韓芙蓉，王令,2，徐坤，張智英，王昕. 西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，楊凌 7200；2. 陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，漢中 723000

基于SSA修復(fù)機(jī)制和特異性核酸酶活性檢測(cè)的雙熒光報(bào)告載體系統(tǒng)的開發(fā)及應(yīng)用

韓芙蓉1，王令1,2，徐坤1，張智英1，王昕1
1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，楊凌 712100；2. 陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，漢中 723000

報(bào)告載體系統(tǒng)因構(gòu)建快捷、改造簡(jiǎn)單、操作容易、經(jīng)濟(jì)有效，并且能通過(guò)介導(dǎo)篩選核酸酶陽(yáng)性細(xì)胞富集基因組修飾的陽(yáng)性細(xì)胞克隆，而成為特異性核酸酶活性檢測(cè)的重要手段?；诜峭茨┒诉B接(Non-homologous end joining，NHEJ)修復(fù)機(jī)制的報(bào)告系統(tǒng)在引入DNA雙鏈斷裂(Double strand breaks，DSBs)后，經(jīng)過(guò)優(yōu)化最高也只有2/3的概率實(shí)現(xiàn)報(bào)告基因的修復(fù)；而單鏈退火(Single strand annealing，SSA)修復(fù)機(jī)制在引入DSBs后，理論上可以實(shí)現(xiàn)報(bào)告基因 100%的修復(fù)，具有更高的靈敏度，有利于活性較低的特異性核酸酶活性的檢測(cè)，為基因組修飾研究中特異性核酸酶活性的檢測(cè)提供了有效的手段。本研究設(shè)計(jì)并構(gòu)建了 3套基于SSA修復(fù)機(jī)制的雙熒光報(bào)告載體系統(tǒng)，并應(yīng)用mRFP-eGFP系統(tǒng)檢測(cè)了3對(duì)ZFNs的有效活性，其活性檢測(cè)結(jié)果分別為8.9%、9.3%和5.0%，該研究為核酸酶活性的檢測(cè)提供了有效的手段。

SSA；雙熒光報(bào)告載體系統(tǒng)；特異性核酸酶

基因組編輯的傳統(tǒng)方法有自發(fā)同源重組和逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)法，但應(yīng)用效果不佳。DNA雙鏈斷裂(Double strand breaks，DSBs)切口修復(fù)機(jī)制的發(fā)現(xiàn)使其發(fā)生了巨大變革[1]。DSBs能激活細(xì)胞內(nèi)的多種DNA斷裂修復(fù)機(jī)制，其中主要有同源重組(Homologous recombination, HR)、非同源末端連接(Non-homologous end joining，NHEJ)和單鏈退火(Single strand annealing，SSA)三種方式。Bibikova等[2]發(fā)現(xiàn)在基因組特殊位點(diǎn)產(chǎn)生DSBs，能提高基因組編輯的靶向性和精確性，同時(shí)能將哺乳動(dòng)物細(xì)胞中 HR介導(dǎo)的基因組編輯效率提高到5×104。研究表明，在基因組中利用大范圍核酸酶 (Meganuclease) I-Sce I產(chǎn)生DSBs能夠顯著提高哺乳動(dòng)物基因組的靶向修飾效率[3～5]。但由于大范圍核酸酶改造困難，因此相對(duì)較容易改造的鋅指核酸酶(Zinc finger nucleases，ZFNs)[6,7]、類轉(zhuǎn)錄因子效應(yīng)物核酸酶(Transcription activator-like (TAL) effector nucleases, TALENs)[8,9]和成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)技術(shù) CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 (CRISPR- associated proteins )[10～12]作為有效的基因打靶工具相繼應(yīng)運(yùn)而生。這些位點(diǎn)特異性的核酸內(nèi)切酶能夠根據(jù)DNA靶序列進(jìn)行改造，改造后的核酸內(nèi)切酶能夠特異識(shí)別和切割目標(biāo) DNA靶序列[13]，產(chǎn)生DSBs。在沒有供體DNA和同源序列存在的情況下，細(xì)胞基因組DNA上的DSBs一般通過(guò)NHEJ機(jī)制進(jìn)行修復(fù)，修復(fù)之后會(huì)產(chǎn)生少數(shù)堿基的插入或缺失(Insertions and deletions, Indels)。通過(guò)檢測(cè)相應(yīng)靶序列上 Indels來(lái)衡量特異性核酸酶的工作效率。Indels的檢測(cè)方法主要有錯(cuò)配DNA內(nèi)切酶法(T7E-I 或 CEL-I)、T-A克隆測(cè)序法和高通量測(cè)序法，但這些方法不夠直觀，工作量大或費(fèi)用較高。因此，針對(duì)特異性核酸酶活性檢測(cè)的報(bào)告系統(tǒng)逐漸興起。

