輝光放電低溫等離子體技術(shù)對(duì)微生物的殺菌動(dòng)力學(xué)及殺菌機(jī)制

李兆杰，楊麗君,*，劉小菁，王 靜，劉玉敏，李春喜

輝光放電低溫等離子體技術(shù)對(duì)微生物的殺菌動(dòng)力學(xué)及殺菌機(jī)制

李兆杰1，楊麗君1,*，劉小菁2，王 靜1，劉玉敏1，李春喜1

（1.威海出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東 威海 264205；2.威海職業(yè)學(xué)院，山東 威海 264210）

應(yīng)用研制的輝光放電低溫等離子體殺菌設(shè)備，以大腸桿菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、黃曲霉菌、白色念珠菌6種微生物為實(shí)驗(yàn)菌株，探討輝光放電低溫等離子體殺菌技術(shù)對(duì)不同微生物的殺菌動(dòng)力學(xué)；應(yīng)用掃描電鏡、透射電鏡、DNA電泳、光譜分析等技 術(shù)，探討輝光放電低溫等離子體的殺菌機(jī)制。結(jié)果表明：輝光放電低溫等離子體殺菌技術(shù)對(duì)大腸桿菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、黃曲霉菌、白色念珠菌6種微生物的有效殺滅時(shí)間分別為2、1.5、3、4、10、10 min。依據(jù)殺菌動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)，可以將6種微生物準(zhǔn)確分為革蘭氏陰性細(xì) 菌、革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和真菌3類(lèi)，這可能與微生物的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)有關(guān)；輝光放電低溫等離子體可能是通過(guò)帶電的高能粒子對(duì)細(xì)菌的細(xì)胞壁造成破壞，進(jìn)而殺死細(xì)菌。該研究為輝光放電低 溫等離子體技術(shù)廣泛用于微生物殺菌提供了重要的方法依據(jù)。

低溫等離子體；輝光放電；殺菌；動(dòng)力學(xué)；機(jī)制

致病菌是引起人類(lèi)疾病的重要因素之 一，對(duì)人類(lèi)健康造成極大的危害，也是食品安全的重大隱患。鑒于致病菌對(duì)食品安全及人類(lèi)健康的巨大威脅，對(duì)它們的有效殺滅非常重要。目前常用的食品滅菌技術(shù)主要有加熱滅菌、輻照滅菌和化學(xué)殺菌等。加熱滅菌所需的高溫通常會(huì)破壞食品原有的色、香、味、形，對(duì)食品品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)的影響很大，而且加熱滅菌能耗也較高，限 制了其應(yīng)用范圍。輻照滅菌是一種新型有效的殺菌方法，其應(yīng)用越來(lái)越廣泛，但輻照食品是否對(duì)人類(lèi)健康有危害 的困惑目前仍未明晰，像歐盟等一些國(guó)家對(duì)輻照食品仍持相當(dāng)嚴(yán)格和謹(jǐn)慎的態(tài)度，另外像日本核泄漏、河南杞縣“鈷60事件”等放射物質(zhì)泄漏事件也引起了人們對(duì)輻照技術(shù)使用的戒備心理。化學(xué) 殺菌的化學(xué)消毒劑一方面會(huì)影響食品原有的色、香、味，最重要的是其化學(xué)副產(chǎn)物直接威脅著人類(lèi)健康。鑒于上述問(wèn)題，開(kāi)發(fā)清潔、安全、高效、環(huán)保的殺菌新技術(shù)顯得尤為重要。

