豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的分離鑒定、致病性與藥敏試驗(yàn)

田永祥+檀永強(qiáng)+劉澤文+郭銳+段正贏+楊克禮+周丹娜+羅詠梅+袁芳艷

摘要：從湖北省幾個(gè)豬場(chǎng)具有嚴(yán)重呼吸道癥狀的疑似病例中，采集了肺臟、扁桃體、關(guān)節(jié)液及心包液等病料，進(jìn)行了細(xì)菌的分離培養(yǎng)及菌落形態(tài)觀察、染色鏡檢、生化試驗(yàn)、PCR檢驗(yàn)、血清型鑒定、藥敏試驗(yàn)及致病性試驗(yàn)。結(jié)果表明，分離到的8株細(xì)菌為豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）。血清型分型鑒定結(jié)果為1型的6株，3型的2株。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離的菌株對(duì)頭孢類、先鋒霉素類表現(xiàn)較高的敏感性，為豬場(chǎng)用藥提供了科學(xué)參考。

關(guān)鍵詞：豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）;鑒定;耐藥性;致病性

中圖分類號(hào)：S858.28 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ?文章編號(hào)：0439-8114（2014）21-5204-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.21.040

Isolation Identification and Medicine Sensitivity of

Actinobcillus pleuropneumoniae

TIAN Yong-xiang1，TAN Yong-qiang2，LIU Ze-wen1，GUO Rui1，DUAN Zheng-ying1，YANG Ke-li1，ZHOU Dan-na1，LUO Yong-mei 3，YUAN Fang-yan1

（1. Institute of Animal Husbandry and Veterinary， Hubei Academy of ?Agricultural Sciences/Hubei Key Laboratory of Animal Embryo and Molecular Breeding， Wuhan ?430064， China;2.College of ?Veterinary Medicine， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China;

3. Xiangyang ?Animal Health Supervision Station， Xiangyang ?442110， Hubei， China）

Abstract： The samples of lungs， tonsils，joint ?fluids and pericardial fluids were collected from some suspected swine with serious symptoms of respiratory in Hubei province and conducted culture and identification through colonial morphology， observation，staining microscopy， biochemistry qualification， PCR， serotyping， drug sensitivity and pathogenicity examination. The results showed that the 8 isolated strains of bacteria were identified as porcine contagious Actinobacillus pleuropneumoniae. The serotype was 6 of serotype 1 and 2 of serotype 3. Results of drug susceptibility test showed that the isolated strains had high sensitivity with cephalosporins and cephalothin. It will provide a scientific reference for farm medication.

Key words： Actinobacillus pleuropneumoniae; identification.; antimicrobial resistance; pathogenicity

豬傳染性胸膜肺炎（Porcine contagious pleuropneumia， PCP）是由胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）引起的一種高度傳染性呼吸道疾病，能引起豬的胸膜肺炎和肺炎等。隨著養(yǎng)豬業(yè)的規(guī)?；⒓s化發(fā)展，該病已經(jīng)成為嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要呼吸道疾病之一[1]。根據(jù)APP生長(zhǎng)是否需要煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide Adenine dinucleotide， NAD），分為兩個(gè)生物型，即生物I型（NAD依賴菌株）和生物Ⅱ型（非NAD依賴型），根據(jù)APP表面莢膜多糖和脂多糖抗原性的不同，又分為15個(gè)血清型，生物I型包括血清型1-12型和15型[2]。本研究對(duì)湖北省武漢市、宜昌市等地的多個(gè)豬場(chǎng)采集了疑似病豬的肺臟、關(guān)節(jié)液等病料，進(jìn)行了細(xì)菌分離培養(yǎng)及鑒定，通過(guò)分型及藥敏試驗(yàn)，初步了解了豬場(chǎng)PCP的發(fā)病情況，篩選出了高敏藥物，為豬場(chǎng)臨床用藥提供了依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?病料 ?病料來(lái)源于湖北省武漢市、宜昌市等多個(gè)豬場(chǎng)的病豬。發(fā)病豬臨床表現(xiàn)為體溫升高、皮膚發(fā)紺、呼吸困難、咳嗽、食欲減退或廢絕、呈犬坐姿勢(shì)等癥狀。對(duì)病、死豬剖檢后發(fā)現(xiàn)纖維素性出血性及纖維素性壞死性支氣管肺炎，病變區(qū)有纖維素滲出、胸膜有纖維素附著，并有鄰近胸膜黏連，肺部有界限明顯的膿腫。共收集肺臟、扁桃體、關(guān)節(jié)液、心包液等病料64份。

