無選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因家畜制備技術(shù)

魏慶信+畢延震+鄭新民

摘要：選擇標(biāo)記基因（Selectablemarkergenes，SMGs）為目前應(yīng)用體細(xì)胞核移植技術(shù)制備轉(zhuǎn)基因家畜所必須。然而一旦完成篩選得到所需要的轉(zhuǎn)化細(xì)胞或完成轉(zhuǎn)基因動物的構(gòu)建之后，SMGs就變成不需要的或多余的，而且這些帶有標(biāo)記基因的家畜還存在安全方面的隱患。因此，建立無選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因家畜技術(shù)勢在必行。目前能夠采取的策略一是在篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞或構(gòu)建成功目的基因表達(dá)的家畜之后，刪除SMGs;二是使用無篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因技術(shù)。綜述了應(yīng)用Cre/LoxP位點特異性重組系統(tǒng)刪除SMGs的各種方法，以及應(yīng)用鋅指核酸酶（ZFNs）、TALEN和CRISPR/Cas9等新型基因編輯技術(shù)，基于受精卵顯微注射的無篩選標(biāo)記轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究進(jìn)展，分析對于制備無SMGs的轉(zhuǎn)基因家畜而言后者的優(yōu)勢所在，旨在為轉(zhuǎn)基因家畜研究提供參考。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因家畜;選擇標(biāo)記;基因刪除

中圖分類號：S185;Q789文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：0439-8114（2014）21-5057-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.21.001

PreparingTransgenicLivestocksWithoutSelectableMarker

WEIQing-xin，BIYan-zhen，ZHENGXin-min

（HubeiAcademyofAgricultureScience/HubeiKeyLabofAnimalEmbryoandMolecularBreeding，Wuhan430064，China）

Abstract：Selectablemarkergenes（SMGs）arenecessaryforproducingtransgeniclivestockbytransferringnuclearofsomaticcellcurrently.SMGswillbecomeunnecessary，redundantorevenhiddendangerafterobtainingtransgeniccellsoranimal.Theestablishmentofmarker-freetransgeniclivestocksisimperative.Therearetwostrategiescurrently.Oneistoremovemarkerafterscreeningtransformedcellsorbuildinggenelivestocksexpressionsuccessfully.Anotherisusingnon-selectivemarkertransgenictechnology.MethodsaboutusingCre/LoxPsite-specificrecombinationsystemtoremoveSMGs，applyingnewgeneeditingtechnologiesincludingzincfingernuclease（ZFNs），TALENandCRISPR/Cas9，microinjectionwithmarkerfreetransgenictechnology，andtheadvantagesofbuildingtransgeniclivestockswithoutSMGswerereviewed.Itwillprovidereferenceforfutherstudyingthetransgeniclivestocks.

Keywords：transgeniclivestock;selectablemarker;generemove

先期的家畜轉(zhuǎn)基因技術(shù)（如顯微注射、精子介導(dǎo)和病毒感染等方法）是依靠分子生物學(xué)技術(shù)在個體水平或胚胎水平上進(jìn)行篩選，因而不需要在轉(zhuǎn)化載體中設(shè)置選擇標(biāo)記。但這些方法不僅效率低，而且外源基因是隨機(jī)整合的，病毒感染法還存在載體安全隱患。體細(xì)胞核移植技術(shù)的出現(xiàn)，使家畜的轉(zhuǎn)基因從隨機(jī)整合發(fā)展到靶向修飾，規(guī)避了隨機(jī)整合所帶來的非預(yù)期效應(yīng)和不確定性，能有效地實行外源基因的定位整合、基因敲除和其他定向的遺傳修飾，成為目前制備轉(zhuǎn)基因家畜的主流方法之一。然而這種方法需要對轉(zhuǎn)化的細(xì)胞進(jìn)行篩選，這就必須引進(jìn)選擇標(biāo)記基因。

