horizon Technology公司）；HY回旋振蕩器（國(guó)華電器有限公司）。

磺胺噻唑（Sulfathiazole， ST），磺胺甲基嘧啶（Sulfamethyldiazine， SM），磺胺二甲基嘧啶（Sulfamethazine， SM2），磺胺甲惡唑 （Sulfamethoxazole， SMX），純度≥99.9%（Sigma公司）；甲醇、乙腈為色譜純；NaOH、甲酸為分析純（北京化工試劑有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取適量磺胺標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配制成5.0 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，其中磺胺甲基嘧啶配制過(guò)程中加入幾滴NaOH溶液促進(jìn)溶解，

Symbolm@@ 20 ℃保存，使用時(shí)，以甲醇稀釋至所需濃度。

2.3 色譜條件

Agilent XDB C18色譜柱（150 mm×46 mm， 5 μm）；流動(dòng)相0.1%甲酸 甲醇（7∶3，V/V）混合液，甲醇用前以微孔有機(jī)濾膜（0.45 μm）過(guò)濾，0.1%甲酸溶液用微孔水系濾膜（0.45 μm）過(guò)濾，超聲脫氣；流速：0.8 mL/min；溫度：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm；進(jìn)樣量：50 μL。

2.4 樣品前處理方法

（1） 取4.0 L地下水樣品，4000 r/min離心取上清液，使用HLB萃取膜，利用固相微萃取盤(pán)進(jìn)行萃取，洗脫液為甲醇和1.0%甲酸的混合液，洗脫程序如表1所示，氮吹至干，利用上述0.1%甲酸 甲醇

（7∶3，V/V）混合液定容至1.0 mL。 （2）土壤和糞便樣品 取土壤或糞便樣品，自然風(fēng)干，研磨過(guò)2 mm的篩網(wǎng)，備用。稱取1.0 g土壤放入100 mL錐形瓶中，加入10.0 mL 1.0%甲酸 甲醇（7∶3，V/V）混合液提取，搖床振蕩2 h，4000 r/min離心10 min，重復(fù)一次， 收集提取液，用0.45 mm有機(jī)系濾膜過(guò)濾，待測(cè)。

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜條件的選擇

3.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 在磺胺類藥物的結(jié)構(gòu)中有一個(gè)苯環(huán)，在紫外條件下有特征吸收，因此，可直接用紫外檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定。參考文獻(xiàn)＼[9，10]， 檢測(cè)波長(zhǎng)選取270 nm。

3.1.2 流動(dòng)相的選擇 參考文獻(xiàn)[11，12]，選取6種流動(dòng)相進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，由表2可知，流動(dòng)相a的響應(yīng)值不高，流動(dòng)相b，c，e，f的磺胺噻唑和磺胺甲基嘧啶的保留時(shí)間相近，積分誤差比較大，因此選取d為流動(dòng)相。

3.1.3 樣品基體的選擇 利用1.0%甲酸 甲醇（7∶3，V/V）混合液混合液作為樣品的基體，4種磺胺類獸藥抗生素的響應(yīng)值比純甲醇高很多，如圖1所示。

3.2 前處理方法的選擇

地下水樣品選取HLB、C18固相微萃取膜進(jìn)行回收率的測(cè)定。結(jié)果表明，HLB萃取膜回收率明顯高于C18萃取膜，且回收率符合要求，因此選用HLB固相萃取膜進(jìn)行地下水的濃縮萃取。取1.0，2.0和5.0 g土壤、糞便樣品，加入標(biāo)準(zhǔn)溶液，

3.3 測(cè)試方法的線性范圍、檢出限、精密度

3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線和測(cè)量精密度 分別配制4種磺胺類抗生素的標(biāo)準(zhǔn)溶液： 0.005， 0.01， 0.05， 0.1， 0.5， 1.0， 5.0和10.0 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以濃度和積分面積進(jìn)行曲線擬合。ST的線性方程為y=204.4x+0.4422， r=0.9999； SM的線性方程為

y=231.9x-4.5157，r=0.9999；SM2的線性方程為y=224.95x-0.5497， r=0.9999；SMX的線性方程為y=271.22x-0.9443，r=0.9999，線性區(qū)間為0.005～10.0 mg/L。ST，SM，SM2和SMX的線性良好，而且線性范圍較寬。選定某一濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品，在相同條件下重復(fù)進(jìn)樣7次，ST，SM，SM2和SMX的RSD分別為0.40%， 0.12%， 0.18%和0.23%，均滿足儀器精密度要求。說(shuō)明本方法適合環(huán)境樣品中磺胺類抗生素的測(cè)定。

3.3.2 方法的加標(biāo)回收率和檢出限 在地下水，土壤和糞便樣品中分別加入不同濃度的4種磺胺類抗生素藥品，確定方法的回收率。各溶液中4種磺胺類抗生素的加標(biāo)濃度、平均回收率如表4所示。

配制0. 05mg/L的4種磺胺類抗生素平行樣各7份，采用上述方法分析。以測(cè)量值標(biāo)準(zhǔn)偏差的3倍計(jì)算出4種抗生素的檢出限為1.08 ng/L （ST）， 3.56 ng/L（SM）， 4.63 ng/L（SM2）和1.84 ng/L（SMX）。