等離子體是氣體在受到外界高能量（高溫、強(qiáng)電磁場(chǎng)、輻射等）作用時(shí)電離產(chǎn)生的一種高度電離的氣體，其中的正負(fù)電荷總數(shù)相等，呈電中性，因而稱(chēng)為等離子體。低溫等離子體是相對(duì)于其體系中的高溫電子而言，即在低溫等離子體系中，電子的溫度很高，可達(dá)上千乃至上萬(wàn)攝氏度，而其中的離子及分子的溫度與常溫相當(dāng)，所以整個(gè)體系在宏觀(guān)上表現(xiàn)為常溫[1-3]。但其體系中的高能電子及各種激發(fā)態(tài)離子都具有很高的活性，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物的快速殺滅[4-7]。低溫等離子體殺菌技術(shù)較傳統(tǒng)殺菌技術(shù)具有低溫、快速、綠色、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)。特別在食品殺菌中的應(yīng)用方面，更具有無(wú)殘留、營(yíng)養(yǎng)成分無(wú)破壞等無(wú)可比擬的優(yōu)點(diǎn)。目前，關(guān)于低溫等離子體技術(shù)研究的重點(diǎn)主要體現(xiàn)在殺菌技術(shù)的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用方面。但是關(guān)于低溫等離子體殺菌技術(shù)對(duì)不同種類(lèi)微生物的殺菌動(dòng)力學(xué)研究鮮有報(bào)道。另外，關(guān)于低溫等離子體的殺菌機(jī)理，有研究表明溫度、紫外線(xiàn)、高壓電場(chǎng)、帶電粒子以及活性氧（reactive oxygen species，ROS）都在低溫等離子體的滅菌過(guò)程中起主要作用[8-12]。但迄今為止還沒(méi)有一個(gè)比較圓滿(mǎn)的答案。Montie等[9]對(duì)常壓低溫等離子體殺菌提出了3種假設(shè)：氫氧活性基團(tuán)引起脂質(zhì)的過(guò)氧化而失活、氨基酸氧化導(dǎo)致蛋白質(zhì)氧化引起的微生物失活以及氧化活性基團(tuán)引起的DNA氧化失活。石興民等[13-14]研究表明帶電粒子和ROS在低溫等離子體殺菌中起主要作用，而高壓電場(chǎng)的作用可以忽略。顧春英等[15]研究發(fā)現(xiàn)，等離子體臭氧對(duì)大腸桿菌的殺滅機(jī)理主要是作用于細(xì)胞壁和細(xì)胞膜。有研究表明，在大氣壓下的等離子體中，紫外光子產(chǎn)生又重新復(fù)合，難以到達(dá)處理的表面，因此紫外線(xiàn)并不對(duì)滅菌起作用[16-18]。低溫等離子體殺菌機(jī)理的多種假說(shuō)可能是由于低溫等離子體種類(lèi)的不同所致，這尚需針對(duì)某一類(lèi)型等離子體單獨(dú)進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

大腸桿菌（Escherichia coli，E. coli）ATCC 10536、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S. aureus）ATCC 12600、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes，L. monocytogenes）ATCC 19114、宋內(nèi)氏志賀氏菌（Shigella sonnei，S. sonnei）ATCC 25931美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)；黃曲霉菌（Aspergillus flavus， A. flavus）CGMCC 3.6434、白色念珠菌（Candida albicans，C. albicans）CGMCC 2.4159中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

細(xì)菌從-70℃接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯中，36.5℃培養(yǎng)18～24 h，備用。A. flavusCGMCC 3.6434劃線(xiàn)接種于孟加拉紅瓊脂平板，28℃培養(yǎng)5 d，C. albicans CGMCC 2.4159接種于YPD培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)18～24 h，備用。

三羥甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸美國(guó)Sigma公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒天根生物技術(shù)有限公司；計(jì)數(shù)瓊脂、YPD培養(yǎng)基、孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；瓊脂糖、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

輝光放電低溫等離子體殺菌設(shè)備（自制，交流輸出，0～10 kV，峰值功率120 W，工作頻率30～40 kHz，通過(guò)在電路中加入限流電阻維持輝光放電）。

核酸蛋白分析儀、核酸電泳儀美國(guó)Bio-Rad公司；掃描電鏡、透射電鏡日本JEOL公司；Tektronix TDS 1002示波器美國(guó)泰克公司；CR22GⅢ離心機(jī)日本日立公司；恒溫恒濕培養(yǎng)箱、干燥箱美國(guó)3M公司。

