田昕竹 ,陳世寶 ,王學(xué)東 ,林 蕾 (.首都師范大學(xué)資源環(huán)境與旅游學(xué)院,北京 00048；.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所,北京 0008)

大量研究表明[1-2],土壤中重金屬的生物毒性不僅與其總量有關(guān),更大程度上取決于其形態(tài)分布特征.進(jìn)入土壤中的鋅(Zn)按其存在形態(tài)可分為有機(jī)態(tài) Zn和無(wú)機(jī)形態(tài) Zn,其中,無(wú)機(jī)態(tài)鋅包括代換態(tài)、礦物結(jié)合態(tài)及土壤溶液中的自由Zn2+等.不同結(jié)合形態(tài)的Zn在不同性質(zhì)土壤中含量有很大差異,且不同形態(tài)的Zn之間可以相互轉(zhuǎn)化.對(duì)大多數(shù)酸性土壤而言,交換態(tài) Zn含量較高,無(wú)定形鐵結(jié)合態(tài)較低;而中性土壤中有機(jī)結(jié)合態(tài)Zn及無(wú)定形鐵結(jié)合態(tài)Zn含量較高;而石灰性土壤則以碳酸鹽結(jié)合態(tài)、無(wú)定形鐵結(jié)合態(tài)及松結(jié)有機(jī)態(tài)含量較高[2-4].資料表明,進(jìn)入土壤中的鋅大約90%以上為硅鋁酸鹽礦物態(tài)和氧化鐵結(jié)合態(tài)形式存在,而自由離子態(tài)和交換態(tài)含量之和不足10%[5].影響土壤中Zn形態(tài)分布的因素很多,包括進(jìn)入土壤中的Zn來(lái)源、數(shù)量及種類;土壤理化性質(zhì)如pH值、Eh、土壤質(zhì)地、陽(yáng)離子交換量;土壤中膠體種類、數(shù)量及溶液離子組成等[2,5-6].

在土壤溶液中,相對(duì)其他金屬離子形態(tài),自由Zn2+更易被植物吸收而產(chǎn)生植物毒性[7].土壤中金屬離子與可溶性有機(jī)碳化合物(DOC)的絡(luò)(螯)合過(guò)程導(dǎo)致金屬離子的生物有效性降低.目前,為了研究自由金屬離子對(duì)生物體毒害的影響,在測(cè)定溶液中金屬離子形態(tài)時(shí),建立了以自由離子活度為基礎(chǔ)的模型-自由離子活度模型(FIAM)[8].自由離子是金屬生物有效性/毒性的重要離子形態(tài)[9],但是該模型僅僅基于自由離子活度,而忽視了溶液其他形態(tài)的離子對(duì)生物毒性的貢獻(xiàn),如Ca2+, Mg2+, Fe2+, K+, Na+, H+,, Cl-, HCO3-等對(duì)生物受體位點(diǎn)上離子的競(jìng)爭(zhēng)[10].而在 Zn的生物毒性研究中,已有研究證明H+、Mg2+和K+可以減少 Zn毒害的作用[11];但針對(duì)溶液的物理化學(xué)性質(zhì)及其陰離子組成對(duì)土壤中Zn的生物毒性的影響還鮮見(jiàn)報(bào)道.本研究利用基礎(chǔ)誘導(dǎo)硝化(SIN)作為測(cè)試終點(diǎn),分別利用離子色譜和 WHAM6.0模型對(duì)土壤溶液的主要離子含量特征及自由Zn2+進(jìn)行測(cè)定,對(duì)不同性質(zhì)土壤的溶液性質(zhì)及其陰離子組成與土壤Zn的微生物毒性間的相互關(guān)系進(jìn)行了研究,以期為 Zn污染土壤的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)提供參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試土壤及處理

根據(jù)我國(guó)地帶性土壤分布特征,采集了全國(guó)范圍內(nèi) 12個(gè)不同地區(qū)的地帶性耕層土壤(0～20cm).所有土樣經(jīng)室內(nèi)風(fēng)干后剔除植物殘?bào)w、根系、石塊等雜物,然后過(guò)2mm尼龍篩后備用,土壤基本理化性質(zhì)見(jiàn)表1.

