孫 昊，劉建國，朱桂梅，李海云，郝再彬

(桂林理工大學化學與生物工程學院，中國桂林 541004)

工業(yè)生產(chǎn)劍麻纖維時剩余的抽絲汁液和殘渣中含有豐富的劍麻皂苷資源，轉化提取出的皂苷元可以改善小鼠糖耐量［1］;劍麻皂苷元能明顯降低四氧嘧啶糖尿病小鼠的血糖水平，對腎上腺素高血糖大鼠也有降血糖作用［2］.劍麻皂苷元(Tigogenin，圖1)是螺甾烷醇的衍生物，是合成甾體激素類藥物的醫(yī)藥中間體和重要原料，廣泛應用于腎上腺皮質(zhì)激素、性激素及蛋白同化激素，三大類激素可以制造200 多種藥物［3-4］.用甲醇提取劍麻葉汁中的化合物，分離得到5 個甾體皂苷A、B、C、D、E［5］，均可用于皂苷元的轉化.藥理研究表明，這種皂苷元成分具有較明顯的抗炎、抗菌、止血、抗衰老和降血糖的生物活性［6］.

圖1 皂苷元結構Fig.1 The structure of tigogenin

目前工業(yè)生產(chǎn)劍麻皂苷元采用硫酸加熱回流提取法，通過多次醇提酸解皂苷得到皂苷元產(chǎn)品.大量［7］醇和酸對環(huán)境造成很大危害，同時也提高了生產(chǎn)成本.因此，新型的無污染低能耗的劍麻皂苷元生產(chǎn)方法亟待研究與開發(fā)，本實驗篩選出產(chǎn)生劍麻皂苷元的高活性發(fā)酵微生物，為工業(yè)化生產(chǎn)開辟了一條新途徑.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與培養(yǎng)基 土壤樣品:實驗室采集桂林喀斯特地貌的土壤樣品200 份.篩選培養(yǎng)基:絞股藍皂苷2 g;瓊脂2 g;硫酸亞鐵0.001 g;硫酸鎂0.05 g;氯化鈉0.05 g;磷酸氫二鉀0.05 g;硝酸鉀0.1 g;水100 mL，用1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH 至7.5，121 ℃滅菌20 min，搖勻后倒平板.

1.1.2 試劑與儀器 試劑:劍麻皂苷元標準品(98%，HPLC 純，上海研生生物技術有限公司);劍麻殘渣(廣西劍麻集團);絞股藍皂苷(惠州市仙草植物保健科技有限公司);無水乙醇、甲醇、氯化鈉、硫酸鎂、硫酸亞鐵、磷酸氫二鉀、硝酸鉀、氫氧化鈉、鹽酸、香草醛、乙酸、高氯酸，以上試劑均為分析純.

儀器:TU-1800S 紫外分光光度計(美國VARIAN 公司);BS110S(塞多利斯)電子天平(北京塞多利斯有限公司);LRH-150-Z 振蕩培養(yǎng)箱(廣東省醫(yī)療器械廠);DK-S24 型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設備有限公司);垂直流超凈工作臺(上海智城分析儀器公司);立式壓力蒸汽滅菌器(上海博迅實業(yè)有限公司);島津LC-20AB 高效液相色譜儀，ELSD 檢測器;氮氣(99.9%，廣西桂林海灣恒日化工氣體有限公司);KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);SIGMA 3K30 離心機(德國希格瑪離心機有限公司).

1.2 實驗方法

1.2.1 制備皂苷標準曲線 比色法［8］:稱量標準品劍麻皂苷5.00 mg，用甲醇溶解并定容至5 mL.分別吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 和0.7 mL 置于25 mL 具塞試管中，以空白管作對照，在70 ℃下烘干后冷卻至室溫.各管中依次加入5%香草醛冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，搖勻后置于70 ℃烘箱中加熱15 min，取出后迅速流水冷卻至室溫，再分別加入5 mL 冰醋酸，搖勻，于450 nm 處測定吸光度.以質(zhì)量為橫坐標，吸光度為縱坐標制備標準曲線.

色譜法［9-12］:Shim-pack VP-ODS C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm)，ELSD-LTⅡ檢測器，漂移管溫度40 ℃，載氣壓力350 kPa，流動相為甲醇和水(體積比V(甲醇)∶V(水)=9∶1)，流速1.0 mL/min，進樣量10 μL，時間35 min.稱量劍麻皂苷元標準品，甲醇為溶劑制備1 g/L 標準溶液定容于容量瓶.

