聶 牧，王 云，郭守東，劉 浩，姜 瑋，趙曉民,*

板栗多糖抗動脈血栓形成的作用

聶 牧1，王 云2，郭守東2，劉 浩1，姜 瑋1，趙曉民2,*

（1.泰山醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271000；2.泰山醫(yī)學(xué)院動脈粥樣硬化研究所，山東 泰安 271000）

目的：研究板栗多糖對小鼠動脈血栓形成的影響。方法：熱水提取法制備板栗多糖，小鼠連續(xù)灌胃給藥（板栗多糖50、100、200 mg/kg）10 d，剪尾法測定出血時間，玻片法檢測凝血時間，在5%氯化鐵（FeCl3）誘導(dǎo)的小鼠頸總動脈血栓模型中，用激光多普勒血流儀觀察記錄血栓形成時間、血流變異性，而后稱量血栓質(zhì)量。結(jié)果：板栗多糖（100、200 mg/kg）可明顯延長小鼠出血時間、凝血時間及血栓形成時間，降低血流波動性。結(jié)論：板栗多糖具有抗動脈血栓形成的作用，機制與其抗血小板和抗凝血有關(guān)。

板栗多糖；出血時間；凝血時間；抗血栓

動脈血栓形成或栓塞是心腦血管疾病患者致死致殘的主要原因之一，藥物防治血栓形成是一項重要的預(yù)防和治療措施。板栗（Castanea mollissimaBlume）為殼斗科栗屬堅果類植物[1]，是我國傳統(tǒng)的農(nóng)副產(chǎn)品，也是世界上重要的干果之一，其經(jīng)濟價值較高，種植板栗是發(fā)展山區(qū)經(jīng)濟及山區(qū)農(nóng)民迅速脫貧致富的一個重要途徑，其被山區(qū)農(nóng)民稱為“鐵桿莊稼”。板栗在我國分布區(qū)域廣泛，主要集中在黃河流域的華北地區(qū)和長江流域的部分地區(qū)。板栗可藥食兩用，具有健脾活血、補腎強筋等顯著的藥用價值和保健功能[2]。唐代孫思邈《備急千金要方》記載：“栗子，味咸溫?zé)o毒，益氣厚腸胃，補腎氣，令人耐饑，生食之，甚治腰腳不遂”。明代李時珍《本草綱目》記載：“栗治腎虛、腰腿無力，能通腎益氣，厚腸胃也，腎主大便，栗能主腎”。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為，板栗富含淀粉、可溶性糖、粗纖維、氨基酸、蛋白質(zhì)、脂肪酸、維生素、胡蘿卜素及微量元素等多種營養(yǎng)成分[3-4]，可供人體吸收和利用的營養(yǎng)成分含量高達98%，可增強人體免疫力和抗癌能力，尤其對高血壓、冠心病和動脈硬化等心血管疾病有良好的防治效果[5]。板栗多糖是板栗的有效成分之一，已有研究表明板栗多糖具有明顯的抗凝血[6]、抗氧化[7-9]活性，因此推斷其可能對血栓形成有干預(yù)作用，然而目前尚未見板栗多糖抗血栓形成作用的報道。為此，本實驗進行板栗多糖對血小板量變和血栓形成作用的研究，旨在為板栗的臨床應(yīng)用和防治血栓性疾病提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1動物、材料與試劑

健康雄性SPF級昆明種小鼠，5～6周齡，體質(zhì)量（20±2）g，購自泰安市泰邦生物科技有限公司。標準飼料喂養(yǎng)，在溫度（23±2） ℃、相對濕度50%～70%的環(huán)境下適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后開始實驗。

板栗采摘自泰山醫(yī)學(xué)院校本部，由泰山醫(yī)學(xué)院中藥教研室鑒定品種為泰安薄殼板栗。

戊巴比妥鈉德國Merck公司；阿司匹林美國Sigma公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

Laborota 4002-control型低壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀德國Heidolph公司；T6-新世紀190-1100型紫外-可見分光光度計北京普析通用儀器公司；AB265-S型電子分析天平瑞士Mettler Toledo設(shè)備公司；PeriFlux5001型激光多普勒血流儀瑞典百靈威公司；PE-6800VET型全自動血細胞分析儀深圳市普康電子有限公司；Milli-Q Systhsis型超純水系統(tǒng)法國Millipore公司。