按照預(yù)備實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,向不同 pH值的土壤添加不同濃度的Zn(ZnCl2母液)制備成二份不同濃度 Zn污染的土壤,一份用于微生物毒性測(cè)定,另外一份用于土壤溶液提取.具體添加濃度為:pH<4.5:0, 50, 100, 200, 400, 600, 800,1000mg/kg;pH 4.5～7.0:0, 100, 200, 400, 600, 800,1200, 1600mg/kg;pH > 7.0:0, 200, 400, 600, 800,1200, 1600, 2400mg/kg. 添加方法為:按照每種土壤的 70%最大田間持水量(WHC)分別向1000g土壤中噴施不同體積ZnCl2的母液,充分?jǐn)嚢杈鶆?平衡2周后分成2份,使用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定土壤中 Zn的準(zhǔn)確含量,以標(biāo)準(zhǔn)土壤(GSS-6)進(jìn)行測(cè)定質(zhì)量控制[12].

1.2 土壤微生物毒性測(cè)定

土壤微生物毒性常用測(cè)定方法包括基礎(chǔ)誘導(dǎo)呼吸(SIR)及基礎(chǔ)誘導(dǎo)硝化(SIN)等,而根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果,SIN測(cè)試方法對(duì)土壤中重金屬微生物毒性具有較高的敏感性. 對(duì)不同Zn污染土壤潛在硝化速率的測(cè)定參考文獻(xiàn)方法進(jìn)行[6,13]:稱取不同Zn處理土壤7.0g于50mL塑料離心管中進(jìn)行微宇宙培養(yǎng),管號(hào)為1、2、3號(hào),培養(yǎng)條件為黑暗,通風(fēng),(20±2)℃恒溫,14d 預(yù)培養(yǎng)后,利用SAN++連續(xù)流動(dòng)分析儀(SKALAR 公司,荷蘭)測(cè)定1號(hào)樣品中和.剩下2號(hào)、3號(hào)樣品添加0.5mL 0.044M (NH4)2SO4,繼續(xù)培養(yǎng)7d,培養(yǎng)結(jié)束,添加 KCl溶液、振蕩、離心,測(cè)定、含量,并將平均值記為N2.

土壤基礎(chǔ)誘導(dǎo)硝化(SIN)的計(jì)算方法如式(1):

式中:SIN為基礎(chǔ)誘導(dǎo)硝化速率,mgN/(kg·d);V為KCl的體積, mL;m為土壤樣品的質(zhì)量, g;N2和Nl均為土壤N的含量, mg/L.

1.3 土壤溶液離子測(cè)定

土壤溶液的提取按照以下方法進(jìn)行[14]:稱取不同Zn處理土壤20g于墊有玻璃棉的過(guò)濾針筒中,添加 100%的土壤田間最大持水量后,將裝有不同處理土壤的針筒,放入底部有PVC圓圈的50mL離心管中,平衡24h后,于4500r/min離心15min,將濾液通過(guò)0.22μm的濾膜后,放置冰箱中待測(cè).

土壤溶液中離子測(cè)定方法[15]:使用850離子色譜儀,用英藍(lán)超濾前處理技術(shù),用 Metrosep A Supp 5-250色譜柱,淋洗液采用 Na2CO33.2mmol/L+1.0mmol/L NaHCO3,定量環(huán) 20μL,流速 0.7mL/min,采用 919自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣進(jìn)行溶液陰離子測(cè)定.本實(shí)驗(yàn)土壤溶液的離子測(cè)定是按照標(biāo)準(zhǔn)方法配制一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,然后在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定,以不同吸收峰面積對(duì)離子濃度做回歸后,得到F-, Cl-,B-,,,等6種陰離子和Li+,Na+,K+,Ca2+,Mg2+5種陽(yáng)離子的線性范圍和相關(guān)系數(shù).由于篇幅限制,本文只討論了溶液中陰離子(F-, Cl-,B-,,,)的含量及其對(duì)Zn形態(tài)的影響,溶液陽(yáng)離子(Li+,Na+,K+,Ca2+,Mg2+)的測(cè)定與影響結(jié)果沒(méi)有列出.