所有的報(bào)告系統(tǒng)都是基于特殊的報(bào)告基因，如抗生素抗性基因、編碼熒光蛋白和熒光素酶的基因等。將特異性核酸酶的靶序列插入報(bào)告基因的開放閱讀框內(nèi)(Open reading frame，ORF)，使其無(wú)法正確表達(dá)相應(yīng)的功能蛋白，在特異性核酸酶的作用下，報(bào)告基因中插入的靶序列被靶向切割形成DSBs, 進(jìn)而根據(jù)研究人員的設(shè)計(jì)激活細(xì)胞內(nèi)源的NHEJ、SSA 或HR等修復(fù)機(jī)制，實(shí)現(xiàn)對(duì)報(bào)告基因ORF的修復(fù)。報(bào)告系統(tǒng)具有易觀察、易檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。

在哺乳動(dòng)物細(xì)胞水平，用于特異性核酸酶活性檢測(cè)的報(bào)告系統(tǒng)主要包括報(bào)告細(xì)胞系和報(bào)告載體。細(xì)胞中報(bào)告基因的存在方式有兩種：一種是直接在細(xì)胞基因組中整合報(bào)告基因構(gòu)件，獲得相應(yīng)的報(bào)告細(xì)胞系[14]；另一種是構(gòu)建含報(bào)告基因元件的報(bào)告載體，與特異性核酸酶表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染至哺乳動(dòng)物細(xì)胞實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸酶活性的檢測(cè)，此時(shí)細(xì)胞內(nèi)的報(bào)告基因游離存在[15]。雖然報(bào)告載體并未整合入細(xì)胞基因組，不是很穩(wěn)定，但是相對(duì)于報(bào)告細(xì)胞系，具有明顯的優(yōu)勢(shì)：首先構(gòu)建快捷，靶序列易于改變；其次無(wú)需進(jìn)行基因組整合，操作簡(jiǎn)易；最后能應(yīng)用于特異性核酸酶陽(yáng)性細(xì)胞的篩選，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組修飾陽(yáng)性細(xì)胞的富集甚至對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞克隆的篩選。

為了便于觀察和檢測(cè)，一般將編碼熒光蛋白的基因作為報(bào)告基因。2011年，Kim等[15]首次將紅色熒光蛋白mRFP與綠色熒光蛋白eGFP融合表達(dá)，在二者的編碼基因序列之間插入 ZFNs靶序列，構(gòu)建得到了mRFP-eGFP雙熒光報(bào)告載體。其中，mRFP作為衡量轉(zhuǎn)染效率的標(biāo)記基因正確表達(dá)，而 eGFP作為報(bào)告基因其閱讀框發(fā)生移碼突變，不能正常表達(dá)。當(dāng)ZFNs切割靶序列并引入DSBs后，會(huì)激活細(xì)胞內(nèi)NHEJ修復(fù)機(jī)制，使eGFP的閱讀框發(fā)生重排，以 1/3的概率表達(dá)出有功能的綠色熒光蛋白。通過(guò)eGFP陽(yáng)性細(xì)胞的比例衡量ZFNs的工作效率，并進(jìn)一步利用流式細(xì)胞儀分選得到mRFP和eGFP雙陽(yáng)性細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組修飾陽(yáng)性細(xì)胞的富集[15]。由于該mRFP-eGFP雙熒光報(bào)告載體采用了NHEJ的修復(fù)機(jī)制，因此最高只有 1/3的概率實(shí)現(xiàn)報(bào)告基因的修復(fù)，效率有限；尤其是針對(duì)活性較低的特異性核酸酶時(shí)并不理想。2013年，Kim教授研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步對(duì)該mRFP-eGFP雙熒光報(bào)告載體進(jìn)行了優(yōu)化，引入了兩個(gè)eGFP報(bào)告基因閱讀框，使其在DSBs引入后的理論修復(fù)概率提高到2/3[16]。

