婁銀飛 馬麗俐 鄭明警 周慧 方一妙

龍膽草對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖和凋亡及表皮生長(zhǎng)因子受體磷酸化的影響

婁銀飛 馬麗俐 鄭明警 周慧 方一妙

目的探討龍膽草提取物對(duì)表皮生長(zhǎng)因子(EGF)刺激后HaCaT細(xì)胞增殖和凋亡及表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)磷酸化的影響。方法取0～50 g/L龍膽草提取物作用于EGF刺激后的HaCaT細(xì)胞24 h,噻唑藍(lán)法檢測(cè)細(xì)胞增殖率,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,Western印跡法檢測(cè)磷酸化EGFR。結(jié)果龍膽草提取物濃度依賴性地抑制EGF刺激后HaCaT細(xì)胞的增殖(r=-0.991,P＜0.01),促進(jìn)EGF刺激后HaCaT細(xì)胞的凋亡(r=0.996,P＜0.05)。同時(shí),龍膽草提取物使EGF刺激后的HaCaT細(xì)胞EGFR的磷酸化水平降低,該作用隨著藥物濃度的增加而增加。結(jié)論龍膽草可能通過(guò)降低EGFR的磷酸化,阻斷相關(guān)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路來(lái)抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的過(guò)度增殖并促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。

龍膽屬;角蛋白細(xì)胞;細(xì)胞增殖;細(xì)胞凋亡;受體,表皮生長(zhǎng)因子

在臨床用藥中觀察到,以龍膽草為主藥的中藥復(fù)方制劑在改善銀屑病紅斑和鱗屑等皮損方面有效,同時(shí)有報(bào)道經(jīng)典方劑龍膽瀉肝湯、當(dāng)歸龍薈丸等對(duì)銀屑病皮損的改善療效顯著［1-2］,但對(duì)其作用機(jī)理研究未見(jiàn)深入。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)觀察龍膽草提取物對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖、凋亡及表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)磷酸化的影響,探討其治療銀屑病的作用機(jī)制。

一、材料

HaCaT細(xì)胞由浙江省中醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室保存提供,龍膽草經(jīng)水煮醇沉法濃縮提取藥液,調(diào)pH至7.0,質(zhì)量濃度為1 g/ml,1640培養(yǎng)液產(chǎn)自美國(guó)Hylcone公司,胎牛血清產(chǎn)自浙江天杭生物科技有限公司,重組人表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(rhEGF)產(chǎn)自北京Sino Biological Inc公司,磷酸化兔抗人EGFR多克隆抗體、兔抗β肌動(dòng)蛋白多克隆IgG抗體及山羊抗兔IgG二抗產(chǎn)自美國(guó)Bioworld Technology Inc公司。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng):37℃5%CO2條件下用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞。

2.噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞增殖:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,按104/孔接種于96孔平板培養(yǎng)24 h,換含20 μg/L EGF的培養(yǎng)液培養(yǎng) 24 h 后, 各孔分別加入 10、20、30、40、50 g/L 龍膽草提取物200 μl,每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔,同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每孔加5 g/L MTT 20 μl,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。離心,棄上清液,每孔加入100 μl二甲基亞砜(DMSO),振蕩,酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔490 nm處吸光度值(A490)。

3.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,105個(gè)/孔接種于6孔平板培養(yǎng)24 h,換含20 μg/L EGF培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。各孔分別加入10、30、50 g/L龍膽草提取物2 ml,設(shè)空白對(duì)照組,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。收集細(xì)胞,離心。棄上清液,重懸細(xì)胞于結(jié)合緩沖液500 μl,調(diào)整細(xì)胞至106/ml,每個(gè)離心管加入膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素5 μl和碘化丙錠10 μl,室溫避光15 min,用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡。