1.4 溶液中自由Zn2+含量測(cè)定

目前,測(cè)定溶液中自由離子方法較多,而穩(wěn)態(tài)數(shù)學(xué)模型仍然是測(cè)定離子形態(tài)分布最常用的手段.在進(jìn)行溶液中金屬離子濃度測(cè)定時(shí),WHAM(Windermere Humic Aqueous Model)是計(jì)算金屬離子與可溶性有機(jī)碳(DOC)絡(luò)合的最常用模型軟件.本實(shí)驗(yàn)中,土壤溶液自由Zn2+含量測(cè)定采用WHAM 6.0模型進(jìn)行計(jì)算.在利用WHAM模型進(jìn)行自由 Zn2+濃度[p(Zn2+)]計(jì)算中,由于實(shí)驗(yàn)屬于開放系統(tǒng),溶液 CO2濃度采用 3.5×10-4標(biāo)準(zhǔn)大氣壓進(jìn)行計(jì)算.在溶液中自由Zn2+含量測(cè)定時(shí),輸入溶液pH值、OC及其他離子濃度包括Na+,K+,Ca2+,Mg2+,F-,Cl-,B-,,等進(jìn)行模型計(jì)算.

1.5 數(shù)據(jù)的處理

土壤 Zn對(duì)微生物毒性的劑量-效應(yīng)曲線采用邏輯斯蒂克分布模型(Log-logistic distribution)進(jìn)行擬合[16],logistic回歸模型是目前應(yīng)用最廣泛的分類模型之一,主要用來(lái)預(yù)測(cè)離散因變量與一組解釋變量之間的關(guān)系,見(jiàn)式(2)

式中:y為各不同 Zn處理土壤的 SIN與對(duì)照的SIN 的比值,即相對(duì)基礎(chǔ)誘導(dǎo)硝化速率(%),y0、b為擬合的參數(shù),x為土壤中Zn濃度值, mg/kg;M為ECx的自然對(duì)數(shù)值.方程通過(guò)Sigmaplot10.0軟件來(lái)進(jìn)行擬合,所擬合的曲線來(lái)預(yù)測(cè)基礎(chǔ)誘導(dǎo)硝化速率的EC50和EC10值.EC50和EC10分別為硝化速率降低至未污染土壤的一半和 10%時(shí)土壤中鋅的濃度.

當(dāng)土壤中低濃度Zn對(duì)微生物毒性產(chǎn)生低劑量刺激效應(yīng)時(shí),采用Schabenberger等[17]的低劑量毒物刺激效應(yīng)(hormesis)曲線擬合,通過(guò)Tablecurve 2D V5.01軟件來(lái)完成,見(jiàn)式(3):

式中:Y是不同Zn處理土壤的相對(duì)潛在硝化速率, %;X是Zn的濃度, mg/kg;a、b、c、d是方程參數(shù).當(dāng)k為 10、50時(shí),參數(shù)c定義為 EC10及EC50.

論文其他它數(shù)據(jù)采用Excel 2003、SPSS16.0進(jìn)行方差分析,采用新復(fù)極差分析法P<0.05.

2 結(jié)果與討論

2.1 土壤溶液性質(zhì)及離子組成分析

本實(shí)驗(yàn)將采集的12種不同性質(zhì)土壤,按照文獻(xiàn)[14]方法提取了不同土壤溶液,并對(duì)土壤溶液進(jìn)行基本物理化學(xué)性質(zhì)的測(cè)定和離子含量分析.測(cè)定結(jié)果表明,土壤溶液的 pH值范圍為 4.21～7.85,土壤溶液的電導(dǎo)值范圍為 31～322μS/cm,土壤陽(yáng)離子交換量為 6.36～28.81cmol+/kg,有機(jī)碳含量為0.62%～2.46%(表1),上述土壤理化性質(zhì)代表了我國(guó)大部分地帶性土壤基本特征.

