趙 凌， 張亞?wèn)|， 趙春芳， 周麗慧， 姚 姝， 于 新， 丁 丹， Tsutomu Matsui，王才林

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所/江蘇省優(yōu)質(zhì)水稻工程技術(shù)研究中心/國(guó)家水稻改良中心南京分中心，江蘇 南京210014;2.Faculty of Applied Biological Science，Gifu University，Gifu 501-2354，Japan)

近年來(lái)，隨著全球氣候的變化，高溫?zé)岷︻l頻發(fā)生，給中國(guó)乃至全世界的水稻生產(chǎn)造成了嚴(yán)重?fù)p失，尤其在孕穗期和開(kāi)花期遇到高溫?zé)岷?huì)造成非常嚴(yán)重的危害。開(kāi)展高溫耐性研究，對(duì)于培育開(kāi)花期耐高溫的水稻品種，降低高溫危害具有非常重要的意義。高溫耐性屬于數(shù)量性狀，運(yùn)用直接鑒定法和間接鑒定法對(duì)于育種者而言實(shí)施都較為困難。直接鑒定法利用自然高溫條件在田間進(jìn)行，簡(jiǎn)單易行，但限制因子較多，難以排除其他環(huán)境因子的影響，重復(fù)性較差。間接鑒定法一般利用溫室和人工氣候箱模擬自然高溫條件進(jìn)行鑒定，在控制溫度和光照的情況下進(jìn)行高溫耐性鑒定，準(zhǔn)確性較高，但需要昂貴的儀器，一次鑒定規(guī)模有限。不管是直接鑒定還是間接鑒定，對(duì)高溫鑒定指標(biāo)的選擇都非常重要。研究者提出了不少用于鑒定水稻開(kāi)花期耐高溫的指標(biāo)，最常用的為高溫條件下的結(jié)實(shí)率［1］。由于高溫條件下的結(jié)實(shí)率鑒定比較困難，研究者也提出了其他一些耐熱性指標(biāo)，如結(jié)實(shí)率的脅迫指數(shù);秕粒率、實(shí)粒質(zhì)量、整精米率、堊白度、蛋白質(zhì)含量的脅迫指數(shù)［2］;高溫條件下葉綠素、游離脯氨酸、脫落酸含量及花粉活力［3］等。運(yùn)用不同的耐熱性指標(biāo)鑒定到很多水稻耐熱QTL位點(diǎn)［4-11］，但這些鑒定指標(biāo)在育種中直接應(yīng)用還具有一定難度。找到與開(kāi)花期高溫耐性密切相關(guān)且容易在常溫下鑒定的指標(biāo)對(duì)于水稻耐高溫育種迫在眉睫。

Matsui等進(jìn)行了水稻花藥基部開(kāi)裂長(zhǎng)度(Length dehiscence at the basal part of thecae，LDBT)和高溫耐性的相關(guān)研究，明確開(kāi)花期高溫耐性與花藥基部開(kāi)裂程度有關(guān)［12-13］，花藥基部開(kāi)裂性狀見(jiàn)圖1，長(zhǎng)的花藥基部開(kāi)裂是高溫條件下保證結(jié)實(shí)率的有利性狀，不僅年度間穩(wěn)定，且在高溫和常溫條件下的表達(dá)具有平行性，提出可以在常溫下利用水稻花藥基部開(kāi)裂長(zhǎng)度進(jìn)行開(kāi)花期高溫耐性鑒定［14-17］。Zhao以高溫結(jié)實(shí)率作為水稻高溫育性指標(biāo)，也發(fā)現(xiàn)3個(gè)可能與水稻高溫育性有關(guān)的性狀(花藥基部開(kāi)裂長(zhǎng)度、開(kāi)花時(shí)間、穗部溫度)中高溫結(jié)實(shí)率與開(kāi)花時(shí)間以及穗部溫度間并沒(méi)有相關(guān)性，而與花藥開(kāi)裂長(zhǎng)度呈顯著正相關(guān)［18］。Jagadish的研究結(jié)果也證實(shí)水稻開(kāi)花期高溫耐性與花藥基部開(kāi)裂程度有關(guān)［6］。

本研究利用親本花藥基部開(kāi)裂長(zhǎng)度存在顯著差異的重組自交系群體(RIL)為作圖群體，進(jìn)行花藥基部開(kāi)裂長(zhǎng)度的QTL定位和分析，進(jìn)一步研究水稻花藥基部開(kāi)裂性狀和其他農(nóng)藝性狀的相關(guān)性，為開(kāi)花期耐熱性研究提供理論依據(jù)。