本研究團(tuán)隊(duì)于2012年首次提出了基于SSA修復(fù)機(jī)制的特異性核酸酶活性檢測(cè)報(bào)告載體系統(tǒng)，并進(jìn)行了一系列的嘗試和應(yīng)用研究[17～19]，為以后特異性核酸酶的應(yīng)用、基因組修飾陽(yáng)性細(xì)胞克隆的篩選等研究奠定了基礎(chǔ)。SSA是一種重要的DNA重組方式，當(dāng)在 DSBs兩側(cè)有一定長(zhǎng)度的正向重復(fù)序列時(shí)被激活，通過(guò)同源重組實(shí)現(xiàn) DSBs修復(fù)，并刪除一個(gè)正向重復(fù)序列。理論上DSBs引入后，基于SSA修復(fù)機(jī)制的報(bào)告基因的修復(fù)效率能達(dá)到100%。本文主要介紹了3種不同的基于SSA修復(fù)機(jī)制的雙熒光報(bào)告載體系統(tǒng)的設(shè)計(jì)開發(fā)、功能驗(yàn)證和初步的應(yīng)用研究。

1 材料和方法

1.1 材料

DH5α感受態(tài)細(xì)胞，人胚腎細(xì)胞系HEK293T，質(zhì)粒pST1374-Sharky、pDsRed1-C1、pcDNA3-mRFP、peGFP-C1以及3對(duì)ZFNs酵母表達(dá)載體pLeu-ZFNLs 和pTrp-ZFNRs均由實(shí)驗(yàn)室保存或前期工作構(gòu)建。

1.2 ZFNs真核表達(dá)載體的構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶 XbaⅠ和 BamHⅠ雙酶切載體pST1374-Sharky及pLeu-ZFNL，瓊脂糖凝膠分離后純化獲得線性化骨架及300 bp大小的編碼3鋅指蛋白的片段，用T4連接酶16℃過(guò)夜連接，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，均勻涂布于抗性LB固體培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)，10 h后挑取單克隆，酶切鑒定陽(yáng)性克隆，獲得ZFNs哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體pST-ZFNL。同時(shí)，用限制性內(nèi)切酶NotⅠ和BamHⅠ雙酶切載體pST1374-Sharky及pLeu-ZFNR，以同樣的流程構(gòu)建獲得載體pST-ZFNR。采用上述方法，分別構(gòu)建了3 對(duì) ZFNs的真核表達(dá)載體 pST-ZFNL1/2/3和pST-ZFNR1/2/3。

1.3 DsRed-eGFP報(bào)告載體系統(tǒng)

1.3.1 DsRed-eGFP報(bào)告載體系統(tǒng)的設(shè)計(jì)

DsRed-eGFP報(bào)告載體中，紅色熒光蛋白和綠色熒光蛋白融合表達(dá)，由同一個(gè)啟動(dòng)子控制；其中紅色熒光蛋白基因DsRed作為標(biāo)記基因用于衡量轉(zhuǎn)染效率，綠色熒光蛋白基因 eGFP作為報(bào)告基因用于檢測(cè)特異性核酸酶的工作效率；eGFP基因閱讀框被核酸酶靶序列打斷并分成兩部分，前后各含300 bp的正向重復(fù)序列，當(dāng)核酸酶發(fā)揮作用并在靶序列上引入DSBs后，激活細(xì)胞內(nèi)的SSA修復(fù)機(jī)制，實(shí)現(xiàn)eGFP基因閱讀框的修復(fù)和綠色熒光蛋白的正常表達(dá)。1.3.2 pDsRed-eGFP-BS報(bào)告載體的構(gòu)建