1.3方法

1.3.1板栗多糖的提取及含量測定

按照文獻[10]所述的方法提取多糖，略有修改：板栗去皮粉碎，60 ℃烘干10 h，冷卻后稱取板栗粉100 g，加蒸餾水2 000 mL，70 ℃水浴回流2 h，冷卻后過濾，濾液以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至400 mL，加入4倍體積的95%乙醇，4 ℃靜置24 h，傾倒棄上清液后離心，沉淀溶于400 mL去離子水，Sevag法[11]除蛋白4～5次直至不再有蛋白層為止，同上方法濃縮，加入95%乙醇，靜置6 h，棄上清液后離心，沉淀先后用無水乙醇和乙醚洗滌2次，自然晾干。依文獻[12]鑒別確認為板栗多糖。得率為6.7%，4 ℃條件下存放。經(jīng)硫酸-苯酚法[13]測定多糖含量為67%，放置6、12、24個月，多糖質(zhì)量穩(wěn)定，含量均為（66±1）%。

1.3.2小鼠體質(zhì)量、血細胞計數(shù)和血小板平均體積測定

將60只小鼠隨機平均分為5組，每組12只：空白對照組（生理鹽水20 mL/（kg·d））；阿司匹林組為陽性對照（20 mg/（kg·d））；板栗多糖低（50 mg/（kg·d））、中（100 mg/（kg·d））、高（200 mg/（kg·d））劑量組。以上均為灌胃給藥（以體質(zhì)量計，下同），連續(xù)10 d。記錄實驗前后小鼠體質(zhì)量，末次給藥2 h后，以戊巴比妥鈉（100 mg/kg）腹腔注射麻醉小鼠，心臟取血，肝素抗凝。用電子血球計數(shù)儀檢測血液中紅細胞（red blood cell，RBC）、白細胞（white blood cell，WBC）、血小板（platelet，PLT）計數(shù)以及血小板平均體積（mean platelet volume，MPV）。

1.3.3剪尾法測定出血時間

分組及給藥方式同1.3.2節(jié)。末次給藥2 h后，將小鼠置于固定器中，使其尾部自然下垂，在距離尾尖5 mm處剪斷，將小鼠尾尖置于37 ℃生理鹽水中液面下1.5 cm處觀察血流。自剪斷尾尖開始計時，至血流停止的時間，即為出血時間[14]。

1.3.4玻片法測定凝血時間

分組及給藥方式同1.3.2節(jié)。末次給藥后2 h，用眼科鑷迅速摘去小鼠一側(cè)眼球，棄第1滴血后將血液滴于載玻片上，每隔20～30 s用大頭針自血滴邊緣向中間輕輕挑動1次，當有血絲挑起時停止計時。從采血開始至挑起血絲的時間即為凝血時間[15]。

1.3.5血栓形成時間、血流變異性和血栓質(zhì)量測定

將72只小鼠隨機平均分為6組，每組12只：空白對照組（生理鹽水20 mL/（kg·d））、血栓模型組（生理鹽水20 mL/（kg·d））、阿司匹林組（20 mg/（kg·d））、板栗多糖低（50 mg/（kg·d））、中（100 mg/（kg·d））、高（200 mg/（kg·d））劑量組，給藥方法同1.3.2節(jié)。末次給藥2 h后，用氯化鐵（FeCl3）誘導(dǎo)形成小鼠頸總動脈血栓模型[16-17]，測定血流變異性、血栓形成時間和血栓質(zhì)量：以戊巴比妥鈉（100 mg/kg）腹腔注射麻醉小鼠，仰位固定，切開頸部皮膚，暴露右側(cè)頸總動脈，用激光多普勒血流儀記錄血流10 min后，將頸總動脈段環(huán)裹濾紙條（1 mm×3 mm）：空白對照組濾紙浸透雙蒸水，其他各組濾紙浸透5%FeCl3，3 min后取下濾紙條，繼續(xù)檢測血流。從取下濾紙條至頸總動脈血流量降至并穩(wěn)定在120 PU以下保持1 min的時間為血栓形成時間，血流變異性為血栓形成時間內(nèi)的血流標準差。以濾紙環(huán)裹處為中心，截取0.5 cm長的血管段，稱質(zhì)量，減去取出血栓后的血管質(zhì)量，即為血栓質(zhì)量。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)以±s表示，多組間采用單因素方差分析，兩組間比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1板栗多糖對小鼠體質(zhì)量、血細胞計數(shù)和血小板平均體積的影響

表1 板栗多糖對小鼠體質(zhì)量、血細胞計數(shù)和血小板平均體積的影響Table 1 Effect of chestnut polysaccharide on body weight, blood cell count and mean platelet volume (MPV) in mice

由表1可知，各組小鼠初體質(zhì)量無明顯差異。灌胃10 d后，與空白對照組比較，板栗多糖（除200 mg/kg劑量組小鼠體質(zhì)量極顯著增加（P＜0.01））對小鼠體質(zhì)量、血小板計數(shù)和血小板平均體積均無明顯影響。