1.1.2 ?培養(yǎng)基及相關(guān)試劑 ?TSA、TSB培養(yǎng)基及NAD購(gòu)自Becton公司;新生牛血清購(gòu)自四季青生物工程有限公司;微量生化鑒定管、藥敏片購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司;引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.1.3 ?標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清 ?1-12型APP標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清為湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)室制備并保存。

1.1.4 ?試驗(yàn)動(dòng)物 ?6周齡雌性BALB/c小鼠，購(gòu)自湖北省預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院。試驗(yàn)前檢測(cè)APP抗體為陰性。

1.2 ?方法

1.2.1 ?細(xì)菌的分離培養(yǎng)與染色鏡檢 ?無(wú)菌條件下將患病豬的肺臟、扁桃體、關(guān)節(jié)液、心包液等涂布于TSA培養(yǎng)基（含終濃度10 μg/mL NAD和5%新生牛血清，下同），于5%CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)16～24 h后，進(jìn)一步將疑似菌落劃線接種TSA培養(yǎng)基上進(jìn)行純化。純化后的菌落涂片，革蘭氏染色后鏡檢。用30%無(wú)菌甘油凍存于-70 ℃冰箱中。

1.2.2 ?菌株的PCR檢測(cè)及血清型鑒定 ?APP外毒素IV（ApxIV）存在于所有血清型中，具有種特異性的特征，設(shè)計(jì)并合成ApxIV基因截短片段引物（P上：5′-TGGCACTGACGGTGATGA-3′;P下：5′-GGCCATCGACTCAACCAT-3′）。挑取疑似APP并純化的單菌落裂解，作為PCR擴(kuò)增的模板，空白對(duì)照用等體積的去離子水代替模板，陽(yáng)性對(duì)照為實(shí)驗(yàn)室保存的1-12型APP標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清。

血清型鑒定：采用平板凝集試驗(yàn)鑒定其血清型。將PCR檢驗(yàn)為陽(yáng)性的菌株接種至TSB培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期。用生理鹽水漂洗后，制成細(xì)菌懸液。取1滴細(xì)菌懸液分別與1-12型APP標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清均勻混合，在2 min內(nèi)觀察結(jié)果，出現(xiàn)50%（++）以上凝集者為陽(yáng)性，2 min內(nèi)不凝集（-）者為陰性，介于上述兩者之間為可疑。

1.2.3 ?生化試驗(yàn) ?將分離并鏡檢后的菌株分別接種至不同的微量生化試管（含0.02%NAD）進(jìn)行生化試驗(yàn)，試驗(yàn)項(xiàng)目包括乳糖、葡萄糖、果糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露醇、山梨醇、靛基質(zhì)、甲基紅、尿素酶和MR/V-P試驗(yàn)等，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，觀察并記錄試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.4 ?藥敏試驗(yàn) ?參考CLSI（Clinical and Laboratory Standards Institute）所推薦的紙片擴(kuò)散法（K-B法）進(jìn)行[3]。無(wú)菌條件下，挑取純化并鑒定的單菌落于3 mL TSB培養(yǎng)液中，培養(yǎng)10～12 h后，再取菌液（稀釋到1.0×108 CFU/mL）均勻涂布于TSA培養(yǎng)基，用無(wú)菌鑷子將29種（氨曲南、環(huán)丙氟哌酸、氨芐西林、阿莫西林、苯唑西林、哌拉西林、亞胺配能、復(fù)方新諾明、左氧氟沙星、頭孢吡肟、頭孢西丁、頭孢曲松、頭孢呋辛、頭孢噻肟、青霉素、氯霉素、鏈霉素、丁胺卡那霉素、克林霉素、萬(wàn)古霉素、多粘霉素B、四環(huán)素、利福平、復(fù)達(dá)欣、先鋒必、先鋒霉素V、呋喃妥因、氧氟沙星、諾氟沙星）藥敏紙片分別平貼于培養(yǎng)基表面。培養(yǎng)24 h后，測(cè)量抑菌圈直徑。并按常規(guī)藥敏試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)判定分離菌株對(duì)不同抗生素的敏感程度[4]。