選擇標(biāo)記基因（Selectable marker genes， SMGs）可分為兩類：一類是指其編碼產(chǎn)物能夠使轉(zhuǎn)化的細(xì)胞具有對抗生素的抗性，在培養(yǎng)基中加入抗生素等選擇試劑，非轉(zhuǎn)化的細(xì)胞死亡或生長受到抑制，而轉(zhuǎn)化的細(xì)胞能夠繼續(xù)存活，從而將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞從大量的細(xì)胞中篩選出來的一類基因。構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物常用的這類標(biāo)記基因有 kan（卡那霉素）、amp（氨芐青霉素）、neo（氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因）、tk（胸腺嘧啶激酶基因）等。另一類也稱報告基因（Reporter gene），是指其編碼產(chǎn)物能夠被快速地測定，常用來判斷外源基因是否已經(jīng)成功地導(dǎo)入受體細(xì)胞、組織或器官，并檢測其表達(dá)活性的一類特殊用途的基因。目前轉(zhuǎn)基因動物常用的報告基因是GFP（綠色熒光蛋白基因），由GFP衍生出來的還有BFP（藍(lán)色熒光蛋白基因）、YFP（黃色熒光蛋白基因）等各種可視光的熒光蛋白基因。一旦完成篩選得到所需要的轉(zhuǎn)化細(xì)胞或完成轉(zhuǎn)基因動物的構(gòu)建之后，SMGs就變成不需要的和多余的[1]，而且這些帶有標(biāo)記基因的動物還存在安全方面的隱患：①當(dāng)人們食用了轉(zhuǎn)基因動物的產(chǎn)品，SMGs編碼蛋白有可能被轉(zhuǎn)移到人體的細(xì)胞或腸道微生物中，從而可能會降低抗生素在臨床治療中的有效性;②SMGs編碼蛋白是否會成為新的致敏原，尚不得而知;③報告基因的存在會讓消費(fèi)者產(chǎn)生一種心理排斥反應(yīng);④有研究表明，綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠與對照組比較，體重和攝食量明顯降低，部分臟器（肝臟、胸腺）發(fā)育不良，不排除外源GFP基因?qū)游锇l(fā)育存在一定毒性[2]。

因此，為了消除SMGs的安全隱患，建立無選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因家畜制備技術(shù)勢在必行。目前能夠采取的策略：一是在篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞或構(gòu)建成功目的基因表達(dá)的動物之后，刪除選擇標(biāo)記基因;二是使用無篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因技術(shù)。

1 ?SMGs的刪除技術(shù)

目前用于轉(zhuǎn)基因生物刪除選擇標(biāo)記基因的方法主要有：共轉(zhuǎn)化法、轉(zhuǎn)座子法、位點特異性重組法和染色體內(nèi)同源重組法。而應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因家畜刪除SMGs的，主要是位點特異性重組技術(shù)體系。

位點特異性重組技術(shù)是通過對特定序列進(jìn)行準(zhǔn)確切割和重新連接，從而對生物進(jìn)行遺傳改造的一種技術(shù)，是利用重組酶催化特異的重組位點間發(fā)生重組，導(dǎo)致重組位點間相互交換的一種精確重組形式。來源于微生物的位點特異性重組酶系統(tǒng)是一類很好的刪除SMGs的工具。位點特異性重組系統(tǒng)包含兩個部分：重組酶（Recombinase）和該重組酶能特異識別的位點（Recognition site）。重組酶是源于細(xì)菌或酵母可識別特異位點發(fā)生精確重組的一類酶。根據(jù)序列的同源性及催化氨基酸的特性，重組酶可分為酪氨酸和絲氨酸兩個家族。目前已使用的重組系統(tǒng)包括：FLP/FRT、Cre/LoxP、R/RS及不可逆重組系統(tǒng)等，能夠在動、植物中發(fā)生重組反應(yīng)的主要是前3類，其中Cre/LoxP在轉(zhuǎn)基因動物中研究得較為深入和廣泛。

Cre/LoxP位點特異性重組系統(tǒng)是Sternberg等[3]首先在大腸桿菌噬菌體p1中發(fā)現(xiàn)的，由Cre重組酶和LoxP位點兩部分組成。Cre重組酶是噬菌體pl編碼的分子質(zhì)量為38.5 kD的蛋白質(zhì)，有1 029個核苷酸序列編碼，能識別并催化LoxP位點的分子內(nèi)和分子間的特異性重組。根據(jù)LoxP位點的排列形式，會產(chǎn)生3種重組結(jié)果：如果2個LoxP位點位于一條DNA鏈上且方向相同，Cre重組酶能有效切除2個LoxP位點間的序列[4];如果2個LoxP位點位于一條DNA鏈上但方向相反，Cre重組酶能導(dǎo)致2個LoxP位點間的序列倒位[5];如果2個LoxP位點分別位于2條不同的DNA鏈或染色體上，Cre酶能介導(dǎo)2條DNA鏈的交換或染色體易位[6]。

利用Cre/LoxP系統(tǒng)刪除SMGs有3種方式：質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)以及在分別構(gòu)建轉(zhuǎn)Cre和轉(zhuǎn)LoxP動物的基礎(chǔ)上，通過雜交的方法刪除SMGs。