1.2.2 菌種篩選 初篩:將標記好的土壤樣品置于小花盆中，加入劍麻殘渣以及PDA 營養(yǎng)液，陰涼避光處放置一個月，期間周期性補充水分和營養(yǎng)液.

復篩:取初篩小花盆中的土壤樣品，在篩選培養(yǎng)基上劃線，由于皂苷有很強的抑菌性，一般的微生物種群難以在該培養(yǎng)基上生長，利用這種選擇性即可初步得到可用的菌種群，再對其進行液體發(fā)酵培養(yǎng)測定產(chǎn)物含量，獲得高活性菌種.

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)方法 制備發(fā)酵液:取干燥劍麻殘渣打碎，加入自來水調(diào)至質(zhì)量濃度為75 g/L，加熱至沸騰2 h，4 500 r/min 離心取上清液作為發(fā)酵液.發(fā)酵培養(yǎng):按1%接種量將菌液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基(300 mL 瓶裝液150 mL)，于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)30 ℃下250 r/min 震蕩培養(yǎng).

1.2.4 發(fā)酵產(chǎn)物皂苷元檢測 發(fā)酵結束后瓶中的發(fā)酵液4 500 r/min 離心，沉淀即含有皂苷元代謝物，烘干粉碎后用三氯甲烷(20 mL/g 沉淀物)超聲震蕩提取60 min，提取液4 500 r/min 離心取上清液旋蒸濃縮后烘干得粉末，蒸餾水洗3 次，烘干作為待測樣品，進行HPLC 檢測.另取一部分待測樣品溶于無水乙醇，常溫下進行結晶，得到的樣品晶體進行單晶衍射測定樣品結構.

1.2.5 發(fā)酵條件優(yōu)化

(1)溫度:將發(fā)酵瓶分別置于20、25、30、35、40、45、50 ℃環(huán)境下培養(yǎng)一周.

(2)pH 值:調(diào)節(jié)發(fā)酵液初始pH 分別為4、5、6、7、8、9、10，恒溫震蕩培養(yǎng)一周.

(3)發(fā)酵時間:發(fā)酵時間分別為1、2、3、4、5、6、7 d，恒溫震蕩培養(yǎng).

(4)底物濃度:調(diào)節(jié)發(fā)酵液皂苷為2、4、6、8、10、12、14 g/L，恒溫震蕩培養(yǎng)一周.

圖2 劍麻皂苷標準曲線Fig.2 The standard curve of tigogenin(sisalagenin)

2 結果與討論

2.1 檢測方法

按照1.2.1 中所述方法繪制標準曲線(圖2)，劍麻皂苷質(zhì)量為0.1～0.7 mg，曲線方程為y=1.459 8x+0.030 7，R2為0.992 2，相關性較好，本實驗中對發(fā)酵液中皂苷質(zhì)量的測定均采用此法.

2.2 菌種篩選

通過對200 份土壤樣品的初篩和復篩，共得到有降解皂苷效果的菌株13 株(表1)，其中JM-4、JM-5、JM-7 和JM-12 這4 種菌株效果比較明顯，最終選擇降解率最高的菌種JM-7 號作為目的菌種進行后續(xù)實驗.

表1 13 個菌株降解劍麻皂苷的效果Tab.1 Effect of the thirteen microorganisms for sisalagenin degradation

2.3 發(fā)酵產(chǎn)物測定

按照1.2.4 中所述方法對待測樣品采用HPLC 檢測，如圖3所示劍麻皂苷元的保留時間為24.5 min，樣品與其標準品在保留時間和峰形上能夠完全重合.按照1.2.4 中所述方法使用單晶衍射測得樣品結構如圖4所示，與皂苷元標準品圖1 進行比對，兩者結構完全相同，可以確定發(fā)酵產(chǎn)物為皂苷元.

圖3 劍麻皂苷元高壓液相色譜圖(注:左-劍麻皂苷元標準品，右-劍麻皂苷元樣品)Fig.3 High pressure liquid chromatogram(Left-standard; Right-sample)

圖4 單晶衍射測定樣品結構圖Fig.4 The structure of sample detected by single crystal diffraction

2.4 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.4.1 最適溫度 溫度對于劍麻皂苷降解率的影響如圖5(A)，從圖中可以看出在30 ℃條件下發(fā)酵后劍麻皂苷降解率最高，達到52.6%，隨著溫度改變降解率降低，故最適溫度為30 ℃.