1.2.5 ?小鼠致病性試驗(yàn) ?參照文獻(xiàn)[5]的方法，分別選取APP血清1型和3型各1株接種TSB培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)12 h，再以1∶1 000的稀釋度接種于新的TSB培養(yǎng)基中，200 r/min培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期（OD600 nm≈0.8）。首先開(kāi)展預(yù)試驗(yàn)：將菌液通過(guò)10倍倍比稀釋到1.0×106～1.6×1010 CFU/mL，每個(gè)稀釋度接種4只小鼠，每只小鼠腹腔注射菌液200 μL，持續(xù)觀察5 d，統(tǒng)計(jì)致90%以上小鼠死亡的最低菌液劑量和致10%以下小鼠死亡的最高菌液劑量，作為正式試驗(yàn)的劑量界線。正式試驗(yàn)：菌液采用2.0～2.5倍倍比稀釋（劑量范圍必須涵蓋預(yù)試驗(yàn)的界線值），每個(gè)稀釋度接種10只小鼠（注射劑量及方法同預(yù)試驗(yàn)），觀察7 d，統(tǒng)計(jì)各組死亡情況。根據(jù)Reed-Meunch法計(jì)算半數(shù)致死量（LD50）。另外采集死亡小鼠肺臟無(wú)菌接種TSA培養(yǎng)基并分離菌株，按“1.2.2”方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?細(xì)菌的形態(tài)特征

在TSA血清平板培養(yǎng)24～48 h后，可看到半透明、露珠樣的小菌落，直徑為1～2 mm。大部分菌株產(chǎn)生β溶血。取典型菌落革蘭氏染色后鏡檢，結(jié)果為革蘭氏陰性菌，大多為短桿菌、球桿菌（圖1）。

2.2 ?分離菌株的PCR鑒定及分型鑒定結(jié)果

本試驗(yàn)以疑似APP并純化的單菌落裂解后為模板，通過(guò)擴(kuò)增ApxIV，結(jié)果有8株擴(kuò)增出約442 bp的條帶（圖2）。將PCR擴(kuò)增結(jié)果為陽(yáng)性的菌株與1-12型APP標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清進(jìn)行平板凝集反應(yīng)，結(jié)果（表1）顯示，所分離的8株APP菌株中，血清1型的有6株，血清3型的有2株。

2.3 ?生化試驗(yàn)結(jié)果

從分離的8株APP菌株中，每種血清型挑取1株進(jìn)行生化試驗(yàn)，其結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，APP血清1型和3型生長(zhǎng)均需要NAD;可發(fā)酵乳糖、葡萄糖、果糖;不發(fā)酵山梨醇、甘露醇、鼠李糖及阿拉伯糖;可水解尿素酶;甲基紅、靛基質(zhì)、V-P試驗(yàn)均為陰性。

2.4 ?藥敏試驗(yàn)結(jié)果

由表3可見(jiàn)，APP血清1型和血清3型對(duì)藥物的敏感度大致是一樣的。對(duì)阿莫西林、哌拉西林、亞胺配能、頭孢類抗生素、青霉素、氯霉素、萬(wàn)古霉素、利福平、先鋒必、先鋒霉素V等敏感，對(duì)環(huán)丙氟哌酸、復(fù)方新諾明、復(fù)達(dá)欣、氧氟沙星等藥物中敏，對(duì)氨曲南、氨芐西林、苯唑西林、左氧氟沙星、鏈霉素、丁胺卡那霉素、克林霉素、多粘霉素B、四環(huán)素、諾氟沙星等藥物則耐藥。APP血清1型對(duì)呋喃妥因敏感，APP血清3型則表現(xiàn)為中敏。