從質(zhì)粒 peGFP-C1中利用不同的引物序列，分別擴(kuò)增得到片段eGFPL和eGFPR。前者經(jīng)Bgl II和SalⅠ雙酶切后插入載體 pDsRed1-C1中，獲得中間載體pDsRed-eGFPL；后者用BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切后插入上述中間載體中，得到不含靶序列的報(bào)告載體pDsRed-eGFP-MCS，其中eGFP基因閱讀框被NotⅠ和 BamHⅠ的多克隆位點(diǎn)和正向重復(fù)序列打斷。通過(guò)引物退火作用獲得兩端為NotⅠ和BamHⅠ粘性末端的ZFNs靶序列片段，克隆至載體pDsRedeGFP-MCS中，進(jìn)而得到含有相應(yīng)靶序列的報(bào)告載體pDsRed-eGFP-BS。同時(shí)構(gòu)建DsRed-eGFP正常表達(dá)的野生型陽(yáng)性對(duì)照載體pDsRed-eGFP。

1.4 eGFP-DsRed報(bào)告載體系統(tǒng)

1.4.1 eGFP-DsRed報(bào)告載體系統(tǒng)的設(shè)計(jì)

eGFP-DsRed報(bào)告載體系統(tǒng)與上述DsRed-eGFP系統(tǒng)設(shè)計(jì)的不同之處在于：(1) eGFP-DsRed系統(tǒng)改用 eGFP作為標(biāo)記基因用來(lái)衡量轉(zhuǎn)染效率，而報(bào)告基因則相反地采用了紅色熒光蛋白基因 DsRed，同樣采用SSA修復(fù)機(jī)制；(2) eGFP-DsRed系統(tǒng)在eGFP 和DsRed基因引入了核糖體結(jié)合位點(diǎn)(Internal ribosome entry site，IRES)，保證在同一個(gè)CMV啟動(dòng)子控制下eGFP和DsRed基因能以非融合的形式各自單獨(dú)表達(dá)。而DsRed-eGFP系統(tǒng)中eGFP和DsRed作為一個(gè)融合蛋白表達(dá)。

1.4.2 peGFP-DsRed-BS報(bào)告載體的構(gòu)建

從質(zhì)粒pDsRed1-C1中利用不同的引物序列，分別通過(guò) Overlap PCR和普通 PCR擴(kuò)增得到片段IRES-DsRedL和DsRedR。將兩個(gè)片段先后依次克隆到 peGFP-C1中，構(gòu)建得到不含靶序列的報(bào)告載體peGFP-DsRed-MCS，其中DsRed基因閱讀框被NotⅠ和BamHⅠ的多克隆位點(diǎn)和300 bp的正向重復(fù)序列打斷。通過(guò)引物退火作用獲得兩端為NotⅠ和BamHⅠ粘性末端的 ZFNs靶序列片段，克隆至載體peGFP-DsRed-MCS中，得到含有相應(yīng)靶序列的報(bào)告載體peGFP-DsRed-BS。同時(shí)構(gòu)建eGFP-DsRed正常表達(dá)的野生型陽(yáng)性對(duì)照載體peGFP-DsRed。

1.5 mRFP-eGFP報(bào)告載體系統(tǒng)

1.5.1 mRFP-eGFP報(bào)告載體系統(tǒng)的設(shè)計(jì)

mRFP-eGFP報(bào)告載體系統(tǒng)采用紅色熒光蛋白基因mRFP替代了上述DsRed-eGFP報(bào)告載體系統(tǒng)中的DsRed基因，作為標(biāo)記基因用于衡量轉(zhuǎn)染效率；與 DsRed-eGFP系統(tǒng)一樣，采用 SSA修復(fù)機(jī)制的eGFP報(bào)告基因在紅光基因下游融合表達(dá)，用于檢測(cè)特異性核酸酶的工作效率。