2.4.2 最適pH 如圖5(B)所示，發(fā)酵液pH 為6 時發(fā)酵后劍麻皂苷的降解率最高，為53%，pH 值改變后降解率顯著下降，故確定發(fā)酵液最適pH 為6.

2.4.3 最適發(fā)酵時間 不同發(fā)酵時間后JM-7 對劍麻皂苷的降解率如圖5(C)，由圖可知，降解率隨發(fā)酵時間的增加而逐步增大，發(fā)酵5 d 時降解率基本穩(wěn)定在53%，此后繼續(xù)發(fā)酵降解率基本無變化，增加發(fā)酵時間則無意義，故最優(yōu)發(fā)酵時間為5 d.

2.4.4 最適底物濃度 如圖5(D)所示，由于劍麻皂苷本身具有較強的抑菌性，故隨著皂苷質(zhì)量濃度的增大降解率明顯下降，皂苷為2 g/L 時降解率最高，但考慮到降解皂苷的總量需要找到底物質(zhì)量濃度盡可能大的一組，通過計算得出底物質(zhì)量濃度為6 g/L 時降解掉的皂苷總量最大，故最適底物質(zhì)量濃度為6 g/L.

圖5 不同溫度、pH、發(fā)酵時間、底物質(zhì)量濃度下JM-7 對劍麻皂苷的降解率Fig.5 Degradation of sisalagenin for JM-7 in different temperature，pH，time and substrate concentration

3 結論

通過多次篩選得到了一種能夠降解劍麻皂苷生產(chǎn)劍麻皂苷元的高活性微生物，該菌種在偏酸性、低濃度發(fā)酵液中有著良好的降解能力，發(fā)酵5 d 后降解率達到53%，使用HPLC 方法和單晶衍射方法檢測其發(fā)酵產(chǎn)物，可以確定其發(fā)酵產(chǎn)物為劍麻皂苷元.對其進行了不同發(fā)酵溫度、發(fā)酵液pH、發(fā)酵時間和底物質(zhì)量濃度下發(fā)酵的初步研究，得到最優(yōu)發(fā)酵條件為:溫度30 ℃，pH 6，發(fā)酵時間5 d，底物質(zhì)量濃度6 g/L，該微生物的發(fā)現(xiàn)為工業(yè)化生產(chǎn)劍麻皂苷元提供了新的方法.

［1］李燕婧，周桂芬，韋善新，等.劍麻皂苷藥理作用的實驗研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2006，17(10):1958-1959.

［2］賴克道，李燕婧，李 茂.劍麻皂苷降血糖作用的研究［J］.廣西科學院學報，2010，26(1):56-58.

［3］吳立軍，婁紅祥，周 晶.天然藥物化學［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2011.

［4］計志忠.化學制藥工藝學［M］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，1997.

［5］DING Y，TIAN R H，YANG C R，et al.Two new steroidal saponins from dried femented residues of leaf-juices of A gave sisalana form a dong No 1［J］.Chem Pham Bull，1993，41:557-560.

［6］宣偉東，陳海生，譚興起，等.HPLC-ELSD 法測定刺蒺藜中甾體皂苷TTS-12 含量［J］.第二軍醫(yī)大學學報，2005，26(2):222-223.

［7］周 寅，張夢宇，白 楊，等.劍麻皂苷的分離純化工藝研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2011，39(8):4540-4542.

［8］馬 超，丁 怡，王 偉，等.劍麻總皂苷制備工藝研究［J］.中國中藥雜志，2005，30(5):391-393.

［9］LAU A J，SEO B H，WOO S O，et al.High-performance liquid chromatographic method with quantitative comparisons of whole chromatograms of raw and steamed Panax notoginseng［J］.J Chromatorg A，2004，1057(1):141-149.

［10］LI L，ZHANG J L，SHENG Y X，et al.Simultaneous quantification of six major active saponins of Panax notoginseng by highperformance liquid chromatography-UV method［J］.J Pharmaceut Biomed，2005，38(1):45-51.

［11］LAU A J，WOO S O，KOH H L，et al.Analysis of saponins in raw and steamed Panax notoginseng using high-performance liquid chromatography with diode array detection［J］.J Chromatorg A，2003，1011(1):77-87.

［12］WAN J B，LAI C M，LI S P，et al.Simultaneous determination of nine saponins from Panax notoginseng using HPLC and pressurized liquid extraction［J］.J Pharmaceut Biomed，2006，41(1):274-279.