1.3方法

1.3.1殺菌動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)的繪制

1.3.1.1菌懸液的制備

分別吸取E. coli、S. aureus、L. monocytogenes、S. sonnei肉湯培養(yǎng)液1 mL于1.5 mL離心管中，無(wú)菌生理鹽水充分洗滌后，用核酸蛋白分析儀測(cè)定細(xì)胞濃度，并調(diào)整細(xì)胞濃度至107CFU/mL。

用接種環(huán)從孟加拉紅瓊脂平板上刮取A. fl avus菌絲，轉(zhuǎn)入盛有1 mL無(wú)菌生理鹽水的1.5 mL離心管中，用移液器充分吹打。吸取C. albicansYPD培養(yǎng)液1 mL于1.5 mL離心管中，無(wú)菌生理鹽水充分洗滌并調(diào)整細(xì)胞濃度至106CFU/mL。

1.3.1.2涂片

吸取E. coli菌懸液10μL于一無(wú)菌載玻片上，均勻涂開(kāi)。設(shè)置1、1.5、2、3、4 min 5個(gè)殺菌處理時(shí)間，每個(gè)處理時(shí)間分別制作6個(gè)涂片，3個(gè)用于滅菌，3個(gè)用作對(duì)照。S. sonnei處理方法同E. coli。

S. aureus、L. monocytogenes涂片制備方法同E. coli。設(shè)置1、2、2.5、3、4 min 5個(gè)殺菌處理時(shí)間，涂片處理方法同E. coli。

A. flavus、C. albicans涂片制備方法同E. coli。設(shè)置5、8、10、12、15 min 5個(gè)殺菌處理時(shí)間，涂片處理方法同E. coli。

1.3.1.3殺菌

打開(kāi)氣瓶閥門(mén)，待放電氣體氬氣充滿(mǎn)整個(gè)氣體管路并將滅菌腔室中的空氣排凈，接通高壓電源開(kāi)始放電產(chǎn)生刷狀低溫等離子體射流。調(diào)整放電參數(shù)為：峰值電壓10 kV，工作頻率30～40 kHz，峰值功率120 W，氣體流量2 L/min，氣壓為常壓，溫度為室溫。通過(guò)控制電壓和氣體流量保證放電裝置持續(xù)放電產(chǎn)生等離子體。待低溫等離子體充滿(mǎn)整個(gè)滅菌腔室后，將各菌涂片置于滅菌室載物臺(tái)上，載物臺(tái)高度距離放電端口6 cm。對(duì)照于室溫條件下放置同樣時(shí)間。

1.3.1.4滅菌效果檢測(cè)

將處理組和對(duì)照組載玻片分別放于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，加入20 mL無(wú)菌生理鹽水將菌體全部洗下。然后吸取50μL菌懸液涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，36.5℃培養(yǎng)18～24 h，采用平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)存活的菌體數(shù)量。A. fl avus和C. albicans涂布于孟加拉紅瓊脂平板上，28℃培養(yǎng)5 d后進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.2輝光放電低溫等離子體的殺菌機(jī)理實(shí)驗(yàn)