2.5 ?小鼠致病性試驗(yàn)結(jié)果

分別用分離的APP菌株攻毒小鼠，7 d后小鼠死亡情況見(jiàn)表4。根據(jù)Reed-Meunch法計(jì)算細(xì)菌的半數(shù)致死量（LD50）。其計(jì)算公式為：

logLD50=XK-i（∑P-0.5）

式中，XK為最高對(duì)數(shù)劑量，i為相鄰兩對(duì)數(shù)劑量的差值;P為各劑量組的死亡率。

由表4可見(jiàn)，分離的APP血清1型較血清3型對(duì)小鼠的致病力要稍強(qiáng)。

3 ?小結(jié)與討論

近年來(lái)，豬傳染性胸膜肺炎成為養(yǎng)豬業(yè)的呼吸系統(tǒng)的主要傳染病之一，幾乎遍及全世界所有養(yǎng)豬國(guó)家，流行日趨嚴(yán)重，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[6]。APP是引起豬傳染性胸膜肺炎的主要病原菌，屬于巴氏桿菌。但是，APP分離比較困難，為了提高APP的分離率，應(yīng)盡量采集瀕臨死亡或者病重豬只的病料，最好在采集病料前1周停止用藥。APP對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求較高，需要添加小牛血清和NAD。

從藥敏試驗(yàn)結(jié)果可以看出分離到的APP血清1型和3型菌株對(duì)同種藥物的敏感性無(wú)顯著差異。所分離的胸膜肺炎放線桿菌對(duì)頭孢類、先鋒霉素類（先鋒必和先鋒霉素V）表現(xiàn)較高的敏感性，可作為本地區(qū)治療豬傳染性胸膜肺炎的參考藥物;但對(duì)諾氟沙星、氨芐西林、四環(huán)素等10種藥物則不敏感，這可能為豬場(chǎng)在使用這些抗生素時(shí)加大劑量或不規(guī)范使用所導(dǎo)致，值得警惕。

參考文獻(xiàn)：

[1] 余 ?燕，馬金友，王天有，等.豬接觸性傳染性胸膜肺炎的診治[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（8）：107-108.

[2] 唐文山，李 ?昕.豬傳染性胸膜肺炎研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2008， 29（2）：98-102.

[3] MATYUS S P，BRAUN P J，WOLAK-DINSMORE J，et al. NMR measurement of LDL particle number using the Vantera？ clinical analyzer[J]. Clin Biochem，2014（7）：15.

[4] 何啟蓋，王貴平，劉軍發(fā)，等.豬胸膜肺炎放線桿菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2003，25（5）：360-363.

[5] 劉金林.胸膜肺炎放線桿菌毒素ApxIVA的致病性及基因缺失弱毒疫苗研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[6] 達(dá)來(lái)寶力格.胸膜肺炎放線桿菌生物被膜突變體的篩選與生物學(xué)特性的研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

（責(zé)任編輯 ?曾德芳）

2.5 ?小鼠致病性試驗(yàn)結(jié)果

分別用分離的APP菌株攻毒小鼠，7 d后小鼠死亡情況見(jiàn)表4。根據(jù)Reed-Meunch法計(jì)算細(xì)菌的半數(shù)致死量（LD50）。其計(jì)算公式為：

logLD50=XK-i（∑P-0.5）

式中，XK為最高對(duì)數(shù)劑量，i為相鄰兩對(duì)數(shù)劑量的差值;P為各劑量組的死亡率。

由表4可見(jiàn)，分離的APP血清1型較血清3型對(duì)小鼠的致病力要稍強(qiáng)。

3 ?小結(jié)與討論

近年來(lái)，豬傳染性胸膜肺炎成為養(yǎng)豬業(yè)的呼吸系統(tǒng)的主要傳染病之一，幾乎遍及全世界所有養(yǎng)豬國(guó)家，流行日趨嚴(yán)重，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[6]。APP是引起豬傳染性胸膜肺炎的主要病原菌，屬于巴氏桿菌。但是，APP分離比較困難，為了提高APP的分離率，應(yīng)盡量采集瀕臨死亡或者病重豬只的病料，最好在采集病料前1周停止用藥。APP對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求較高，需要添加小牛血清和NAD。

從藥敏試驗(yàn)結(jié)果可以看出分離到的APP血清1型和3型菌株對(duì)同種藥物的敏感性無(wú)顯著差異。所分離的胸膜肺炎放線桿菌對(duì)頭孢類、先鋒霉素類（先鋒必和先鋒霉素V）表現(xiàn)較高的敏感性，可作為本地區(qū)治療豬傳染性胸膜肺炎的參考藥物;但對(duì)諾氟沙星、氨芐西林、四環(huán)素等10種藥物則不敏感，這可能為豬場(chǎng)在使用這些抗生素時(shí)加大劑量或不規(guī)范使用所導(dǎo)致，值得警惕。

參考文獻(xiàn)：

[1] 余 ?燕，馬金友，王天有，等.豬接觸性傳染性胸膜肺炎的診治[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（8）：107-108.