1.1 ?Cre酶的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染是指用Cre酶的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染動物細(xì)胞，利用Cre酶的表達(dá)，切除LoxP位點錨定的SMGs。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的時機(jī)，可在核移植前進(jìn)行，對動物細(xì)胞實行二次轉(zhuǎn)化，切除細(xì)胞中的SMGs，然后再核移植，獲得無SMGs的轉(zhuǎn)基因動物;也可在獲得轉(zhuǎn)基因動物之后，對轉(zhuǎn)基因動物的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，切除細(xì)胞中的SMGs，然后應(yīng)用無SMGs的細(xì)胞進(jìn)行核移植，從而獲得無SMGs的轉(zhuǎn)基因動物。

王志蕊等[7]將含有LoxP位點錨定的選擇標(biāo)記表達(dá)框（LoxP-CMV-NeoR-IRES-EGFP-Lox） 的ΔMSTN打靶載體，用電穿孔技術(shù)導(dǎo)入豬腎PK15細(xì)胞，經(jīng)G418篩選，獲得穩(wěn)定整合該載體、EGFP表達(dá)均一的單克隆細(xì)胞系;然后將重組酶表達(dá)質(zhì)粒pTurbo-Cre導(dǎo)入該細(xì)胞系，借助流式分選（FACS）、終點PCR、熒光定量PCR、TA克隆與測序等手段，證明Cre/LoxP重組系統(tǒng)可在豬細(xì)胞內(nèi)高效介導(dǎo)內(nèi)源性選擇標(biāo)記基因的刪除反應(yīng)，EGFP水平的刪除效率達(dá)到46.1%，DNA水平的刪除效率達(dá)到97.0%。然而豬腎PK15細(xì)胞畢竟是一種模型細(xì)胞，不能用于核移植生產(chǎn)克隆動物。上述技術(shù)體系尚需用分離的體細(xì)胞，如成纖維細(xì)胞等，觀察二次轉(zhuǎn)化之后細(xì)胞的生長態(tài)勢。蘭翀等[8]利用pBS185瞬間表達(dá)法刪除首次轉(zhuǎn)基因克隆內(nèi)的標(biāo)記基因，但因細(xì)胞老化嚴(yán)重，最終未獲得可供檢測用的單克隆細(xì)胞。表明用對體細(xì)胞進(jìn)行二次轉(zhuǎn)化的方法刪除SMGs，存在細(xì)胞老化的風(fēng)險。

在成功構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物之后，利用Cre酶的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)基因動物的體細(xì)胞，可以規(guī)避細(xì)胞老化的風(fēng)險，有效地刪除SMGs。Kuroiwa等[9]將Cre瞬時表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)基因牛的成纖維細(xì)胞，篩選出無SMGs的細(xì)胞用于核移植，最終獲得了無SMGs的免疫球蛋白μ鏈和PRNP雙基因敲除的牛。Wang等[10]應(yīng)用PBS185質(zhì)粒轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)基因牛成纖維細(xì)胞，通過Cre酶的瞬時表達(dá)，有80%的細(xì)胞內(nèi)SMGs被刪除。然而應(yīng)用這種方法最終獲得無SMGs的轉(zhuǎn)基因家畜，試驗周期長，成本高。

為了縮短試驗周期并防止二次轉(zhuǎn)化所引起的細(xì)胞老化，可采取細(xì)胞拯救技術(shù)[11]。所謂細(xì)胞拯救，即是在第一次轉(zhuǎn)化之后，用第一次轉(zhuǎn)化的細(xì)胞作核供體進(jìn)行核移植，獲得重構(gòu)胚;重構(gòu)胚移植到代孕母畜后，取懷孕母畜的胎兒成纖維細(xì)胞（對豬而言，取懷孕35日齡的胎兒成纖維細(xì)胞）用Cre酶的質(zhì)粒進(jìn)行第二次轉(zhuǎn)染，刪除SMGs，再以刪除SMGs的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞進(jìn)行核移植，從而獲得無SMGs的轉(zhuǎn)基因家畜。

1.2 ?Cre酶的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)

蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)可以高效地將有活性的蛋白直接轉(zhuǎn)入動物細(xì)胞中，其原理是通過重組的方法改變目的蛋白的生物特性，尤其是加入與細(xì)胞滲透性有關(guān)的蛋白結(jié)構(gòu)域，即所謂的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域（Protein transduction domains， PTDs），如TAT（反式激活蛋白，來源于人類免疫缺陷病毒HIV，由11個氨基酸組成）、FGF（疏水多肽）、NLS（核定位序列）等。Cre/LoxP重組系統(tǒng)通過蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)刪除SMGs，在動物中常用的是TAT-Cre。