1.3.2.1菌懸液的制備

制備E. coli和S. aureus2種菌懸液，方法同1.3.1.1節(jié)。最后調(diào)整菌液濃度至109CFU/mL。

1.3.2.2涂片

吸取E. coli、S. aureus菌懸液100μL滴于無(wú)菌載玻片上，均勻涂開(kāi)。每種菌分別制作3個(gè)涂片。

1.3.2.3殺菌

滅菌方法同1.3.2.3節(jié)。E. coli、S. aureus均處理4 min。

1.3.2.4掃描電鏡觀(guān)察

將2種菌經(jīng)殺滅處理后的涂片各一片放于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，加入1.5 mL 25 mL/L的戊二醛固定液（固 定液內(nèi)舍有0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液、40 g/L多聚甲醛）進(jìn)行充分清洗，使細(xì)菌完全脫離載玻片。然后將菌懸液轉(zhuǎn)入離心管中，4℃固定2 h。0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液浸洗30 min，10 mL/L四氧化鋨固定液4℃后固定2 h（固定液內(nèi)含有0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液），0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液浸洗10 min，用30%乙醇10 min，50%乙醇10 min，70%乙醇10 min，90%乙醇10 min（2次），100%乙醇10 min（3次）梯度脫水，醋酸戊酯置換10 min，臨界點(diǎn)干燥、噴金，掃描電鏡下觀(guān)察、拍照。未經(jīng)殺滅處理的對(duì)照樣本作同樣處理。

1.3.2.5透射電鏡觀(guān)察

將2種菌經(jīng)殺滅處理后的涂片各一片放于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，加入1.5 mL 25 mL/L的戊二醛固定液清洗后，轉(zhuǎn)入離心管中4℃固定2 h，后續(xù)處理同掃描電鏡觀(guān)察。乙醇梯度脫水后，環(huán)氧丙烷置換10 min，環(huán)氧樹(shù)脂Epon 812浸透、包埋，聚合后作半超薄切片，美蘭染色后光學(xué)顯微鏡下定位，進(jìn)行超薄切片50～70 nm，醋酸鈾、檸檬酸鉛染色后，透射電鏡下觀(guān)察、拍照。未經(jīng)殺滅處理的對(duì)照樣本作同樣處理。

1.3.2.6 DNA電泳

將2種菌經(jīng)殺滅處理后的涂片各一片放于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，加入1.5 mL無(wú)菌生理鹽水將細(xì)菌完全洗下，然后將菌懸液轉(zhuǎn)入離心管中。

E. coli、S. aureus的DNA提取根據(jù)細(xì)菌總DNA提取試劑盒進(jìn)行。

取1 ?L DNA樣品，0.5%瓊脂糖凝膠，120 V電泳45 min。溴化乙錠染色，紫外凝膠成像系統(tǒng)觀(guān)察檢測(cè)DNA的完整性。

1.3.2.7光譜采集

控制輝光放電低溫等離子體殺菌設(shè)備放電，放電設(shè)置及參數(shù)同1.3.1.3節(jié)。待低溫等離子體充滿(mǎn)整個(gè)滅菌腔室后，打開(kāi)滅菌腔，將示波器探頭對(duì)準(zhǔn)并靠近等離子體噴射口采集等離子體激發(fā)光譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 6種微生物的殺菌動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)

圖1 輝光放電低溫等離子體對(duì)6 種微生物的殺菌動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)Fig.1 Bactericidal kinetic curves of low temperature glow discharge plasma for 6 microorganisms

殺菌處理后的菌體細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)后，記錄平板上的活菌數(shù)，以殺菌時(shí)間為橫坐標(biāo)，活菌數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制6種微生物的殺菌動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)。由圖1可知，研制的輝光放電低溫等離子體殺菌設(shè)備可以對(duì)6種微生物實(shí)現(xiàn)快速、有效殺滅。從殺菌速率上看，E. coli和S. sonnei最快被殺滅，在殺菌處理1 min時(shí)，細(xì)菌存活數(shù)已明顯減少；從徹底殺滅微生物所需時(shí)間上看，E. coli和S. sonnei所需時(shí)間最短，分別只需要2 min和1.5 min，S. aureus需要3 min，L. monocytogenes需要4 min，A. flavus和C. albicans均需要10 min；從殺菌動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)形狀看，E. coli和S. sonnei的曲線(xiàn)形狀相似，S. aureus和L. monocytogenes相似，A. flavus和C. albicans屬于一類(lèi)，各種菌的殺菌動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)將6 種微生物準(zhǔn)確的分為革蘭氏陰性細(xì)菌、革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和真菌3 類(lèi)。