3.4 實(shí)際樣品分析

在黑龍江省某大型集中畜牧養(yǎng)殖廠附近，采集地下水、土壤及糞便樣品，采用本方法對(duì)所采集的樣品進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果如表5所示。本方法與高效液相色譜 質(zhì)譜聯(lián)用儀的測(cè)試結(jié)果進(jìn)行了對(duì)比，測(cè)試誤差均低于5%，滿足分析要求。

本研究采用HLB萃取膜對(duì)地下水樣品中的磺胺類抗生素進(jìn)行了萃取濃縮，土壤和糞便樣品中的磺胺類抗生素采用0.1%甲酸 甲醇（7∶3，V/V）混合提取液進(jìn)行了提取，利用高效液相色譜法對(duì)4種磺胺類抗生素進(jìn)行測(cè)試分析，并測(cè)試了實(shí)際樣品。圖2和圖3分別為磺胺標(biāo)準(zhǔn)和典型水樣的色譜圖。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 本方法具有前處理方法簡(jiǎn)單快速，對(duì)地下水的富集倍數(shù)高，回收率高，方法檢出限低，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍寬、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，相對(duì)于LC/MS/MS方法，成本較低，適用于各種水體、土壤及糞便中的磺胺類抗生素的快速檢測(cè)。

References

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3 結(jié)果與討論

3.1 色譜條件的選擇

3.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 在磺胺類藥物的結(jié)構(gòu)中有一個(gè)苯環(huán)，在紫外條件下有特征吸收，因此，可直接用紫外檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定。參考文獻(xiàn)＼[9，10]， 檢測(cè)波長(zhǎng)選取270 nm。

3.1.2 流動(dòng)相的選擇 參考文獻(xiàn)[11，12]，選取6種流動(dòng)相進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，由表2可知，流動(dòng)相a的響應(yīng)值不高，流動(dòng)相b，c，e，f的磺胺噻唑和磺胺甲基嘧啶的保留時(shí)間相近，積分誤差比較大，因此選取d為流動(dòng)相。

3.1.3 樣品基體的選擇 利用1.0%甲酸 甲醇（7∶3，V/V）混合液混合液作為樣品的基體，4種磺胺類獸藥抗生素的響應(yīng)值比純甲醇高很多，如圖1所示。

3.2 前處理方法的選擇

地下水樣品選取HLB、C18固相微萃取膜進(jìn)行回收率的測(cè)定。結(jié)果表明，HLB萃取膜回收率明顯高于C18萃取膜，且回收率符合要求，因此選用HLB固相萃取膜進(jìn)行地下水的濃縮萃取。取1.0，2.0和5.0 g土壤、糞便樣品，加入標(biāo)準(zhǔn)溶液，

3.3 測(cè)試方法的線性范圍、檢出限、精密度

3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線和測(cè)量精密度 分別配制4種磺胺類抗生素的標(biāo)準(zhǔn)溶液： 0.005， 0.01， 0.05， 0.1， 0.5， 1.0， 5.0和10.0 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以濃度和積分面積進(jìn)行曲線擬合。ST的線性方程為y=204.4x+0.4422， r=0.9999； SM的線性方程為

y=231.9x-4.5157，r=0.9999；SM2的線性方程為y=224.95x-0.5497， r=0.9999；SMX的線性方程為y=271.22x-0.9443，r=0.9999，線性區(qū)間為0.005～10.0 mg/L。ST，SM，SM2和SMX的線性良好，而且線性范圍較寬。選定某一濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品，在相同條件下重復(fù)進(jìn)樣7次，ST，SM，SM2和SMX的RSD分別為0.40%， 0.12%， 0.18%和0.23%，均滿足儀器精密度要求。說(shuō)明本方法適合環(huán)境樣品中磺胺類抗生素的測(cè)定。

3.3.2 方法的加標(biāo)回收率和檢出限 在地下水，土壤和糞便樣品中分別加入不同濃度的4種磺胺類抗生素藥品，確定方法的回收率。各溶液中4種磺胺類抗生素的加標(biāo)濃度、平均回收率如表4所示。

配制0. 05mg/L的4種磺胺類抗生素平行樣各7份，采用上述方法分析。以測(cè)量值標(biāo)準(zhǔn)偏差的3倍計(jì)算出4種抗生素的檢出限為1.08 ng/L （ST）， 3.56 ng/L（SM）， 4.63 ng/L（SM2）和1.84 ng/L（SMX）。

3.4 實(shí)際樣品分析

在黑龍江省某大型集中畜牧養(yǎng)殖廠附近，采集地下水、土壤及糞便樣品，采用本方法對(duì)所采集的樣品進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果如表5所示。本方法與高效液相色譜 質(zhì)譜聯(lián)用儀的測(cè)試結(jié)果進(jìn)行了對(duì)比，測(cè)試誤差均低于5%，滿足分析要求。