2.2板栗多糖對小鼠出血時間、凝血時間的影響

表2 板栗多糖對小鼠出血時間、凝血時間的影響Table 2 Effect of chestnut polysaccharide on bleeding time and coagulation time in mice

由表2可知，與空白對照組比較，阿司匹林組、板栗多糖中、高劑量組出血時間、凝血時間均顯著延長。與板栗多糖低劑量組比較，板栗多糖高劑量組與阿司匹林組出血時間均極顯著延長（P＜0.01）；與板栗多糖中劑量組比較，阿司匹林組出血時間極顯著延長（P＜0.01）。與板栗多糖低劑量組比較，板栗多糖高劑量組與阿司匹林組凝血時間均極顯著延長（P＜0.01）。這說明板栗多糖能抑制小鼠的出血和凝血功能，且具有劑量依賴關(guān)系。

2.3板栗多糖對小鼠頸總動脈血栓形成時間和血栓質(zhì)量的影響

由表3可知，與空白對照組比較，血栓模型組的血栓形成時間為4.88 min，血栓質(zhì)量為0.21 mg，表明血栓模型建立成功。與血栓模型組比較，板栗多糖各劑量組和阿司匹林組均極顯著延長血栓形成時間（P＜0.01）；與板栗多糖低劑量組比較，板栗多糖中、高劑量組和阿司匹林組均極顯著延長血栓形成時間（P＜0.01）；與板栗多糖中劑量組比較，板栗多糖高劑量組和阿司匹林組均極顯著延長血栓形成時間（P＜0.01）；與板栗多糖高劑量組比較，阿司匹林組極顯著延長血栓形成時間（P＜0.01）。即阿司匹林延長血栓形成時間的效果強于板栗多糖。各組小鼠頸總動脈的血栓質(zhì)量未見明顯差異。

表3 板栗多糖對小鼠頸總動脈血栓形成時間和血栓質(zhì)量的影響Table 3 Effect of chestnut polysaccharide on time to occlusion and thrombosis weight in common carotid artery of mice

2.4板栗多糖對FeCl3誘導(dǎo)血栓模型小鼠頸總動脈血流變異性的影響

表4 板栗多糖對FeeCCll3誘導(dǎo)血栓模型小鼠頸總動脈血流變異性的影響Table 4 Effect of chestnut polysaccharide on blood flow variability in carotid artery of mice before and after FeCl3-induced injjuurryy

由表4可知，F(xiàn)eCl3損傷前，各組小鼠血流變異性大小均未見統(tǒng)計學(xué)差異。環(huán)裹浸潤雙蒸水濾紙條后，空白對照組血流變異性無明顯變化。環(huán)裹浸潤5%FeCl3濾紙條后，其余組血流變異性較損傷前均極顯著增加（P＜0.01）。FeCl3損傷后，與空白對照組比較，血栓模型組血流變異性極顯著升高（P＜0.01）；與血栓模型組比較，板栗多糖組（100、200 mg/kg）、阿司匹林組血流變異性均極顯著降低（P＜0.01）。

3 討 論

血栓形成是缺血性心腦血管疾病及血栓栓塞性疾病的重要病理基礎(chǔ)，抑制血小板活化和抑制凝血活性為干預(yù)血栓形成的重要手段。因而本研究對板栗多糖抗血小板、抗凝血和抗血栓形成作用進行了初步探討。

實驗首先觀察了板栗多糖對小鼠一般狀態(tài)的影響，結(jié)果表明灌胃板栗多糖對小鼠體質(zhì)量（除200 mg/kg劑量組升高外）、血細胞計數(shù)和血小板平均體積無明顯影響，表示板栗多糖對小鼠機體健康狀態(tài)無異常影響。但未觀察到文獻[12]中所述的板栗多糖升高白細胞現(xiàn)象，可能與實驗條件不同有關(guān)。

出血時間和凝血時間分別反映血小板功能和內(nèi)源性凝血系統(tǒng)功能[18-19]。本研究表明，板栗多糖（100、200 mg/kg）能顯著延長出血時間和凝血時間，提示其具有抗血小板和抗凝血作用。