2.2輝光放電低溫等離子體的殺菌機(jī)理

2.2.1掃描電鏡結(jié)果

經(jīng)掃描電鏡觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，在10 000和30 000倍電鏡視野下，等離子體處理前，玻片表面的細(xì)菌分布均勻，細(xì)菌表面光滑，邊界完整，形態(tài)飽滿(mǎn)（圖2A、2C）。經(jīng)輝光放電低溫等離子體處理后，可見(jiàn)細(xì)菌 胞壁和胞膜破裂，胞質(zhì)外溢，細(xì)胞皺縮，失去原有形態(tài)，有的僅殘存一些細(xì)胞碎片（圖2B、2D）。

圖2 大腸桿菌（×10 000）和金黃色葡萄球菌（×30 000）的掃描電鏡圖Fig.2 Scanning electron microscopy ofE. coli(×10 000) andS. aureus(×30 000) before and after plasma exposure

2.2.2 透射電鏡結(jié)果

經(jīng)透射電鏡觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，正常的大腸桿菌呈桿狀，金黃色葡萄球菌呈球形，細(xì)胞壁及細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)極明顯，電子密度較高，胞漿內(nèi)電子密度均一（圖3A、3C）。經(jīng)輝光放電低溫等離子體處理后，細(xì)菌細(xì)胞壁和胞漿內(nèi)電子密度都降低。有的菌體細(xì)胞壁及細(xì)胞膜斷裂，核心溶解，菌體近似空殼（圖3B、3D）。2.2.3核酸電泳結(jié)果

圖3 大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的透射電鏡圖Fig.3 Transmission electron microscopy ofE. coliandS. aureusbefore and after plasm a exposure

對(duì)細(xì)菌基因組DNA電泳結(jié)果顯示，經(jīng)輝光放電低溫等離子體處理細(xì)菌的核酸和對(duì)照核酸大小一致，且?guī)屯暾?，沒(méi)有拖尾現(xiàn)象（圖4）。初步推測(cè)輝光放電低溫等離子體處理未對(duì)細(xì)菌的核酸造成明顯破壞。

圖4 大腸桿菌和金黃色葡萄球菌基因組DNA電泳圖Fig.4 Electrophoresis of genomic DNA ofE. coliandS. aureus

2.2.4光譜分析

圖5 輝光放電低溫等離子體的光譜圖Fig.5 Spectrogram of low temperature glow discharge plasma

由圖5可知，低溫等離子體在700～1 000 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)氬氣有較大激發(fā)，主要為可見(jiàn)光和近紅外光線(xiàn)，在300～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)有微弱激發(fā)，主要為紫外線(xiàn)，可能與滅菌腔體中的少量空氣有關(guān)。由光譜分析結(jié)果可以說(shuō)明低溫等離子體激發(fā)氬氣產(chǎn)生的幾種射線(xiàn)不是導(dǎo)致細(xì)菌死亡的主要原因。

3 討 論

在設(shè)備研制方面，由于大氣壓下的輝光放電極易向電弧放電轉(zhuǎn)化，大氣壓下輝光放電等離子體的產(chǎn)生及維持非常困難。目前維持大氣壓下輝光放電的方法主要有3 種，分別是串聯(lián)電阻、介質(zhì)阻擋、短脈沖驅(qū)動(dòng)[19-20]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在電路中加入限流電阻的形式來(lái)維持輝光放電，解決了大氣壓下的輝光放電問(wèn)題，從而保證了放電等離子體的“低溫”。