圖1 花藥頂部和基部開(kāi)裂［12］Fig.1 A dehisced anther

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

以1個(gè)來(lái)源于天鵝谷///9520//(72-496/蘇御糯)的粳稻品系TD70和秈稻品種Kasalath為親本配制組合。2005年夏從F1單株收獲自交種子，以單粒傳方法構(gòu)建成由240個(gè)株系組成的重組自交系(RIL)群體。于2012年在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所試驗(yàn)田種植240個(gè)F2:7RIL群體及其親本。所有材料秧齡30 d，每個(gè)株系種植1個(gè)小區(qū)，每小區(qū)4行，每行10株，行株距為26.7 cm×16.7 cm，單本栽插。隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，2次重復(fù)。田間管理按常規(guī)栽培管理方法。成熟后，每小區(qū)在中間行隨機(jī)選擇5個(gè)單株，按單株分別收獲。

1.2 溫度測(cè)定

用溫濕監(jiān)測(cè)儀(型號(hào):HOBO U23-001)記錄水稻冠層的最高溫度，從0∶00開(kāi)始，每1 h記錄1次，每1 d 24 h監(jiān)測(cè)。

1.3 性狀測(cè)定

花藥基部開(kāi)裂長(zhǎng)度:測(cè)量240個(gè)株系及其親本的平均花藥基部開(kāi)裂長(zhǎng)度。每份材料隨機(jī)調(diào)查5個(gè)代表性植株，各性狀的均值作為性狀表型值進(jìn)行分析。使用數(shù)字顯微鏡(VHX-500，Keyence Corportion，Osaka)直接測(cè)量花藥基部開(kāi)裂長(zhǎng)度，每個(gè)小花隨機(jī)測(cè)量5個(gè)花藥。取5個(gè)花藥的平均值作為小花的LDBT值，取5個(gè)小花的平均值作為單株的LDBT值。成熟后每小區(qū)在中間行隨機(jī)選擇5個(gè)單株，按單株分別收獲。

抽穗期:整個(gè)小區(qū)50%單株抽穗的一天為抽穗當(dāng)天，計(jì)算相關(guān)系數(shù)時(shí)將抽穗期表示為從播種到抽穗當(dāng)天的天數(shù)。抽穗期間指抽穗當(dāng)天及其前后各3 d。

農(nóng)藝性狀測(cè)定:性狀包括240個(gè)株系及其親本的株高、分蘗數(shù)、劍葉長(zhǎng)、劍葉寬、結(jié)實(shí)率、總粒數(shù)、千粒質(zhì)量、粒寬、粒厚、芒長(zhǎng)等，取5個(gè)單株的平均值作為性狀表型值進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

TD70與Kasalath的重組自交系群體的分子連鎖圖譜包含141個(gè)分子標(biāo)記［19］，利用QTL IciMapping Version3.4軟件［20］，采用完備區(qū)間作圖法(Inclusive composite interval mapping，ICIM)在全基因組范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，檢測(cè)控制花藥基部開(kāi)裂長(zhǎng)度的QTL。以LOD值2.5作為閾值，判斷QTL的存在，QTL的命名參照McCouch等［21］的原則。

使用SPSS17.0軟件進(jìn)行方差分析和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 RIL群體及其親本的花藥基部開(kāi)裂長(zhǎng)度的表型變異

2012年RIL群體及其親本的花藥基部開(kāi)裂長(zhǎng)度的表型變異見(jiàn)表1。親本TD70花藥基部開(kāi)裂長(zhǎng)度平均值為590.1 μm，而Kasalath的花藥基部開(kāi)裂長(zhǎng)度平均值為342.4 μm。兩親本在花藥基部開(kāi)裂長(zhǎng)度上存在極顯著差異。從RIL群體的變異范圍來(lái)看，重復(fù)1變幅為 247.6～864.4 μm，均值為446.4 μm，變異系數(shù) 81.43%;重復(fù) 2變幅為 254.9～781.9 μm，均值 448.2 μm，變異系數(shù) 79.49%(表1)。群體2個(gè)重復(fù)間差異不顯著。

群體中花藥基部開(kāi)裂長(zhǎng)度存在明顯的超親現(xiàn)象。從TD70/Kasalath RIL群體的頻率分布看，花藥基部開(kāi)裂長(zhǎng)度呈連續(xù)性并為正態(tài)分布，表現(xiàn)出數(shù)量性狀的遺傳特點(diǎn)(圖2)。