1.5.2 pmRFP-eGFP-BS報(bào)告載體的構(gòu)建

從 pcDNA3-mRFP中擴(kuò)增大小約為 680 bp的mRFP片段，用AgeⅠ和BglⅡ雙酶切純化的mRFP基因片段及骨架載體 pDsRed-eGFP-MCS/BS，然后將mRFP基因片段克隆至骨架載體中，替代掉原來(lái)的DsRed基因片段，獲得相應(yīng)的雙熒光報(bào)告載體pmRFP-eGFP-MCS/BS。以相同方式在載體pDsRed-eGFP的基礎(chǔ)上，替換掉DsRed基因片段，構(gòu)建mRFP-eGFP正常表達(dá)的野生型陽(yáng)性對(duì)照載體pmRFP-EGFP。

1.6 三種報(bào)告載體系統(tǒng)的功能驗(yàn)證

通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)室前期篩選得到的 3對(duì) ZFNs[17,20]進(jìn)行活性檢測(cè)，對(duì)以上 3種報(bào)告載體系統(tǒng)進(jìn)行功能驗(yàn)證。具體操作如下：將HEK293T細(xì)胞系復(fù)蘇后傳代至24孔板，按常規(guī)程序正常培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)到70%～80%時(shí)，更換新鮮培養(yǎng)基，2～4 h后進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染(每孔總DNA量為1.6 μg，ZFNL, ZFNR表達(dá)載體和報(bào)告載體的轉(zhuǎn)染比率為 1.2:1.2:1，選擇Sofast轉(zhuǎn)染試劑，按照廈門太陽(yáng)馬生物公司說(shuō)明書步驟操作)。將含有靶序列的雙熒光報(bào)告載體和ZFNs表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中，作為實(shí)驗(yàn)組檢測(cè)相應(yīng) ZFNs的工作效率。同時(shí)設(shè)置兩組對(duì)照，一組轉(zhuǎn)染報(bào)告載體和空的 ZFNs表達(dá)載體，另一組只轉(zhuǎn)染雙熒光均正常表達(dá)的野生型陽(yáng)性對(duì)照載體。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。轉(zhuǎn)染后24 h，更換新鮮培養(yǎng)基，48 h后觀察熒光情況并拍照，72 h后收集細(xì)胞，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)計(jì)數(shù)檢測(cè)。對(duì)3種報(bào)告載體系統(tǒng)的功能驗(yàn)證過(guò)程進(jìn)行多次重復(fù)，觀察并統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

圖1 DsRed-eGFP雙熒光報(bào)告載體系統(tǒng)

2 結(jié)果與分析

2.1 DsRed-eGFP報(bào)告載體系統(tǒng)的功能驗(yàn)證

將報(bào)告載體pDsRed-eGFP-BS和ZFNs表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞，ZFNs在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)后特異性的識(shí)別并切割靶序列，啟動(dòng)細(xì)胞SSA修復(fù)機(jī)制的原理見圖1A。轉(zhuǎn)染后48 h，通過(guò)熒光顯微鏡觀察細(xì)胞熒光情況，發(fā)現(xiàn)不同處理組紅色熒光均十分微弱，陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的綠色熒光基本不可見，而陽(yáng)性對(duì)照組綠色熒光較強(qiáng)(圖 1B)?？赡苁且?yàn)镈sRed信號(hào)本身就弱于eGFP，導(dǎo)致紅色熒光比綠色熒光微弱，甚至不可見；其次 DsRed-eGFP系統(tǒng)中DsRed和eGFP融合表達(dá)，影響了兩種蛋白的空間結(jié)構(gòu)和熒光特性，且對(duì)DsRed的影響相對(duì)嚴(yán)重。結(jié)果說(shuō)明DsRed-eGFP系統(tǒng)中以DsRed衡量轉(zhuǎn)染效率，不利于下游 eGFP工作效率的觀察與檢測(cè)，因此我們對(duì)此系統(tǒng)進(jìn)行改造與優(yōu)化，更有利于實(shí)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中對(duì)特異性核酸酶活性的有效檢測(cè)。