從6 種微生物的殺菌動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)來(lái)看，各種菌的殺滅時(shí)間有所不同，分析原因可能與微生物的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)有關(guān)。細(xì)胞壁越厚，擊碎或是穿透細(xì)胞壁需要的時(shí)間越長(zhǎng)。革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的厚度約為2 nm，革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞壁厚度為15～18 nm[21]，而真菌細(xì)胞壁的厚度則達(dá)到100～200 nm。細(xì)胞壁的厚度恰好與微生物的殺滅時(shí)間呈正相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)提供了一個(gè)應(yīng)用低溫等離子體技術(shù)進(jìn)行殺菌的新思路，即通過(guò)對(duì)各類(lèi)微生物進(jìn)行殺菌動(dòng)力學(xué)研究，總結(jié)歸納出各類(lèi)微生物的殺滅規(guī)律，便可得到針對(duì)大多數(shù)微生物的廣譜滅菌參數(shù)。比如，若對(duì)一般的細(xì)菌進(jìn)行殺菌，需要4～5 min即可；若對(duì)真菌進(jìn)行殺菌，則需要10 min左右。這將為輝光放電低溫等離子體殺菌技術(shù)廣泛用于微生物殺菌提供重要的方法依據(jù)，從而有助于推動(dòng)低溫等離子體技術(shù)在殺菌領(lǐng)域特別是食品殺菌領(lǐng)域的推廣應(yīng)用。當(dāng)然，微生物往往借助于各種“寄主”生存。因此，在實(shí)際應(yīng)用中，必須考慮微生物生存基質(zhì)對(duì)殺菌效果的影響，這是低溫等離子體殺菌技術(shù)需要重點(diǎn)研究和解決的問(wèn)題。

低溫等離子體滅菌機(jī)制包括等離子體物理和細(xì)胞分子生物學(xué)兩個(gè)方面。從等離子體物理方面來(lái)講，由于低溫等離子體成分復(fù)雜，其中有殺菌作用的成分有帶電粒子（離子和電子）、紫外線(xiàn)、ROS以及射線(xiàn)，這與放電氣體和放電方式有關(guān)。故究竟哪種成分起主要作用，目前尚存在爭(zhēng)議。從細(xì)胞分子 生物學(xué)方面來(lái)講，需要確定等離子體破壞微生物細(xì)胞的具體位點(diǎn)，比如細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞中的蛋白質(zhì)、酶、亞細(xì)胞器以及DNA等都有可能是等離子體的作用靶點(diǎn)，而低溫等離子體究竟破壞了微生物細(xì)胞內(nèi)哪些組分而導(dǎo)致微生物死亡，目前也不十分清楚。本研究從等離子體物理和細(xì)胞分子生物學(xué)兩方面探討了輝光放電氬氣低溫等離子體對(duì)微生物的殺滅機(jī)制。對(duì)氬氣等離子體的光譜分析可以說(shuō)明低溫等離子體激發(fā)氬氣產(chǎn)生的幾種射線(xiàn)不是導(dǎo)致細(xì)菌死亡的主要原因，這與Moisan等[22]的研究結(jié)論一致。張劍等[23]也證明了過(guò)氧化氫等離子體殺滅芽孢桿菌過(guò)程中，紫外線(xiàn)并不起主要作用。另外，核酸電泳結(jié)果說(shuō)明低溫等離子體并未造成菌體DNA的明顯斷裂，也進(jìn)一步說(shuō)明紫外線(xiàn)并不是殺死細(xì)菌的主要原因。掃描電鏡和透射電鏡觀(guān)察結(jié)果顯示，低溫等離子體明顯破壞了細(xì)菌的外部結(jié)構(gòu)（細(xì)胞壁和細(xì)胞膜），這與張燦等[24]的研究結(jié)果一致。因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)采用氬氣作為放電氣體，所以不存在ROS的氧化作用。因此，這可能是低溫等離子體中的帶電粒子的擊穿作用所致。綜上分析，初步得出氬氣低溫等離子體可能是通過(guò)帶電的高能粒子對(duì)細(xì)菌的細(xì)胞壁造成破壞，進(jìn)而殺死細(xì)菌的結(jié)論。至于低溫等離子體是怎樣破壞細(xì)菌的外部結(jié)構(gòu)，比如是否破壞了細(xì)胞壁中肽聚糖結(jié)構(gòu)，是否將蛋白質(zhì)分解成小分子的多肽片段等，目前并不清楚，還需進(jìn)一步研究。