表1 親本與重組自交系群體花藥基部開(kāi)裂長(zhǎng)度的表型變異Table 1 Phenotypic variation of LDBT of rice RⅠL population and two parents

圖2 RⅠL群體的花藥基部開(kāi)裂長(zhǎng)度性狀的分布Fig.2 Distribution of rice LDBT among rice RⅠL population

2.2 花藥基部開(kāi)裂長(zhǎng)度的QTL檢測(cè)

對(duì)RIL群體進(jìn)行花藥基部開(kāi)裂長(zhǎng)度的QTL檢測(cè)，共檢測(cè)到2個(gè)QTL位點(diǎn)，分別分布在第6和第8染色體上(圖3)。qLDBT6位于第6染色體RM3和RM3628之間15.8cM的區(qū)間內(nèi)，LOD值3.23，貢獻(xiàn)率為6.18%，加性效應(yīng)為17.74%;qLDBT8位于第8染色體RM1376和RM4085之間11.1 cM的區(qū)間內(nèi)，LOD值2.95，貢獻(xiàn)率8.00%，加性效應(yīng)20.09%。2個(gè)QTL位點(diǎn)的增效等位基因都來(lái)源于母本TD70(表2)。

2.3 RIL群體孕穗后期和開(kāi)花期間的溫度

親本TD70和Kasalath的抽穗期分別為8月11日和8月9日。RIL群體的抽穗期分布從7月25日到9月9日。2012年7月22日至9月12日的日最高溫度和日平均溫度的變化如圖4。其中日平均溫度和日最高溫度最高值均出現(xiàn)在7月30日，分別為32.34℃和37.18℃;9月9日的日平均溫度和日最高溫度均最低，分別為20.39℃和21.08℃。2012年7月19日至9月12日間只有14 d日平均溫度超過(guò)30℃，其中3 d日平均溫度超過(guò)32℃，只有1 d日最高溫度超過(guò)37℃。

圖3 檢測(cè)到的花藥基部開(kāi)裂長(zhǎng)度QTL在染色體上的位置Fig.3 The QTL loci for LDBT on rice chromosome

表2 在RⅠL群體中檢測(cè)到的花藥基部開(kāi)裂長(zhǎng)度的QTLTable 2 Ⅰdentification of QTLs for LDBT in rice RⅠL population

圖4 RⅠL群體抽穗期間的溫度Fig.4 Temperatures during heading in rice RⅠLs

2.4 花藥基部開(kāi)裂長(zhǎng)度和其他農(nóng)藝性狀的相關(guān)性

從表3可以看出，RIL群體的花藥基部開(kāi)裂長(zhǎng)度與劍葉寬、千粒質(zhì)量、粒長(zhǎng)、粒寬、粒厚間存在極顯著正相關(guān)，與抽穗期、株高、分蘗數(shù)、劍葉長(zhǎng)、總粒數(shù)、結(jié)實(shí)率、抽穗期當(dāng)天最高溫度、抽穗期平均溫度和抽穗期間最高溫度以及芒長(zhǎng)之間不相關(guān)。

3 討論

高溫脅迫已成為影響水稻生產(chǎn)的主要因素之一，開(kāi)展水稻耐高溫的相關(guān)研究具有重要意義。前人研究結(jié)果表明水稻花藥基部開(kāi)裂長(zhǎng)度與開(kāi)花期高溫耐性有關(guān)，并設(shè)想將水稻花藥基部開(kāi)裂長(zhǎng)度作為常溫下進(jìn)行開(kāi)花期高溫耐性鑒定的指標(biāo)。進(jìn)行水稻花藥基部開(kāi)裂長(zhǎng)度的相關(guān)研究，可以為此設(shè)想提供更多的理論依據(jù)。

表3 花藥基部開(kāi)裂長(zhǎng)度和其他農(nóng)藝性狀間的相關(guān)性分析Table 3 The correlation analyses between LDBT and agronomic traits