表2 土壤溶液理化性質(zhì)及陰離子含量(mg/L)Table 2 Basic properties and anion contents of the soil solutions (mg/L)

土壤溶液的離子組成在一定程度上影響了Zn的形態(tài)特征及其生物有效性.實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2.由表2可見(jiàn),相對(duì)于其他4種陰離子,土壤提取液中F-、Br-含量均較低,其中只在一個(gè)樣品中檢出(結(jié)果沒(méi)有列出),在檢測(cè)的 6種常見(jiàn)陰離子中,含量較高,變化從 63.9～109.8mg/L.土壤溶液中,F-,Cl-,,的來(lái)源主要有兩個(gè)方面,一個(gè)是土壤母質(zhì)發(fā)育來(lái)源,另一個(gè)是農(nóng)田土壤中肥料中所帶入的副成分或轉(zhuǎn)化物.土壤中的離子含量過(guò)高,容易導(dǎo)致土壤次生鹽漬化和鹽害,造成農(nóng)作物減產(chǎn).在不同土壤溶液的5種陽(yáng)離子中,總體而言,Ca2+含量最高,含量范圍為 10.725～15.987mg/L,而 Li+最低;不同陽(yáng)離子含量基本順序是Ca2+>Na+>Mg2+>K+>Li+.

2.2 基于SIN測(cè)試的土壤中Zn的毒性閾值

從圖1可見(jiàn),隨著土壤中Zn濃度的增大,12種不同土壤的相對(duì)基礎(chǔ)誘導(dǎo)硝化速率均呈階梯狀降低.當(dāng)土壤中 Zn濃度相對(duì)較低(<800mg/kg)時(shí),SIN降低緩慢,而隨著土壤中 Zn濃度的增加,SIN急劇下降,Zn濃度較高時(shí),SIN降低又趨緩慢,這一結(jié)果表明,土壤中硝化細(xì)菌對(duì)中等 Zn濃度毒性比較敏感,而隨著Zn濃度的增加,Zn對(duì)土壤中硝化細(xì)菌的毒害進(jìn)一步加劇. Zn是生物體微量元素之一,但吸收過(guò)量的 Zn則會(huì)產(chǎn)生毒害作用.土壤微生物富集過(guò)量 Zn后,Zn2+與微生物體內(nèi)帶負(fù)電荷的核酸結(jié)合引起染色體畸變,降低DNA和RNA活性,干擾核酸代謝;影響蛋白質(zhì)活性而產(chǎn)生生理毒性[15].在測(cè)試的 12種土壤中,有83.3%的土壤 Zn添加濃度達(dá)到 EC90.在不同 Zn處理中,基于SIN測(cè)定的不同土壤Zn毒性閾值間有顯著差異,EC50值變化從 195.9mg/kg至1310.2mg/kg;EC10值從 47.7mg/kg增加至681.8mg/kg,不同土壤EC50與EC10的最大值與最小值的比例分別達(dá)到了6.68及14.3倍,這一結(jié)果表明土壤性質(zhì)對(duì)土壤中Zn的微生物毒性有非常顯著的影響.

圖1 不同土壤中Zn對(duì)基礎(chǔ)誘導(dǎo)硝化速率毒性的劑量-效應(yīng)曲線Fig.1 Dose-response curves for Zn toxicity as determined by SIN in the soils

在土壤溶液中,相對(duì)于其他 Zn的結(jié)合形態(tài),自由 Zn2+更易被微生物吸收而產(chǎn)生生物毒性.基于SIN測(cè)試的12種不同土壤中Zn毒性的EC50及 EC10與溶液中自由離子 Zn(p(Zn2+)為土壤溶液中 Zn2+濃度(μmol/L)的負(fù)對(duì)數(shù))的關(guān)系見(jiàn)圖 2.圖3可見(jiàn),總體而言,隨著土壤溶液中p(Zn2+)濃度的升高(x軸由右向左),基于 SIN的毒性閾值ECx(x=10,50)值也逐漸降低,意味著土壤中Zn的毒性增加,ECx與p(Zn2+)間呈現(xiàn)出負(fù)相關(guān)關(guān)系.有資料表明,土壤 Zn脅迫對(duì)基礎(chǔ)硝化速率的抑制主要與硝化限速步驟氨氧化過(guò)程中的氨單加氧酶(AMO)的活性受到抑制有關(guān)[13,18-20].土壤Zn脅迫抑制基礎(chǔ)誘導(dǎo)硝化作用的主要機(jī)制可能包括[21-23]:1)Zn與硝化細(xì)菌酶分子的活性部位相結(jié)合后形成較穩(wěn)定的絡(luò)合物,產(chǎn)生了與底物的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用;2)Zn通過(guò)抑制土壤微生物的生長(zhǎng)和繁殖,減少體內(nèi)酶的合成和分泌,導(dǎo)致土壤酶活性下降;3)Zn2+與微生物體蛋白質(zhì)-SH基團(tuán)結(jié)合形成 Zn-螯合物,使某些酶轉(zhuǎn)錄激活而使信號(hào)傳遞系統(tǒng)中毒.