輝光放電低溫等離子體殺菌技術(shù)克服了熱力、化學(xué)及輻照等方法中的不足，將具有較大的應(yīng)用前景和研究?jī)r(jià)值。未來(lái)對(duì)該技術(shù)的研究重點(diǎn)應(yīng)放在：1）加強(qiáng)低溫等離子體的應(yīng)用研究特別是在食品殺菌領(lǐng)域的應(yīng)用研究；2）研究低溫等離子體殺菌技術(shù)與其他殺菌方法結(jié)合使用的效果，結(jié)合多種殺菌方法優(yōu)勢(shì)，開(kāi)發(fā)新型殺菌設(shè)備；3）繼續(xù)深入研究各種低溫等離子體的殺菌機(jī)理，為其在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供更多理論依據(jù)。

[1] 馬挺軍,史喜成,賈唱喜.低溫等離子體在食品殺菌中的研究進(jìn)展[J].農(nóng)產(chǎn)品加工:創(chuàng)新版, 2009(6): 8-11.

[2] 倪盈,陳永昌,王明連,等.低溫等離子體殺菌的實(shí)驗(yàn)研究[J].環(huán)境工程學(xué)報(bào), 2009, 3(11): 1951-1955.

[3] 李蘊(yùn).低溫等離子體滅菌新技術(shù)及在食品中的應(yīng)用[J].華東科技:學(xué)術(shù)版, 2012(12): 47.

[4] 石興民,張冠軍,袁育康,等.低溫等離子體對(duì)細(xì)菌芽孢的滅活研究[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 29(10): 2033-2036.

[5] 劉筱娣,杜寧,彭磊,等.一種低溫等離子體針對(duì)變形鏈球菌殺滅效果的研究[J].中國(guó)消毒學(xué)雜志, 2010, 27(4): 373-378.

[6] 林向陽(yáng),黃彬紅,李雁暉,等.低溫等離子體殺滅橙汁S. aureus的研究[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2011, 27(5): 439-446.

[7] 鄭自娜,流云風(fēng),于俊梅.低溫等離子體滅菌的應(yīng)用[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志, 2009, 19(8): 945-946.

[8]LAROUSSI M. Nonthermal decontamination of biological media by atmospheric-pressure plasmas: review, analysis, and prospects[J]. IEEE Transactions on Plasma Science, 2002, 30(4): 1409-1415.

[9]MONTIE C T, KELLY-WINTENBERG K, REECE R J. An overview of research using the one atmosphere uniform glow discharge plasma (OAUGDP) for sterilization of surfaces and materials[J]. IEEE Transactions on Plasma Science, 2000, 28(1): 41-50.

[10]LARONSSI M, LEIPOLD F. Evaluation of the roles of reactive species, heat, and UV radiation in the inactivation of bacterial cells by air plasmas at atmospheric pressure[J]. International Journal of Mass Spectrometry, 2004, 233(1/3): 81-86.

[11] 劉紅霞,陳杰.低溫等離子體滅菌研究與應(yīng)用進(jìn)展[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué), 2009, 36(14): 2695-2698.

[12] 葉幗嬪,張茜,潘紅,等.低溫等離子體活性水對(duì)致病菌的作用[J].中國(guó)科學(xué):生命科學(xué), 2013, 43(8): 679-684.

[13] 石興民,郝炳華,袁育康,等.氣體等離子體對(duì)細(xì)菌損傷作用的電鏡觀(guān)察[J].中國(guó)消毒學(xué)雜志, 2003, 20(4): 284-286.

[14] 石興民,張冠軍,袁育康,等.低溫等離子體對(duì)白色念珠菌影響的電鏡觀(guān)察[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版, 2009, 30(6): 775-776.

[15] 顧春英,薛廣波,居喜娟.等離子體臭氧對(duì)大腸桿菌的殺滅機(jī)理研究[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué), 2004, 31(1): 33-35.

[16]DENG X T, SHI J J, KONG M G. Physical mechanisms of inactivation ofBacillus subtilisspores using cold atmospheric plasmas[J]. IEEE Transactions on Plasma Science, 2006, 34(4): 1310-1316.