許媛媛[12]將純化的TAT-Cre與轉(zhuǎn)入溶菌酶基因山羊的耳成纖維細(xì)胞共孵育，通過培養(yǎng)、挑克隆、G418敏感性試驗、PCR及Southern鑒定，最終獲得抗性基因刪除，保留了人溶菌酶基因表達(dá)框的單細(xì)胞克隆，抗性基因的刪除效率為42%。蘭翀等[8]利用TAT-Cre處理已經(jīng)過一次轉(zhuǎn)化的山羊成纖維細(xì)胞系，盡管刪除SMGs的效率可達(dá)到43.9%，但這一過程經(jīng)歷了連續(xù)兩次低密度傳代和單細(xì)胞克隆的挑取，所獲得的單細(xì)胞克隆嚴(yán)重老化，無法進(jìn)一步傳代，最終未獲得可供克隆用的單克隆細(xì)胞;而他們用TAT-Cre酶處理人溶菌酶轉(zhuǎn)基因山羊的耳成纖維細(xì)胞，成功刪除了SMGs，其刪除效率達(dá)72.8%。Yu等[13]在完成第一次修飾的基礎(chǔ)上，通過轉(zhuǎn)導(dǎo)TAT-Cre蛋白，獲得了無抗性標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因成纖維細(xì)胞，繼而通過核移植得到了轉(zhuǎn)基因克隆牛;令人欣喜的是他們通過一次遺傳轉(zhuǎn)化和一次蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)，并沒有造成細(xì)胞的老化，只是仍然殘留報告基因EGFP，修飾并不徹底。

1.3 ?通過雜交的方法刪除SMGs

通過雜交的方法獲得無SMGs的轉(zhuǎn)基因家畜，需要經(jīng)過3個步驟：Cre轉(zhuǎn)基因家畜的構(gòu)建;LoxP轉(zhuǎn)基因家畜的構(gòu)建;兩種家畜交配產(chǎn)生無SMGs的轉(zhuǎn)基因家畜。子代家畜可以在體內(nèi)表達(dá)Cre重組酶，從而將基因組內(nèi)的兩個LoxP位點間的序列切除。Carlson等[14]通過LoxP-SM-APOBEC3G轉(zhuǎn)基因豬與PGK-YFP-Cre轉(zhuǎn)基因豬交配，獲得了無SMGs的子代豬。

用這種雜交的方法刪除SMGs，試驗周期更長，成本更高，因而少有人采用。

2 ?無篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因技術(shù)

使用無篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因技術(shù)對于防范SMGs的安全風(fēng)險，顯然是最好的選擇。然而這種技術(shù)要求具備以下2項基本條件：①轉(zhuǎn)化效率高。由于有高的轉(zhuǎn)化效率，就可以通過受精卵的顯微注射，在胚胎水平或個體水平上篩選遺傳轉(zhuǎn)化的胚胎或動物。②能精確地實行靶向修飾（或定位整合）。近幾年出現(xiàn)的基因編輯技術(shù)，如鋅指核酸酶（ZFNs）技術(shù)、TALEN技術(shù)和CRISPR/Cas9技術(shù)，不僅能實現(xiàn)精確的靶向修飾，而且轉(zhuǎn)化效率高，滿足了上述2項基本要求，為制備無篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因家畜提供了可行的技術(shù)路線。

ZFNs是高效的動物基因組位點特異性修飾酶，能夠誘導(dǎo)生物體內(nèi)的DNA在特定位置產(chǎn)生雙鏈斷裂，形成“雙鏈斷裂缺口”（Double strand break，DSB）。DSB可啟動細(xì)胞內(nèi)的DNA損傷修復(fù)機(jī)制，從而實現(xiàn)靶向基因敲除或敲入。Geurts等[15]最先應(yīng)用ZFNs的DNA和mRNA進(jìn)行胚胎顯微注射，獲得遺傳修飾動物，他們將編碼ZFNs的DNA質(zhì)粒和mRNA分別顯微注射到大鼠原核期的原核或胞質(zhì)中，得到免疫球蛋白M基因（Immunoglobulin M，IgM）和Rab38基因敲除的大鼠。分析Geurts等人的試驗結(jié)果，質(zhì)粒原核注射共移植胚胎1 384枚，獲得基因敲除動物18只，其效率為1.3%;mRNA原核注射共移植胚胎389枚，獲得基因敲除動物59只，其效率為15.2%;mRNA胞質(zhì)內(nèi)注射共移植胚胎414枚，獲得基因敲除動物38只，其效率為9.2%。Meyer等[16]針對小鼠Rosa26基因設(shè)計了1對ZFN，并且將構(gòu)建的潮霉素基因同源打靶載體、β-半乳糖苷酶及Venus同源打靶載體，分別和ZFN的mRNA共同注射小鼠原核胚胎，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠，同源打靶效率為1.7%～4.5%。Lillico等[17]將 ZFN的mRNA顯微注射豬的受精卵，在得到的9頭仔豬中，有一頭實現(xiàn)了基因編輯。