本研究采用HLB萃取膜對(duì)地下水樣品中的磺胺類抗生素進(jìn)行了萃取濃縮，土壤和糞便樣品中的磺胺類抗生素采用0.1%甲酸 甲醇（7∶3，V/V）混合提取液進(jìn)行了提取，利用高效液相色譜法對(duì)4種磺胺類抗生素進(jìn)行測(cè)試分析，并測(cè)試了實(shí)際樣品。圖2和圖3分別為磺胺標(biāo)準(zhǔn)和典型水樣的色譜圖。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 本方法具有前處理方法簡(jiǎn)單快速，對(duì)地下水的富集倍數(shù)高，回收率高，方法檢出限低，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍寬、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，相對(duì)于LC/MS/MS方法，成本較低，適用于各種水體、土壤及糞便中的磺胺類抗生素的快速檢測(cè)。

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3 結(jié)果與討論

3.1 色譜條件的選擇

3.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 在磺胺類藥物的結(jié)構(gòu)中有一個(gè)苯環(huán)，在紫外條件下有特征吸收，因此，可直接用紫外檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定。參考文獻(xiàn)＼[9，10]， 檢測(cè)波長(zhǎng)選取270 nm。

3.1.2 流動(dòng)相的選擇 參考文獻(xiàn)[11，12]，選取6種流動(dòng)相進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，由表2可知，流動(dòng)相a的響應(yīng)值不高，流動(dòng)相b，c，e，f的磺胺噻唑和磺胺甲基嘧啶的保留時(shí)間相近，積分誤差比較大，因此選取d為流動(dòng)相。

3.1.3 樣品基體的選擇 利用1.0%甲酸 甲醇（7∶3，V/V）混合液混合液作為樣品的基體，4種磺胺類獸藥抗生素的響應(yīng)值比純甲醇高很多，如圖1所示。

3.2 前處理方法的選擇

地下水樣品選取HLB、C18固相微萃取膜進(jìn)行回收率的測(cè)定。結(jié)果表明，HLB萃取膜回收率明顯高于C18萃取膜，且回收率符合要求，因此選用HLB固相萃取膜進(jìn)行地下水的濃縮萃取。取1.0，2.0和5.0 g土壤、糞便樣品，加入標(biāo)準(zhǔn)溶液，

3.3 測(cè)試方法的線性范圍、檢出限、精密度

3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線和測(cè)量精密度 分別配制4種磺胺類抗生素的標(biāo)準(zhǔn)溶液： 0.005， 0.01， 0.05， 0.1， 0.5， 1.0， 5.0和10.0 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以濃度和積分面積進(jìn)行曲線擬合。ST的線性方程為y=204.4x+0.4422， r=0.9999； SM的線性方程為

y=231.9x-4.5157，r=0.9999；SM2的線性方程為y=224.95x-0.5497， r=0.9999；SMX的線性方程為y=271.22x-0.9443，r=0.9999，線性區(qū)間為0.005～10.0 mg/L。ST，SM，SM2和SMX的線性良好，而且線性范圍較寬。選定某一濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品，在相同條件下重復(fù)進(jìn)樣7次，ST，SM，SM2和SMX的RSD分別為0.40%， 0.12%， 0.18%和0.23%，均滿足儀器精密度要求。說(shuō)明本方法適合環(huán)境樣品中磺胺類抗生素的測(cè)定。

3.3.2 方法的加標(biāo)回收率和檢出限 在地下水，土壤和糞便樣品中分別加入不同濃度的4種磺胺類抗生素藥品，確定方法的回收率。各溶液中4種磺胺類抗生素的加標(biāo)濃度、平均回收率如表4所示。

配制0. 05mg/L的4種磺胺類抗生素平行樣各7份，采用上述方法分析。以測(cè)量值標(biāo)準(zhǔn)偏差的3倍計(jì)算出4種抗生素的檢出限為1.08 ng/L （ST）， 3.56 ng/L（SM）， 4.63 ng/L（SM2）和1.84 ng/L（SMX）。

3.4 實(shí)際樣品分析

在黑龍江省某大型集中畜牧養(yǎng)殖廠附近，采集地下水、土壤及糞便樣品，采用本方法對(duì)所采集的樣品進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果如表5所示。本方法與高效液相色譜 質(zhì)譜聯(lián)用儀的測(cè)試結(jié)果進(jìn)行了對(duì)比，測(cè)試誤差均低于5%，滿足分析要求。

本研究采用HLB萃取膜對(duì)地下水樣品中的磺胺類抗生素進(jìn)行了萃取濃縮，土壤和糞便樣品中的磺胺類抗生素采用0.1%甲酸 甲醇（7∶3，V/V）混合提取液進(jìn)行了提取，利用高效液相色譜法對(duì)4種磺胺類抗生素進(jìn)行測(cè)試分析，并測(cè)試了實(shí)際樣品。圖2和圖3分別為磺胺標(biāo)準(zhǔn)和典型水樣的色譜圖。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 本方法具有前處理方法簡(jiǎn)單快速，對(duì)地下水的富集倍數(shù)高，回收率高，方法檢出限低，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍寬、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，相對(duì)于LC/MS/MS方法，成本較低，適用于各種水體、土壤及糞便中的磺胺類抗生素的快速檢測(cè)。

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