[17]LAROUASI M. Sterili zation of contaminated matter with an atmospheric pressure plasma[J]. IEEE Transaction s on Plasma Science, 1996, 24(3): 1188-1191.

[18]HERRMANN H W, HENINS I, PARK J, et al. Decontamination of chemical and biological warfare (CBW) agents using an atmospheric pressure plasma jet(APPJ)[J]. Physics of Plasma, 1999, 6(5): 2284-2289.

[19] 盧新培,嚴(yán)萍,任春生,等.大氣壓脈沖放電等離子體的研究現(xiàn)狀與展望[J].中國(guó)科學(xué):物理學(xué) 力學(xué) 天文學(xué), 2011, 41(7): 801-815.

[20] 潘利江,劉文正,張德金,等.大氣壓輝光放電向弧光放電的轉(zhuǎn)化特性研究[J].電源技術(shù), 2012, 36(6): 885-888.

[21]GAUN L F, BEGGS C B, GEORGHIOU G E. Bactericidal action of the reactive species produced by gas-discharge nonthermal plasma at atmospheric pressure: a review[J]. IEEE Transactions on Plasma Science, 2006, 34(4): 1257-1269.

[22]MOISAN M, BARBEAU J, CREVIER M C, et al. Plasma sterilization methods mechanisms[J]. Pure and Applied Chemistry, 2002, 74(3): 349-358.

[23] 張劍,史紹毅,朱亭亭.過(guò)氧化氫擴(kuò)散和等離子體放電對(duì)嗜熱脂肪芽孢殺滅效果比較[J].中國(guó)消毒學(xué)雜志, 2014, 31(7): 677-682.

[24] 張燦,劉文君,張明露.水中細(xì)菌的低溫等離子體滅活效果[J].環(huán)境與健康雜志, 2013, 30(12): 1081-1083.

Bactericidal Kinetics and Mechanisms of Low Temperature Glow Discharge Plasma

LI Zhaojie1, YANG Lijun1,*, LIU X iaojing2, WANG Jing1, LIU Yumin1, LI Chunxi1
(1. Weihai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Weihai 264205, China; 2. Weihai Vocational College, Weihai 264210, China)

Low temperature plasma glow discharge sterilizer was developed and used to study the bactericidal kinetics of six microorganisms includingEscherichia coli,Shigella sonnei,Staphylococcus aureus,List eria monocytogenes,Aspergillus fl avusandCandida albicans. Moreover, the bactericidal mechanisms were studied by scanning electron microscopy, transmission electron microscopy, DNA electrophoresis and spectroscopy analysis. It was shown that low temperature g l ow discharge plasma could killE. coli,S. sonnei,S. aureus,L. monocytogenes,A. fl avusandC. albicansieffectively in 2, 1.5, 3, 4, 10 and 10 minutes, respectively. According to the bactericidal kinetic curves, the six microorganisms were c lassified into three categories, namely gram-negative bacteria, gram-positive bacteria and fungi, which may be resulted from the different structures of cell walls of microorganisms. Furthermore, the char ged particles with high energy produced by low temperature glow discharge plasma played a dominant role in plasma-induced bacterial spore inactivation by destroying bacterial cell walls. This study may provide an important method basis for the application of low temperature g low discharge plasma in sterilization of microorganisms.

low temperature plasma; glow discharge; sterilization; kinetics; mechanism

Q31

1002-6630（2015）11-0167-05

10.7506/spkx1002-6630-201511032

2014-08-24

國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局科研項(xiàng)目（2012IK179；2010IK151）

李兆杰（1981—），男，高級(jí)工程師，博士，主要從事微生物學(xué)、生物毒素研究。E-mail：94743836@qq.com

*通信作者：楊麗君（1969—），女，高級(jí)工程師，碩士，主要從事微生物學(xué)、海洋毒素研究。E-mail：hunterlee_81@163.com