4.Western印跡法檢測(cè)細(xì)胞磷酸化EGFR:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底90%時(shí),各瓶分別加入10、30、50 g/L龍膽草提取物5 ml,設(shè)空白對(duì)照組,培養(yǎng)24 h。20 μg/L EGF培養(yǎng)液作用10 min后棄上清液。每瓶加入含20%磷酸酶抑制劑的細(xì)胞裂解液150 ml,提取細(xì)胞總蛋白。二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定蛋白濃度。配制8%凝膠,每孔加入30 μg蛋白樣品,置電泳緩沖液中,常規(guī)電泳操作并轉(zhuǎn)膜、封閉,一抗、二抗室溫孵育,曝光。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,結(jié)果以±s表示,兩組比較采用雙側(cè)t檢驗(yàn),數(shù)據(jù)相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析法,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

三、結(jié)果

1.龍膽草提取物對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的影響:10、20、30、40、50 g/L龍膽草提取物組的A值(0.960±0.016、0.831±0.007、0.379±0.009)與空白對(duì)照組A值(1.095)相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為 56.97、106.10、63.61、42.28、11.39,均P＜0.05,n=8)。龍膽草提取物在0～50 g/L范圍內(nèi)濃度依賴性地抑制EGF刺激后HaCaT細(xì)胞的增殖,增殖率與濃度呈線性負(fù)相關(guān)(r=-0.991,P＜0.01)。

2.龍膽草提取物對(duì)EGF刺激后HaCaT細(xì)胞凋亡的影響:空白對(duì)照組及10、30、50 g/L龍膽草提取物組細(xì)胞凋亡率分別為2.1%、5.9%、20.7%、36.3%,見(jiàn)圖1。且細(xì)胞凋亡率與龍膽草提取物濃度呈正相關(guān)(r=0.996,P＜0.05)。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況

3.龍膽草提取物對(duì)HaCaT細(xì)胞EGFR磷酸化的影響:龍膽草提取物在0～50 g/L范圍內(nèi),HaCaT細(xì)胞均有基礎(chǔ)量的磷酸化EGFR,隨著龍膽草提取物濃度的增加,EGFR磷酸化水平呈降低趨勢(shì)。見(jiàn)圖2。

圖2 龍膽草提取物對(duì)HaCaT細(xì)胞EGFR的磷酸化的影響

四、討論

EGFR被認(rèn)為是在包括表皮角質(zhì)形成細(xì)胞(KC)在內(nèi)的多種細(xì)胞的增殖和凋亡過(guò)程中有著重要作用［3］。銀屑病的病理基礎(chǔ)主要在于KC增殖和凋亡異常,因此,研究增殖和凋亡及與其密切相關(guān)的細(xì)胞因子EGFR,對(duì)銀屑病的發(fā)生發(fā)展和治療轉(zhuǎn)歸有著重要的意義。EGFR是一種酪氨酸激酶型受體,廣泛分布于哺乳動(dòng)物的上皮細(xì)胞膜表面。當(dāng)其與包括EGF在內(nèi)的多種配體之一結(jié)合后進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),形成同源或異源二聚體,傳遞信號(hào),激活相關(guān)信號(hào)通路,對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行調(diào)控。在正常的皮膚損傷反應(yīng)中,EGFR及其配體通過(guò)刺激增生和調(diào)節(jié)分化促進(jìn)KC移動(dòng),參與急性傷口的愈合過(guò)程。它們持續(xù)過(guò)度的異常表達(dá),導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖、黏附,從而引起包括銀屑病、特應(yīng)性皮炎等在內(nèi)的多種慢性炎癥性皮膚病的發(fā)生［4］。EGFR在銀屑病進(jìn)行期、靜止期皮損的基底層及棘層、顆粒層中均有較強(qiáng)表達(dá),在正常皮膚和銀屑病消退期的表達(dá)明顯減少［5］。此外臨近正常皮膚的皮損也有較強(qiáng)表達(dá)［6］。說(shuō)明EGFR的高表達(dá)與銀屑病的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切［7］。阻斷EGFR能顯著提高KC在應(yīng)激狀態(tài)(如傳代)時(shí)的凋亡率［8］。靛玉紅治療銀屑病有效,其治療機(jī)理為抑制EGFR的激活［9］。酪氨酸激酶抑制劑AG 1571(SU 5271)抑制EGFR的磷酸化,被認(rèn)為是強(qiáng)有效的抗銀屑病藥物之一［10］。厄洛替尼(一種惡性腫瘤治療藥物)能抑制EGFR酪氨酸激酶抑制劑,有報(bào)道成功地治愈了2例肺癌合并銀屑病患者的皮膚疾?。?1］。