2.2 eGFP-DsRed報(bào)告載體系統(tǒng)的功能驗(yàn)證

根據(jù)2.1的結(jié)果推測(cè)，DsRed-eGFP系統(tǒng)中DsRed 和eGFP融合表達(dá)對(duì)DsRed的影響嚴(yán)重。因此本研究隨后又構(gòu)建了 eGFP-DsRed系統(tǒng)，同時(shí)在 DsRed 和eGFP之間引入了IRES，期望實(shí)現(xiàn)DsRed和eGFP以非融合蛋白的形式表達(dá)。

將報(bào)告載體peGFP-DsRed-BS和ZFNs表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞，ZFNs在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)后特異性的識(shí)別并切割靶序列，啟動(dòng)細(xì)胞SSA修復(fù)機(jī)制的原理見圖2A。轉(zhuǎn)染后48 h，通過(guò)熒光顯微鏡觀察細(xì)胞熒光情況，發(fā)現(xiàn)不同處理組細(xì)胞中均有較多的綠色熒光，陽(yáng)性對(duì)照組中有較少的紅色熒光細(xì)胞，而陰性對(duì)照和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中紅色熒光幾乎不可見(圖 2B)。究其原因可能有以下幾點(diǎn)：首先 IRES啟動(dòng)翻譯的活力有限，DsRed蛋白比eGFP蛋白的表達(dá)量相對(duì)較少；其次與eGFP相比，DsRed基因的表達(dá)活力或DsRed蛋白的活性較低；第三用于功能驗(yàn)證的 ZFNs的工作效率較低，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)組未能有效檢測(cè)到紅色熒光細(xì)胞。因此， eGFP-DsRed系統(tǒng)仍不能實(shí)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中對(duì)特異性核酸酶活性的有效檢測(cè)。

圖2 eGFP-DsRed雙熒光報(bào)告載體系統(tǒng)

2.3 mRFP-eGFP報(bào)告載體系統(tǒng)的功能驗(yàn)證及初步應(yīng)用

基于上述DsRed-eGFP和eGFP-DsRed系統(tǒng)的研究結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn) DsRed無(wú)論是作為標(biāo)記基因與eGFP融合表達(dá)，還是作為報(bào)告基因并借助于IRES 與eGFP分開表達(dá)，其表達(dá)情況均不理想，紅色熒光強(qiáng)度始終很低。因此，我們進(jìn)一步嘗試用具有較高活性的紅色熒光蛋白基因mRFP替代了DsRed-eGFP系統(tǒng)中的DsRed基因，構(gòu)建mRFP-eGFP系統(tǒng)，其中mRFP作為標(biāo)記基因并與報(bào)告基因eGFP融合表達(dá)。

將報(bào)告載體pmRFP-eGFP-BS和ZFNs表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞，ZFNs在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)后特異性的識(shí)別并切割靶序列，啟動(dòng)細(xì)胞SSA修復(fù)機(jī)制的原理見圖3A。轉(zhuǎn)染后48 h，通過(guò)熒光顯微鏡觀察細(xì)胞熒光情況(圖 3B)：不同處理組細(xì)胞中均有較多的紅色熒光，說(shuō)明mRFP作為標(biāo)記基因正常表達(dá)；陽(yáng)性對(duì)照組中紅色熒光和綠色熒光均很明顯，說(shuō)明mRFP-eGFP融合表達(dá)不影響二者的熒光特性；陰性對(duì)照組中只能觀察到紅色熒光，說(shuō)明 mRFP-eGFP系統(tǒng)中eGFP報(bào)告基因沒有明顯的自修復(fù)；3對(duì)ZFNs的實(shí)驗(yàn)組中均觀察到了綠色熒光細(xì)胞，說(shuō)明mRFP-eGFP報(bào)告系統(tǒng)工作；而綠色熒光細(xì)胞較少，這與實(shí)驗(yàn)中所使用的ZFNs的活性直接相關(guān)。

轉(zhuǎn)染后72 h，繼續(xù)觀察不同處理組細(xì)胞熒光情況，結(jié)果如圖4A所示：陽(yáng)性對(duì)照組中紅色熒光和綠色熒光均有所增強(qiáng)；陰性對(duì)照組中出現(xiàn)少量綠色熒光細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)組中綠色熒光細(xì)胞數(shù)量有所增加，且熒光強(qiáng)度增大。結(jié)果說(shuō)明mRFP-eGFP系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中對(duì)特異性核酸酶活性的有效檢測(cè)。