圖2 基于SIN測(cè)試的ECx與溶液自由Zn2+間的關(guān)系Fig.2 Relationship curves between the ECx(x=10,50) and the p(Zn2+) in soil solutions

2.3 土壤性質(zhì)對(duì) Zn的 p(Zn2+)形態(tài)變化、毒性閾值的影響及其預(yù)測(cè)模型

通過(guò)對(duì) Zn的微生物毒性測(cè)定結(jié)果表明,土壤性質(zhì)及溶液離子組成對(duì)ECx有顯著影響,為此,實(shí)驗(yàn)采用SPSS16.0軟件對(duì)影響土壤中Zn生物毒性的主控因子做了偏相關(guān)分析(表3).通過(guò)計(jì)算表明,土壤pH值、CEC及OC含量與土壤中Zn的毒性閾值ECx及溶液中 p(Zn2+)呈現(xiàn)出正相關(guān)關(guān)系,在5種不同陰離子中,F-和Cl-含量也呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系,而 Br-,,,與 ECx及p(Zn2+)呈現(xiàn)出負(fù)相關(guān)關(guān)系.從表3可以看出,影響土壤中Zn的毒性閾值ECx及溶液p(Zn2+)的不同變量中,最重要的因子為土壤 pH,偏相關(guān)系數(shù)均達(dá)到P<0.01顯著水平,尤其在p(Zn2+)～pH關(guān)系中最突出,其次依次為OC～CEC>F->Ca2+>Mg2+.

研究表明,土壤 pH值對(duì)進(jìn)入到土壤膠體中Zn的結(jié)合形態(tài)及其變化有很大影響[4,21].通常情況下,土壤中生物有效態(tài) Zn主要與溶液中可交換 Zn的含量直接相關(guān).通常在土壤溶液中可交換態(tài) Zn包括:自由 Zn2+, ZnOH+, Zn(OH)2·,,, Zn(NO3)+,,Zn(H2PO4)+, Zn(HPO4)等.Robert 等[23]利用WHAM模型對(duì)不同土壤中Zn形態(tài)分布計(jì)算結(jié)果表明,當(dāng)土壤pH<7.1時(shí),可溶性Zn主要以自由Zn2+為主,在無(wú)機(jī)可交換態(tài)鋅中不到2%,當(dāng)溶液 pH值 7.1～9.1時(shí),可溶性鋅離子則以ZnOH+為主,而當(dāng)土壤溶液 pH>9.1時(shí),土壤溶液中的可溶性鋅離子又被所代替.本研究結(jié)果表明,溶液中自由 Zn2+濃度與 pH呈顯著負(fù)相關(guān),方程為p(Zn2+) = 0.5659pH + 0.7211,R2=0.8266 (n=24),尤其在pH>7.5的6種土壤中更為明顯.