TALEN效應(yīng)蛋白（Transcription activation-like effector nucleases，轉(zhuǎn)錄樣激活因子蛋白）是一種比ZFNs更容易設(shè)計、特異性更高的人工核酸內(nèi)切酶。其原理類似于ZFNs，即可在識別特定DNA序列的基礎(chǔ)上引入切割，造成雙鏈斷裂（Double-strand break， DSB），從而實現(xiàn)基因敲除和敲入[18，19]。利用TALEN技術(shù)，通過受精卵顯微注射的途徑對動物進(jìn)行基因編輯，國內(nèi)外已有多篇報道。例如：Anegon實驗室利用TALEN技術(shù)，采用胚胎注射的方法使大鼠的IgM基因產(chǎn)生突變[20]。周芳芳等[21]將TALEN mRNA顯微注射到受精卵內(nèi)，在得到的45只仔鼠中，有6只在MSTN基因靶標(biāo)位置發(fā)生了突變，基因編輯的效率為13.3%。Carlson等[22]將TALEN mRNA顯微注射到牛和豬胚胎的胞質(zhì)內(nèi)，有75%的胚胎實現(xiàn)了基因編輯。Lillico等[17]將TALEN mRNA顯微注射到豬的受精卵，在得到的39頭仔豬中，有8頭實現(xiàn)了基因編輯。

CRISPR/Cas9是一種全新的人工核酸內(nèi)切酶，Cong等[23]首次報道，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對人293T 細(xì)胞的EMX1和PVALB基因以及小鼠Nero2A細(xì)胞的Th基因?qū)崿F(xiàn)了定點突變。之后的短短一年多時間，該系統(tǒng)被成功地應(yīng)用于各種動物的基因編輯。相對于ZFNs和TALEN，CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有突變效率更高、更精確、制作簡單及成本低的特點。世界上第一個研究轉(zhuǎn)基因動物的Wang等[24]將Cas9、Tet1和Tet2特異性的sgRNA注射到小鼠受精卵中，以高達(dá)80%的效率成功地在4個位點敲除了這2個基因，得到了雙基因敲除的純合子小鼠。這種基于受精卵注射的CRISPR/Cas9技術(shù)被稱為“一步法”。Li等[25]在將CRISPR/Cas系統(tǒng)導(dǎo)入小鼠受精卵刪除大片段DNA時，其試驗的結(jié)果RNA注射比DNA注射更有效。欣喜的是，這種基于受精卵注射的CRISPR/Cas9技術(shù)（一步法）很快被成功地應(yīng)用于家畜的基因修飾中。Hai等[26]應(yīng)用CRISPR/CAS系統(tǒng)的一步法，獲得了vWF基因敲除豬。

由于ZFNs、TALEN和CRISPR/Cas9技術(shù)的高效性和精確的靶向性，可以直接采用受精卵的顯微注射技術(shù)制備轉(zhuǎn)基因家畜，從而避開標(biāo)記基因的使用。

對于制備無SMGs的轉(zhuǎn)基因家畜而言，使用無標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，相對于先引入SMGs，而后再將其刪除的復(fù)雜技術(shù)體系，具有顯而易見的優(yōu)勢：①基因操作簡便，只需構(gòu)建一次基因打靶載體，且無需引入標(biāo)記基因。②胚胎操作簡便，只需應(yīng)用受精卵的顯微注射技術(shù)，即可一步到位，從而規(guī)避了克隆技術(shù)的操作復(fù)雜、效率低下和重編程不完全所引發(fā)的一系列問題。由此，近些年有些被冷落的受精卵顯微注射技術(shù)，將作為一種制備轉(zhuǎn)基因家畜的主流技術(shù)重新受到青睞。

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