為了量化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，更為精確地反應(yīng)所檢測(cè)的核酸酶的活性情況，我們進(jìn)一步采用了流式細(xì)胞術(shù)對(duì)熒光細(xì)胞進(jìn)行了計(jì)數(shù)檢測(cè)，相應(yīng)結(jié)果用 FCS express 4軟件分析，數(shù)據(jù)如圖4B所示。最后以紅色熒光和綠色熒光雙陽(yáng)性細(xì)胞的比率來(lái)衡量所檢測(cè)ZFNs核酸酶的活性。具體計(jì)算方法如下：(1) 相對(duì)雙熒光陽(yáng)性細(xì)胞率=雙熒光陽(yáng)性細(xì)胞率/(雙熒光陽(yáng)性細(xì)胞率+紅色熒光陽(yáng)性細(xì)胞率)×100%；(2) 所檢測(cè)核酸酶活性=實(shí)驗(yàn)組雙熒光陽(yáng)性細(xì)胞率?陰性對(duì)照組雙熒光陽(yáng)性細(xì)胞率。相關(guān)計(jì)數(shù)結(jié)果如表 1所示：所檢測(cè)3對(duì)ZFNs (ZFN1、ZFN2和ZFN3)的活性分別為8.9%，9.3%和5.0%。

圖3 mRFP-eGFP雙熒光報(bào)告載體系統(tǒng)

3 討 論

近10年來(lái)，隨著基因組定點(diǎn)打靶技術(shù)的發(fā)展，ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas9等位點(diǎn)特異性核酸酶相繼應(yīng)運(yùn)而生，同時(shí)特異性核酸酶活性的檢測(cè)手段也在不斷發(fā)展進(jìn)步。其中，報(bào)告載體系統(tǒng)由于構(gòu)建快捷、改造簡(jiǎn)單、操作容易、經(jīng)濟(jì)有效、能夠通過(guò)介導(dǎo)篩選核酸酶陽(yáng)性細(xì)胞實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組修飾后的陽(yáng)性細(xì)胞克隆進(jìn)行富集和篩選等優(yōu)點(diǎn)，逐漸被研究工作者們所采用。

鑒于特異性核酸酶活性傳統(tǒng)的檢測(cè)手段(如T7E-I檢測(cè))主要是針對(duì)NHEJ修復(fù)機(jī)制所引入的Indels的檢測(cè)，基于 NHEJ修復(fù)機(jī)制的報(bào)告載體系統(tǒng)被充分重視并被廣泛應(yīng)用，而基于HR和SSA修復(fù)機(jī)制的報(bào)告載體系統(tǒng)則鮮有報(bào)道。

采用SSA修復(fù)機(jī)制則在引入DSBs后理論上可以實(shí)現(xiàn)報(bào)告基因100%的修復(fù)，因此具有更高的靈敏度，有利于活性較低的特異性核酸酶活性的檢測(cè)。我們研究團(tuán)隊(duì)對(duì)基于SSA修復(fù)機(jī)制的報(bào)告載體系統(tǒng)進(jìn)行了一系列的嘗試和應(yīng)用研究[17～19]。本研究先后嘗試設(shè)計(jì)并構(gòu)建了基于SSA修復(fù)機(jī)制的DsRed-eGFP系統(tǒng)、eGFP-DsRed系統(tǒng)和mRFP-eGFP系統(tǒng)；最終成功應(yīng)用 mRFP-eGFP系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)實(shí)驗(yàn)室自主篩選構(gòu)建的3對(duì)ZFNs的活性檢測(cè)，其活性檢測(cè)結(jié)果分別為8.9%、9.3%和5.0%。在后續(xù)的研究中，我們對(duì)DsRed-eGFP系統(tǒng)進(jìn)行了優(yōu)化，將DsRed和eGFP用不同的啟動(dòng)子各自單獨(dú)表達(dá)；同時(shí)為了降低報(bào)告載體的自修復(fù)效率，減短用于介導(dǎo)SSA修復(fù)機(jī)制的正向重復(fù)序列為 200 bp；最終實(shí)現(xiàn)了對(duì)一系列 CRISPR/ Cas9系統(tǒng)活性的高效檢測(cè)(最高達(dá)40%)[19]。但是由于所采用的核酸酶不同、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的參數(shù)不同，上述雙熒光報(bào)告系統(tǒng)之間并不能進(jìn)行有效的比較。