土壤溶液中可交換態(tài)Zn濃度還與溶液中有機(jī)、無(wú)機(jī)配位體濃度相關(guān),與其競(jìng)爭(zhēng)陽(yáng)離子(Ca2+,Mg2+等)成負(fù)相關(guān)[4,24-25].本研究中,ECx與土壤溶液中B-,,無(wú)機(jī)配位離子濃度呈負(fù)相關(guān),與 F-和 Cl-含量呈正相關(guān)(除 EC10中,顯著負(fù)相關(guān)外,其它都不顯著,見(jiàn)表 3),這說(shuō)明溶液不同陰離子配位體對(duì)Zn的生物有效性影響作用不盡相同,其中F-和Cl-可以降低土壤膠體中Zn的可移動(dòng)性,而B-,增加了土壤中Zn的可交換性.而對(duì)于同族絡(luò)合陰離子F-,Cl-和 B-而言,其對(duì) Zn有效性差異結(jié)果可能與上述離子與Zn絡(luò)合穩(wěn)定性有關(guān)[4-5],上述離子在25℃離子強(qiáng)度I=0時(shí)與 Zn絡(luò)合穩(wěn)定常數(shù)分別為logKZn-F(0.78)>logKZn-Cl(0.61)>logKZn-Br(0.43),而絡(luò)合穩(wěn)定常數(shù)的差異性可能是不同絡(luò)合陰離子對(duì)Zn生物有效性差異的機(jī)制所在[26-28].

表3 基于不同毒性終點(diǎn)的Zn濃度值與土壤性質(zhì)及陰離子間Pearson相關(guān)性分析Table 3 Pearson correlation between Zn toxicity thresholds and soil properties, soil solution anions

通過(guò)多元逐步回歸數(shù)據(jù)分析,得出了基于不同主控因子(pH、OC、CEC、F-)的土壤中Zn微生物毒性(ECx)及溶液 p(Zn2+)的預(yù)測(cè)模型(表 4).對(duì)于上述4個(gè)不同影響因子而言,土壤pH值是影響土壤Zn對(duì)潛在硝化速率抑制作用的最主要因子,其次為 OC、CEC含量.由表 4可見(jiàn),土壤 pH值和OC兩因子對(duì)EC50回歸模型變異的決定系數(shù)(R2)達(dá)到0.597和0.615,對(duì) p(Zn2+)的預(yù)測(cè)模型的決定系數(shù)達(dá) 0.755;當(dāng)引入第三個(gè)土壤因子(CEC)及溶液 F-變量后,ECx和 p(Zn2+)的預(yù)測(cè)模型的決定系數(shù)進(jìn)一步提高,4個(gè)變量因子分別解釋了預(yù)測(cè)模型變異的89.9%、81.2%和92.3%.

表4 基于不同主控因子和土壤Zn毒性閾值及自由Zn離子的預(yù)測(cè)模型Table 4 Predicted models for Zn toxicity thresholds (EC10, EC50) and the free Zn2+ in solution based on the main influence factors

3 結(jié)論

3.1 基于SIN測(cè)定的不同土壤中Zn的毒性閾值結(jié)果表明,不同測(cè)試土壤 Zn的毒性閾值間有顯著差異,EC50值變化從 195.9mg/kg至1310.2mg/kg;EC10值從 47.7mg/kg增加至681.8mg/kg,不同土壤EC50與EC10的最大值與最小值的比例分別達(dá)到了6.68及14.3倍,表明土壤性質(zhì)對(duì)土壤中Zn的微生物毒性影響顯著.

3.2 相關(guān)關(guān)系分析表明,土壤pH值、OC、CEC、F-及Cl-與Zn的毒性閾值ECx(x=10,50)及p(Zn2+)呈正相關(guān)關(guān)系,其中土壤pH為最重要的影響因子,偏相關(guān)系數(shù)均達(dá)到極顯著水平(P<0.01),其次為OC、CEC及F-,ECx與溶液中Br-,呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,溶液F-, Cl-和B-對(duì)Zn有效性差異結(jié)果可能與上述離子與Zn絡(luò)合穩(wěn)定常數(shù)差異有關(guān).

3.3 建立了基于不同主控因子(pH、OC、CEC、F-)的土壤中Zn微生物毒性(ECx)及溶液p(Zn2+)的預(yù)測(cè)模型.在上述影響因子中,土壤pH值和OC兩因子對(duì) EC50、EC10回歸模型變異的決定系數(shù)(R2)分別為0.615和0.597,對(duì) p(Zn2+)的預(yù)測(cè)模型的決定系數(shù)達(dá)0.755;當(dāng)引入CEC及溶液F-變量因子后,pH值、OC、CEC、F-分別解釋了預(yù)測(cè)模型變異的89.9%、81.2%和92.3%,達(dá)到了很好的預(yù)測(cè)效果.

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