FeCl3可使血管內(nèi)膜損傷，引起血小板黏附、聚集和釋放活化等，導(dǎo)致內(nèi)源性凝血系統(tǒng)激活，在動脈損傷的區(qū)域形成復(fù)合性血栓，與人類血栓性疾病的發(fā)病機制相似[20]，因而在國內(nèi)外研究中被廣泛使用[21-23]，本實驗選用此模型來評價板栗多糖抑制血栓形成的作用。應(yīng)用FeCl3誘導(dǎo)小鼠頸總動脈血栓模型，評價血栓變化主要有3個針對性指標：血栓形成時間（功能學(xué)評價）、血栓質(zhì)量（大體形態(tài)學(xué)評價）和血栓病理檢測（病理學(xué)評價，在干預(yù)實驗中一般不檢測）[24-25]。本研究結(jié)果顯示，板栗多糖各劑量組均能延長FeCl3誘導(dǎo)的小鼠頸總動脈血栓形成時間，表明板栗多糖具有抑制動脈血栓形成的作用。但未發(fā)現(xiàn)其對血栓質(zhì)量有顯著影響，可能與小鼠頸總動脈血栓質(zhì)量較輕，現(xiàn)有方法和設(shè)備難以觀測到組間差異有關(guān)。

由于體內(nèi)血小板活化和血管內(nèi)皮細胞損傷會引起血栓形成，導(dǎo)致管腔狹窄，致使流經(jīng)該處的血流不穩(wěn)，即血流變異性增大，已有研究表明波動血流增加血小板黏附（血小板活化表現(xiàn)之一）[26]，因而血流變異性加大是體內(nèi)血小板活化的一個重要指標[27]。本實驗中FeCl3誘導(dǎo)的動脈血栓模型小鼠血流變異性增大，表明該模型存在血小板活化。板栗多糖能降低血流變異性，進一步表明板栗多糖具有抗血小板活化的作用。由于板栗多糖對血小板計數(shù)與MPV無明顯影響，也提示板栗多糖抗血小板作用與血小板數(shù)量無關(guān)。

綜上所述，板栗多糖具有抗小鼠動脈血栓形成的作用，機制可能與其抗血小板功能有關(guān)。本實驗為臨床應(yīng)用板栗多糖防治缺血性心腦血管疾病提供了一定依據(jù)，但板栗多糖抗血小板和抗凝血的機制還需進一步研究。

[1]趙國強,高慧媛,王曉毅,等.板栗種仁化學(xué)成分的初步研究[J].中國現(xiàn)代中藥, 2006, 8(9): 14-16.

[2]李清宇,楊穎,賈琳斐,等.板栗多糖的分離純化,結(jié)構(gòu)分析及抗疲勞作用的研究[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報, 2013, 32(7): 767-772.

[3]許景秀,李尚德. FAAS法測定豫南板栗中的微量元素[J].廣東微量元素科學(xué), 2009, 16(5): 56-59.

[4]金在久,葛明.板栗的化學(xué)成分及藥理研究進展[J].山西醫(yī)藥雜志, 2005, 34(9): 751-753.

[5]梁雪.板栗不同品種(系)多糖結(jié)構(gòu)和活性的初步研究[D].秦皇島:河北科技師范學(xué)院, 2013: 1-3.

[6]楊利劍.板栗多糖的提取、成分分析及活性測定[J].武漢理工大學(xué)學(xué)報, 2010, 32(11): 14-16.

[7]李潤豐,刁華娟,彭友舜,等.板栗多糖的提取及抗氧化活性研究[J].食品研究與開發(fā), 2011, 32(8): 21-25.

[8]邵亭亭,張海暉,段玉清,等.亞臨界水萃取板栗多糖及其清除自由基活性研究[J].食品科技, 2012, 37(12): 156-160.

[9]戴成國.板栗多糖的分離純化,結(jié)構(gòu)分析及體外抗氧化研究[D].西安:陜西師范大學(xué), 2011: 41-45.

[10]何玲玲,王新,劉彬,等.板栗多糖的分離純化及抗氧化活性研究[J].食品與機械, 2010, 26(2): 72-75.

[11]SEVAG M G, MAIWEG L. The respiration mechanism of pneumococcus.Ⅲ[J]. The Journal of Experimental Medicine, 1934, 60(1): 95-105.

[12]陳和生,孫振亞,李漢東,等.羅田板栗多糖的分離純化及成分分析[J].中國藥學(xué)雜志, 2002, 37(1): 63-64.

[13]劉曉涵,陳永剛,林勵,等.蒽酮硫酸法與苯酚硫酸法測定枸杞子中多糖含量的比較[J].食品科技, 2009, 34(9): 270-272.

[14]顧云,孟娟如.介紹一種簡易的抗血栓藥物體內(nèi)篩選法[J].中國藥理學(xué)通報, 1991, 7(4): 317-318.

[15]王賢波,成浩,趙蕓,等.茶葉中EGCG對小鼠抗凝血作用實驗研究[J].茶葉科學(xué), 2011, 31(6): 532-536.