圖4 應(yīng)用mRFP-eGFP雙熒光報(bào)告載體系統(tǒng)檢測(cè)ZFNs活性

表1 應(yīng)用mRFP-eGFP雙熒光報(bào)告載體系統(tǒng)檢測(cè)ZFNs活性的結(jié)果

Kuhar等[21]最新開發(fā)的新型報(bào)告系統(tǒng)采用了NHEJ、HR和SSA三種修復(fù)機(jī)制并進(jìn)行了詳細(xì)的比較，發(fā)現(xiàn)SSA的效率是NHEJ的10倍以上。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)一步的研究中分別開發(fā)了基于 NHEJ 和SSA修復(fù)機(jī)制的DsRed-PuroR-eGFP (RPG)雙熒光雙報(bào)告基因系統(tǒng)，通過(guò)比較證明了SSA-RPG系統(tǒng)比NHEJ-RPG系統(tǒng)具有更高的靈敏度，且SSA同源臂的最優(yōu)長(zhǎng)度為200 bp[18]。

本研究通過(guò)對(duì)3種不同設(shè)計(jì)的SSA雙熒光報(bào)告載體系統(tǒng)的嘗試，成功獲得了能夠應(yīng)用于特異性核酸酶活性檢測(cè)的mRFP-eGFP系統(tǒng)，并初步應(yīng)用該系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)3對(duì)ZFNs活性的有效檢測(cè)；該系統(tǒng)比基于 NHEJ的雙熒光報(bào)告載體系統(tǒng)具有更高的靈敏度，為后續(xù)報(bào)告系統(tǒng)的改造和設(shè)計(jì)提供了經(jīng)驗(yàn)和借鑒，也為以后基因組修飾研究中特異性核酸酶活性的檢測(cè)提供了有效的手段。

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(責(zé)任編委: 呂紅)

Development and application of dual-fluorescence reporter systems for measuring specific nuclease activity based on SSA repair mechanism

Furong Han1, Ling Wang1,2, Kun Xu1, Zhiying Zhang1, Xin Wang1
1. College of Animal Science & Technology, Northwest A&F University, Yangling 712100, China; 2. School of Biological Science and Engineering, Shaanxi University of technology, Hanzhong 723000, China

Reporter vector system has become an important method for measuring activity of specific nucleases because of its fast construction, simple modification, easy operation, economic effectiveness as well as its role in enriching positive cells with genomic modification through mediating screen of specific nucleases positive cells. After introducing double strand breaks (DSBs), a reporter system based on non-homologous end joining (NHEJ)-mediated repair can only repair maximally two thirds of reporter genes after optimization, while single strand annealing (SSA)-mediated repair can repair all reporter genes theoretically which has higher sensitivity and facilitates the detection of specific nuclease with low activity and provides an effective way to detect specific nuclease activity in genome modification studies. In this study, we designed and constructed three sets of dual-fluorescence reporter systems basedon SSA repair mechanism and applied the mRFP-eGFP system in measuring the effective activity of three pairs of ZFNs, which was 8.9%, 9.3% and 5.0%, respectively. Our study provides an effective way to detect the activity of nucleases.

SSA; dual-fluorescence reporter system; specific nucleases

2015-06-01;

2015-09-06

陜西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(編號(hào)：2014K02-07-01)資助

韓芙蓉，碩士研究生，專業(yè)方向：動(dòng)物遺傳育種與繁殖。E-mail: hanfr611miffy@sina.com

王昕，博士，教授，研究方向：生物技術(shù)與家畜育種。E-mail: wxwza@126.com

10.16288/j.yczz.15-246

時(shí)間:2015-9-11 9:54:26

URL:http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20150911.0954.004.html