本研究中定位到的控制水稻花藥基部開(kāi)裂長(zhǎng)度的qLDBT8，位于第8染色體RM1376和RM4085之間11.1 cM的區(qū)間內(nèi)。據(jù)Graneme網(wǎng)站截至2014年1月的不完全統(tǒng)計(jì)，目前所有發(fā)掘出的水稻QTL中涉及此區(qū)間的僅有4個(gè)位點(diǎn)(圖5)。其中He等利用Peiai 64S/8902S的F2群體的240個(gè)株系檢測(cè)到1個(gè)控制不育的位點(diǎn)S8也位于此區(qū)域［22］。S8位于第8染色體RM885和RG333之間0.57 Mb的區(qū)間內(nèi)，在自然長(zhǎng)日照處理、自然短日照處理、人工氣候室長(zhǎng)日照高溫處理、人工氣候室長(zhǎng)日照低溫處理和人工氣候室短日照高溫處理?xiàng)l件下都可以檢測(cè)到，是一個(gè)穩(wěn)定的控制育性QTL［23］。由于前人研究結(jié)果表明花藥基部開(kāi)裂長(zhǎng)度也是同高溫育性相關(guān)的性狀，推測(cè)我們定位到的qLDBT8區(qū)域與小穗不育有重要關(guān)系，值得進(jìn)一步研究。

控制水稻抽穗期的主效位點(diǎn)Ghd8也位于第8染色體 qLDBT8所在的區(qū)域內(nèi)，物理距離4 331 109～4 333 832 bp，編碼轉(zhuǎn)錄因子CCAAT盒結(jié)合蛋白的HAP3H亞基［24］。Ghd8不僅調(diào)節(jié)抽穗期，還同時(shí)具有調(diào)控水稻產(chǎn)量和株高的功能，和Hd5等位［25-26］。此外，qLDBT8所在的區(qū)域內(nèi)還具有一個(gè)水稻生物產(chǎn)量QTL(qpw)和一個(gè)水稻稻瘟病抗性QTL(rbr8)［27-28］，這 2 個(gè) QTL 在同一個(gè)位置，都位于RG333～RM25間2.7 Mb的區(qū)間內(nèi)。

圖5 qLDBT8區(qū)間內(nèi)定位到的QTLFig.5 QTLs identified in the interval of RM1376 and RM4085 on chromosome 8

前期研究結(jié)果表明，水稻花藥基部開(kāi)裂長(zhǎng)度是和高溫下結(jié)實(shí)率相關(guān)的性狀。國(guó)內(nèi)外對(duì)水稻花藥基部開(kāi)裂長(zhǎng)度的研究主要集中在和高溫耐性的相關(guān)性研究。本研究首次對(duì)水稻花藥基部開(kāi)裂性狀和農(nóng)藝性狀的相關(guān)性進(jìn)行了分析。TD70是一個(gè)特大粒型的粳稻資源，其千粒質(zhì)量達(dá)70 g，不僅粒長(zhǎng)和粒寬比較大，其花藥基部開(kāi)裂長(zhǎng)度也非常大，是一個(gè)進(jìn)行花藥基部開(kāi)裂長(zhǎng)度研究的非常好的材料。本研究檢測(cè)發(fā)現(xiàn)RIL群體中花藥基部開(kāi)裂長(zhǎng)度和結(jié)實(shí)率并不相關(guān)，這可能和2012年夏天抽穗期間的溫度有關(guān)。石春林等以華粳1號(hào)和特優(yōu)559為材料，發(fā)現(xiàn)減數(shù)分裂期33℃以下的溫度對(duì)供試材料結(jié)實(shí)率無(wú)明顯影響［29］。時(shí)寬玉等分析中稻花期高溫的變化及其對(duì)產(chǎn)量的影響，結(jié)果表明當(dāng)極端高溫處于35～39℃時(shí)中稻的平均產(chǎn)量與35℃以下時(shí)中稻的平均產(chǎn)量無(wú)顯著差異;當(dāng)極端高溫達(dá)39℃以上時(shí)，平均產(chǎn)量會(huì)顯著降低13%［30］。王才林等則發(fā)現(xiàn)開(kāi)花期日平均氣溫32℃以上，高溫就會(huì)對(duì)水稻開(kāi)花授粉造成影響［31］。2012年夏天7月25日到9月9日期間，日平均溫度超過(guò)32℃只有3 d，只有1 d(7月30日)日最高溫度超過(guò)37℃。而本研究240個(gè)RIL家系中，有16個(gè)家系的抽穗期在8月5號(hào)之前，8月6號(hào)后并沒(méi)有出現(xiàn)日最高溫度37℃以上的高溫天氣。開(kāi)花期溫度不夠高可能是本研究RIL群體花藥基部開(kāi)裂長(zhǎng)度和結(jié)實(shí)率不相關(guān)的原因。

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