[16]楊蕾,李偉榮,宓穗卿,等.冰片對三氯化鐵誘導(dǎo)的大鼠動脈血栓形成的抑制作用及機制[J].中國實驗方劑學(xué)雜志, 2010(6): 164-166.

[17] WANG Xinkang, XU Lin. An optimized murine model of ferric chloride-induced arterial thrombosis for thrombosis research[J]. Thrombosis Research, 2005, 115(1): 95-100.

[18]朱大年.生理學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社, 2010: 62-63.

[19] GARDELL S J, SANDERSON P E J. Novel anticoagulants based on direct inhibition of thrombin and factor Xa[J]. Coronary Artery Disease, 1998, 9(2/3): 75-81.

[20]郭朝鋒.三氯化鐵動物血栓模型方法學(xué)及其應(yīng)用研究進展[J].中華實用診斷與治療雜志, 2010, 24(6): 537-539.

[21] BARR J D, CHAUHAN A K, SCHAEFFER G V, et al. Red blood cells mediate the onset of thrombosis in the ferric chloride murine model[J]. Blood, 2013, 121(18): 3733-3741.

[22] ECKLY A, HECHLER B, FREUND M, et al. Mechanisms underlying FeCl3-induced arterial thrombosis[J]. Journal of Thrombosis and Haemostasis, 2011, 9(4): 779-789.

[23] XIAN Xunde, DING Yu, ZHANG Ling, et al. Enhanced atherothrombotic formation after oxidative injury by FeCl3to the common carotid artery in severe combined hyperlipidemic mice[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2009, 385(4): 563-569.

[24] BANG J, LEE K M, KIM B Y, et al. Anti-thrombotic effects of modified using a FeCl3-induced carotid arterial thrombosis model[J]. Journal of Korean Medicine, 2013, 34(2): 51-58.

[25] WANG X, SMITH P L, HSU M Y, et al. Murine model of ferric chloride-induced vena cava thrombosis: evidence for effect of potato carboxypeptidase inhibitor[J]. Journal of Thrombosis and Haemostasis, 2006, 4(2): 403-410.

[26] ZHAO Xiaomin, WU Yaping, CAI Hongxin, et al. The influence of the pulsatility of the blood flow on the extent of platelet adhesion[J]. Thrombosis Research, 2008, 121(6): 821-825.

[27]趙曉民,秦樹存.血小板氧化應(yīng)激和動脈粥樣硬化[J].生理科學(xué)進展, 2011, 42(1): 33-38.

Antithrombotic Effect of Polysaccharide from Seeds of Castanea mollissima Blume (Chinese Chestnut)

NIE Mu1, WANG Yun2, GUO Shoudong2, LIU Hao1, JIANG Wei1, ZHAO Xiaomin2,*
(1. School of Basic Medical Sciences, Taishan Medical University, Taian 271000, China; 2. Institute of Atherosclerosis, Taishan Medical University, Taian 271000, China)

Purpose: To study the effect of polysaccharide from the seeds ofCastanea mollissimaBlume (Chinese chestnut) on arterial thrombosis in mice. Methods: The chestnut polysaccharide was extracted from the seeds ofCastanea mollissimaBlume with hot water. Mice were administered with the polysaccharide at daily doses of 50, 100 and 200 mg/kg for 10 days. The bleeding time and coagulation time of mice were measured by tail cutting method and glass slide method, respectively. The time to occlusion, blood flow of carotid artery and thrombosis weight of mice were measured in 5%ferric chloride (FeCl3)-induced carotid artery thrombosis model. The time to occlusion and carotid artery blood flow of mice were monitored by laser Doppler florimetry. Results: The administration of the water-soluble polysaccharide from Chinese chestnut at 100 and 200 mg/kg significantly prolonged bleeding time, coagulation time and the time to occlusion, and reduced blood flow variability obviously. Conclusion: The chestnut polysaccharide can inhibit arterial thrombosis, which may be related to its anti-platelet and anti-coagulation effects.

Castanea mollissimaBlume polysaccharide; bleeding time; coagulation time; antithrombosis

S646.19

1002-6630（2015）11-0187-04

10.7506/spkx1002-6630-201511036

2014-07-06

國家自然科學(xué)基金面上項目（81173061）；泰安市大學(xué)生科技創(chuàng)新行動計劃項目（2011D2046）

聶牧（1991—），女，本科，研究方向為心血管藥理學(xué)。E-mail：near0105@foxmail.com

*通信作者：趙曉民（1970—），男，教授，博士，研究方向為心血管藥理學(xué)。E-mail：zhaoxiaominty@163.com