[2] 唐文山，李 ?昕.豬傳染性胸膜肺炎研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2008， 29（2）：98-102.

[3] MATYUS S P，BRAUN P J，WOLAK-DINSMORE J，et al. NMR measurement of LDL particle number using the Vantera？ clinical analyzer[J]. Clin Biochem，2014（7）：15.

[4] 何啟蓋，王貴平，劉軍發(fā)，等.豬胸膜肺炎放線桿菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2003，25（5）：360-363.

[5] 劉金林.胸膜肺炎放線桿菌毒素ApxIVA的致病性及基因缺失弱毒疫苗研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[6] 達(dá)來(lái)寶力格.胸膜肺炎放線桿菌生物被膜突變體的篩選與生物學(xué)特性的研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

（責(zé)任編輯 ?曾德芳）

2.5 ?小鼠致病性試驗(yàn)結(jié)果

分別用分離的APP菌株攻毒小鼠，7 d后小鼠死亡情況見(jiàn)表4。根據(jù)Reed-Meunch法計(jì)算細(xì)菌的半數(shù)致死量（LD50）。其計(jì)算公式為：

logLD50=XK-i（∑P-0.5）

式中，XK為最高對(duì)數(shù)劑量，i為相鄰兩對(duì)數(shù)劑量的差值;P為各劑量組的死亡率。

由表4可見(jiàn)，分離的APP血清1型較血清3型對(duì)小鼠的致病力要稍強(qiáng)。

3 ?小結(jié)與討論

近年來(lái)，豬傳染性胸膜肺炎成為養(yǎng)豬業(yè)的呼吸系統(tǒng)的主要傳染病之一，幾乎遍及全世界所有養(yǎng)豬國(guó)家，流行日趨嚴(yán)重，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[6]。APP是引起豬傳染性胸膜肺炎的主要病原菌，屬于巴氏桿菌。但是，APP分離比較困難，為了提高APP的分離率，應(yīng)盡量采集瀕臨死亡或者病重豬只的病料，最好在采集病料前1周停止用藥。APP對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求較高，需要添加小牛血清和NAD。

從藥敏試驗(yàn)結(jié)果可以看出分離到的APP血清1型和3型菌株對(duì)同種藥物的敏感性無(wú)顯著差異。所分離的胸膜肺炎放線桿菌對(duì)頭孢類、先鋒霉素類（先鋒必和先鋒霉素V）表現(xiàn)較高的敏感性，可作為本地區(qū)治療豬傳染性胸膜肺炎的參考藥物;但對(duì)諾氟沙星、氨芐西林、四環(huán)素等10種藥物則不敏感，這可能為豬場(chǎng)在使用這些抗生素時(shí)加大劑量或不規(guī)范使用所導(dǎo)致，值得警惕。

參考文獻(xiàn)：

[1] 余 ?燕，馬金友，王天有，等.豬接觸性傳染性胸膜肺炎的診治[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（8）：107-108.

[2] 唐文山，李 ?昕.豬傳染性胸膜肺炎研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2008， 29（2）：98-102.

[3] MATYUS S P，BRAUN P J，WOLAK-DINSMORE J，et al. NMR measurement of LDL particle number using the Vantera？ clinical analyzer[J]. Clin Biochem，2014（7）：15.

[4] 何啟蓋，王貴平，劉軍發(fā)，等.豬胸膜肺炎放線桿菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2003，25（5）：360-363.

[5] 劉金林.胸膜肺炎放線桿菌毒素ApxIVA的致病性及基因缺失弱毒疫苗研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[6] 達(dá)來(lái)寶力格.胸膜肺炎放線桿菌生物被膜突變體的篩選與生物學(xué)特性的研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

（責(zé)任編輯 ?曾德芳）