我們通過(guò)EGF刺激HaCaT細(xì)胞,使其模擬銀屑病KC的異常增殖狀態(tài),并通過(guò)MTT法及流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的增殖及凋亡情況。結(jié)果顯示,在10～50 g/L濃度范圍內(nèi),龍膽草提取物能有效抑制HaCaT細(xì)胞的增殖。當(dāng)濃度大于30 g/L時(shí),抑制作用明顯。其抑制作用與濃度呈線性相關(guān)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果與流式細(xì)胞儀測(cè)得的細(xì)胞凋亡率結(jié)果相符。表明龍膽草抑制HaCaT細(xì)胞的增殖可能是通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡來(lái)完成的。進(jìn)一步Western印跡法分析發(fā)現(xiàn),龍膽草提取物能使EGFR的磷酸化降低,并且在0～50 g/L濃度范圍內(nèi)隨著濃度的增加,EGFR的磷酸化水平降低。表明龍膽草提取物抑制HaCaT細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡的作用至少部分可能是通過(guò)降低EGFR的磷酸化從而阻斷相關(guān)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)。50 g/L與30 g/L龍膽草提取物組EGFR的磷酸化水平相當(dāng),提示EGFR的磷酸化可能存在多條通路,而龍膽草提取物僅能干預(yù)其中部分通路的表達(dá),具體機(jī)制有待后續(xù)研究。

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Effect of Chinese gentian on the proliferation of,apoptosis and phosphorylation of epidermal growth factor receptor in HaCaT cells

Lou Yinfei，Ma Lili，Zheng Mingjing，Zhou Hui，F(xiàn)ang Yimiao.Department of Dermatology，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310058，China

Ma Lili，Email:ma_lili@hotmail.com

Objective To evaluate the effect of Chinese gentian extracts on the proliferation of，apoptosis and phosphorylation of epidermal growth factor receptor(EGFR)in HaCaT cells induced by epidermal growth factor(EGF).Methods Methyl thiazolyl tetrazolium(MTT)assay was performed to evaluate the proliferation of HaCaT cells pretreated with EGF of 20 μg/L for 24 hours followed by 24 hours of treatment with various concentrations of Chinese gentian extracts.Flow cytometry was carried out to detect apoptosis in HaCaT cells pretreated with EGF of 20 μg/L for 24 hours followed by 4 hours of treatment with different concentrations of Chinese gentian extracts.Western blot was conducted to measure the level of phosphorylated EGFR in HaCaT cells treated with different concentrations of Chinese gentian extracts for 24 hours followed by treatment with EGF of 20 μg/L for 10 minutes.Results Chinese gentian extracts inhibited the proliferation(r=-0.991，P＜ 0.01)，but promoted the apoptosis(r=0.996，P＜ 0.05)of HaCaT cells induced by EGF in a dose-dependent manner.At the same time，the extracts suppressed the phosphorylation of EGFR in HaCaT cells induced by EGF，and the suppressing effect increased with the rise in the concentration of the extracts.Conclusions Chinese gentian may inhibit the proliferation，but promote the apoptosis of keratinocytes by decreasing EGFR phosphorylation and blocking relevant intracellular signaling pathways.

Gentian；Keratinocytes；Cell proliferation；Apoptosis；Receptor，epidermal growth factor

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.08.018

浙江省自然科學(xué)基金(Y2091225)

310058杭州,浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科

馬麗俐,Email:ma_lili@hotmail.com

2013-10-30)

(本文編輯:尚淑賢)